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Immunology and Infection

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Summary

Citrobacter infección rodentium ofrece un valioso modelo para estudiar las infecciones bacterianas entéricas, así como respuestas inmunes del huésped y la colitis en ratones. Este protocolo describe la medición de la integridad de la barrera, la carga de patógenos y el daño histológico que permita la caracterización detallada de las contribuciones patógeno y del huésped a la colitis infecciosa murino.

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Bhinder, G., Sham, H. P., Chan, J. M., Morampudi, V., Jacobson, K., Vallance, B. A. The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis. J. Vis. Exp. (72), e50222, doi:10.3791/50222 (2013).

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Abstract

Este protocolo describe los pasos necesarios para producir un modelo robusto de enfermedades infecciosas y colitis, así como los métodos usados ​​para caracterizar la infección por Citrobacter rodentium en ratones. C. rodentium es un gram negativo, murino patógeno específico bacteriana que está estrechamente relacionado con la importancia clínica humana enteropatógena patógenos E. coli y E. enterohemorrágica coli. Tras la infección con C. ratones inmunocompetentes rodentium, sufren de pérdida de peso moderada y transitoria y diarrea. Histológicamente, el alargamiento de cripta intestinal, infiltración de células inmunes, y la depleción de células caliciformes se observó. Aclaramiento de la infección se logra después de 3 a 4 semanas. La medición de la integridad de la barrera epitelial intestinal, la carga bacteriana, y daño histológico en diferentes puntos temporales después de la infección, permiten la caracterización de cepas de ratón sensibles a la infección.

El mecanismo de virulencias por el cual las bacterias patógenas colonizan el tracto intestinal de los anfitriones, así como las respuestas específicas de acogida de defensa contra estas infecciones son poco conocidos. Por lo tanto el C. rodentium modelo de infección bacteriana entérica sirve como una herramienta valiosa para ayudar en la comprensión de estos procesos. Bacterias entéricas también se han vinculado a las enfermedades inflamatorias intestinales (EII). Se ha planteado la hipótesis de que las respuestas inflamatorias crónicas inadaptadas observados en los pacientes con EII se desarrollan en individuos genéticamente susceptibles tras la exposición anormal del sistema inmune de la mucosa intestinal de bacterias entéricas. Por lo tanto, el estudio de los modelos de colitis infecciosa ofrece un potencial significativo para la definición de las respuestas potencialmente patógenas de acogida a bacterias entéricas. C. rodentium colitis inducida es un modelo poco común que permite el análisis de las respuestas del huésped a las bacterias entéricas, ampliar nuestro conocimiento de los posibles mecanismos de la patogénesis de la EII;esencial en el desarrollo de nuevos tratamientos preventivos y terapéuticos.

Introduction

La infección por patógenos bacterianos entéricos desencadena gastrointestinal (GI) la inflamación, así como patología intestinal y la fisiopatología, incluyendo la diarrea y la disfunción intestinal barrera epitelial. Los mecanismos de virulencia de patógenos bacterianos que colonizan el tracto gastrointestinal de sus anfitriones, así como las respuestas específicas de acogida de defensa contra estas infecciones son poco conocidos, sin embargo, los avances recientes en la modelización de las infecciones bacterianas entéricas han comenzado a ayudar a nuestra comprensión de estos procesos. Bacterias entéricas también se han vinculado a las enfermedades inflamatorias intestinales (EII). Enfermedad de Crohn La EII (CD) y UC son enfermedades complejas de etiología desconocida, caracterizada por la inflamación crónica intestinal y daño tisular. Muchos modelos de ratón de inflamación intestinal existen, de la inflamación espontánea en cepas genéticamente modificados, tales como IL10 - / - ratones, a los desafíos químicas con compuestos, tales como sulfato de dextrano sódico (DSS) y dinitrobenzene sulfónico (DNBS) 1. Se ha hipotetizado que las inadaptadas respuestas crónicas inflamatorias presentes en los pacientes con EII se desarrollan en individuos genéticamente susceptibles tras la exposición anormal del sistema inmune de la mucosa intestinal de bacterias entéricas 2, por lo tanto, el estudio de los modelos de colitis infecciosa también ofrece un potencial significativo para definir potencialmente patógena anfitrión . respuestas a bacterias entéricas Citrobacter rodentium colitis inducida es uno de los modelos raros de colitis infecciosa que ha sido bien caracterizado 1,3, lo que permite el análisis de las respuestas del huésped a las bacterias entéricas y una mayor comprensión de los mecanismos posibles de la patogénesis de la EII; un paso esencial en el desarrollo de nuevos tratamientos preventivos y terapéuticos.

C. rodentium es una bacteria gram negativa adhesión y borrado (A / E), murino patógeno específico bacteriana que está estrechamente relacionado con el ser humano importantepatógenos enteropatógena E. coli (EPEC) y E. enterohemorrágica coli (EHEC) 3-8. La familia de patógenos A / E íntimamente adjuntar a la membrana de la célula huésped apical del epitelio cecal y colon, la formación de un no-invasivo pedestal-como la estructura de la célula huésped. Desafío oral con C. rodentium de 10 8 -10 9 organismos produce un robusto modelo de colitis infecciosa caracterizada por hiperplasia colónica o alargamiento de las criptas, la infiltración de células mononucleares inmune y el agotamiento de las células caliciformes 3,4. El sitio inicial de colonización, unas pocas horas después de la exposición, se encuentra en el parche cecal, seguida por evolución en el colon distal 2 a 3 días después de la infección 3. En cepas de ratones inmunocompetentes, el despacho del agente patógeno se logra 3 a 4 semanas después de la infección 1,3,4. Sin embargo, muchas cepas genéticamente modificados, es decir, gen deficiente o knockout (- / -) ratones, se han encontrado para mostrar increased susceptibilidad a la infección que resulta en daño exagerada y / o infección crónica y la inflamación 9-14. El uso de este modelo de colitis infecciosa en estas cepas knockout, muchos carecen de las proteínas de señalización innatas, ha sido indispensable en la revelación de varias proteínas de acogida integral a la resolución de la infección intestinal y la inflamación.

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Protocol

1. Preparación del inóculo y Citrobacter rodentium sonda oral de ratones

  1. Preparar y esterilizar en autoclave caldo Luria Bertani (LB).
  2. Obtener viable C. rodentium de una reserva de glicerol congelado y raya sobre la placa de LB agar con un asa de inoculación estéril o punta de pipeta. Incubar a 37 ° C durante la noche. Inocular 3 ml de caldo LB estéril en un tubo de cultivo Falcon con colonias de la placa de LB con un asa de inoculación o punta de la pipeta. Preparación del inóculo debe hacerse utilizando técnicas asépticas.
  3. Incubar la C. cultura rodentium aeróbicamente a 37 ° C durante la noche en un agitador de incubación de sobremesa a 200 rpm. El caldo LB inoculados deben aparecer turbia después del cultivo durante la noche.
  4. Use un bulbo con punta de aguja gástrico sonda unida a una jeringa de 1 ml a cada ratón por sonda con 100 l de la noche a la mañana C. rodentium cultura. Suavemente scruff el ratón, sujetando firmemente la piel suelta sobre su cuello y la espaldacon el pulgar y los dedos. Tire hacia atrás de la cabeza del animal con su dedo índice para inmovilizar la cabeza y estirar el esófago para la inserción de la aguja sonda.
  5. Mantener el ratón en una posición vertical y dirigir la punta de la bombilla de la sonda de aguja a lo largo del lado de la boca y sobre la lengua. Suavemente pasar la aguja a lo largo del techo de la boca y hacerlo avanzar por el esófago. Si hay alguna resistencia que durante este procedimiento, retire la aguja sonda y vuelva a insertarlo.
  6. Poco a poco se inyectan 100 l de inóculo bacteriano y retire suavemente la aguja sonda. Supervisar la tasa de respiración y comportamiento del ratón después de regresar a su jaula.

Notas:

  • En los pasos 2 y 3, también preparar un tubo de cultivo Falcon usando técnicas asépticas con 3 ml de caldo LB estéril que se cultivaron durante la noche para garantizar que no hay contaminación bacteriana del propio caldo. El caldo de LB debe ser transparente después del cultivo durante la noche.
  • Cultivo de una noche se deben desechar si se ha inoculado durante más de 24 h.
  • Todas C. infecciones rodentium y el alojamiento de los animales infectados deben llevarse a cabo en un nivel de bioseguridad 2 instalaciones.

2. Medición de la permeabilidad del colon barrera epitelial en C. rodentium ratones infectados

  1. Medir integridad de la barrera en un punto de tiempo deseado después de la infección.
  2. En el día del ensayo, preparar suficientemente 4 kDa isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano disuelto en tampón fosfato salino (PBS) a una concentración de 80 -1 mg ml a cada ratón por sonda con 150 l y para preparar la curva estándar.
  3. Scruff el ratón y la alimentación forzada con 150 l de FITC-dextrano. Retirar los alimentos de la jaula en este momento.
  4. Anestesie ratones 4 horas despuésgavage y recoger la mayor cantidad de sangre posible (~ 450 l) a través de punción cardíaca. Añadir la sangre a una concentración final de ácido-citrato dextrosa 3% en un tubo de microcentrífuga para disuadir la coagulación. Eutanasia a los ratones y recoger tejidos de colon en PBS para recuentos bacterianos (pasos de 3,1 a 3,5) y en 10% de formalina durante la fijación del tejido y, finalmente, la tinción de inmunofluorescencia (pasos desde 4,1 hasta 4,8).
  5. Girar las muestras de sangre a 1.000 xg durante 12 min en una centrífuga a 4 ° C. Se recoge el suero y se diluye a 1/10 y 1 100 / en PBS. Añadir 100 l de cada muestra en estos dos diluciones a una placa de 96 pocillos en repeticiones.
  6. Para preparar la curva estándar, se diluye la original de 80 mg ml -1 FITC-dextrano usado por sonda a los ratones en PBS a las concentraciones siguientes: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, y 0 g / ml . Añadir 100 l de cada concentración a una placa de 96 pocillos por triplicado.
  7. Cuantificar la fluorescencia de cada muestra usando un fluorómetro a una excitación wavelength de 485 nm y 535 nm de longitud de onda de emisión.
  8. Analizar los datos sin procesar mediante el trazado de la curva estándar. Introducir los datos brutos para cada muestra en la ecuación de la línea generada por la curva estándar para determinar la concentración de FITC-dextrano en cada muestra.

Notas:

  • A partir del paso 4 en adelante, mantener las muestras de sangre en el hielo y minimizar la exposición a la luz.
  • Cuando se mide la integridad de la barrera epitelial de un punto en el tiempo, o antes de los 7 días después de la infección es óptima, como el daño tisular grave se produce después de este punto. Medición de integridad de la barrera antes de que ocurra daño grave le permite determinar las diferencias en la permeabilidad máxima durante C. rodentium infección entre las cepas de ratón.
  • Asegúrese de que los ratones control no infectadas también se prueban para integridad de la barrera epitelial.

3. La medición de la carga bacteriana en tejidos de C. rodentium ratones infectados

  1. Añadir 1 ml de PBS estéril unand un metal tratada en autoclave de vidrio hasta un fondo redondo de 2 ml tubo de centrífuga mediante una técnica aséptica. Tejidos individuales de cada animal se colocó en tubos separados de PBS. Pesar los tubos antes de la adición del tejido.
  2. Retire el ciego y el colon desde el ratón. Separe el ciego del colon y eliminar el contenido luminal utilizando fórceps. Añadir el contenido de un tubo de PBS. Después de separar secciones de 0,5 cm en el colon distal y el ciego para 10% de fijación con formalina, cortar y abrir el colon y el ciego restante longitudinalmente y lavar con PBS estéril antes de colocar los tejidos en tubos.
  3. Pesar los tubos de PBS con el tejido y, a continuación homogeneizar las muestras usando un batidor de cuentas durante 6 min a 30 Hz.
  4. El uso de técnicas asépticas, añadir 180 l de PBS estéril por pocillo a una placa de 96 pocillos. Añadir 20 l de cada muestra homogeneizada para el primer pocillo en cada fila. Mezclar bien y diluir en serie, la adición de 20 l de cada pozo anterior para obtener diluciones de 10 -1 (primerll) de 10 -6. Placa de 10 l de cada dilución de cada muestra por triplicado en una placa de fondo cuadrada LB con una rejilla. Incubar durante una noche a 37 ° C.
  5. Cuente unidades formadoras de colonias (UFC), entonces el promedio de los 3 cuentas y registrar la dilución en la que se contó cada muestra. Multiplicar promedio CFU por 50, como 20 l de la muestra original de 1 ml se utilizó, y por el factor de dilución en la que se contó la muestra resultante en CFU / ml. Por último, se divide por el peso del tejido para determinar CFU / g.

4. Evaluación histológica y tinción de inmunofluorescencia de tejidos infectados Colon

  1. Recoge los tejidos como en el paso 3.2. Tienda de tejidos en formalina durante la noche, luego lavar con etanol al 70%. Insertar tejidos en parafina y se cortaron secciones de 5 micras para la tinción. Teñir con hematoxilina y eosina para la evaluación histológica y continúe con los pasos siguientes para la tinción de inmunofluorescencia.
  2. Para Desparafinar tejidos antes de la tinción, se desliza en lugaruna cubeta de Coplin y poner en baño de agua 65 ° C durante 10 min. A continuación, colocar los portaobjetos en xileno durante cuatro lavados de 2 minutos cada uno. Diapositivas entonces debe ser rehidratado con dos lavados de 5 minutos en 100% de etanol, seguido de un lavado de 5 min en cada uno de los siguientes: 95% de etanol, 75% de etanol y dH 2 0. Estos lavados se debe hacer en una campana de humos para evitar la exposición a los vapores nocivos.
  3. Colocar los portaobjetos en la jarra Coplin con pre-calentado tampón de citrato de sodio y entonces coloque en un vapor durante 30 min, a continuación, dejar reposar durante 30 min. Este proceso rompe la proteína enlaces cruzados formados por la fijación con formalina recuperación de sitios antigénicos potenciales.
  4. Lavar con PBS azida durante 5 minutos, tres veces. Portaobjetos secos y de zona de marca alrededor del tejido con un bolígrafo PAP para crear una barrera hidrófoba, manteniendo los reactivos de tinción localizados en el tejido.
  5. Bloque de tejido durante 1 hora a temperatura ambiente con tampón de bloqueo (por ejemplo, α-suero de cabra) en una cámara de humedad inmunotinción.
  6. Diluir primanticuerpo ary a la concentración deseada usando tampón de dilución de anticuerpos. Retirar el amortiguador de bloqueo y añadir 50-100 l de anticuerpo primario a los tejidos. Incubar a 4 ° C durante la noche o a temperatura ambiente durante 2 h.
  7. Lavar con PBS azida durante 5 minutos, tres veces. Añadir 50-100 l de anticuerpo secundario diluido en tampón de dilución de anticuerpo a los tejidos y se incuba a temperatura ambiente durante 1 h en la oscuridad. Lavar con dH 2 O durante 5 min, tres veces.
  8. Deshidratar diapositivas, añadir DAPI Prolongar medio Oro de montaje y colocar un cubreobjetos. Ver desliza debajo de un microscopio de fluorescencia.

Notas:

  • PBS azida puede estar sustituido con PBS recién preparado como una alternativa para evitar el crecimiento bacteriano en el medio de lavado de la etapa 4 en adelante.

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Representative Results

Durante un experimento de infección estándar, los ratones se infectaron con aproximadamente 2,5 x 10 8 UFC a través de una sonda de 100 l C durante la noche rodentium cultura. La infección de ratones C57BL / 6 con C. rodentium resultados en pérdida de peso moderada y transitoria y diarrea. Aunque sucede rara con C57BL / 6 ratones, los animales pueden enfermarse y requerir la eutanasia. Por lo tanto, los ratones deben ser monitorizados para el grado de pérdida de peso y síntomas de angustia tales como piel piloerect y postura encorvada, para determinar el grado en que diferentes cepas se ven afectadas por la infección.

Los resultados presentados en las figuras 1 a 4 son representativos de una infección hace usando un cultivo nocturno preparado a partir de un stock de glicerol congelado. A los 7 días después de la infección, los ratones fueron anestesiados y se extrajo sangre por punción cardiaca. Figura 1 muestra FITC-dextrano medido en el suerode ratones C57BL / 6, así como de tipo Toll ratones knockout del receptor 2 (TLR2), que previamente han demostrado un deterioro integridad epitelial de barrera durante la infección 9. En la presencia de una barrera epitelial intestinal intacto, 4 kDa FITC-dextrano es poco permeable a través de esta capa. Por lo tanto, mayores niveles de FITC-dextrano en suero indican una alteración de la integridad de la barrera epitelial intestinal durante la infección permitiendo que esta molécula se filtre a través. Como control, los niveles séricos en ratones no infectados gavaged con FITC-dextrano también se presentan.

Una semana después de la infección, las cargas bacterianas en el colon se han encontrado a pico alrededor de 10 9 UFC / g 3,4. La carga bacteriana se puede medir en puntos de tiempo deseado después de la infección para confirmar la infección, así como para evaluar si los ratones knockout diferentes sufren de aumento o disminución de las cargas bacterianas. Puesto que el C. rodentium es un patógeno luminal que puede íntimamente adhere a células epiteliales intestinales, las cargas bacterianas en los contenidos del lumen, cecal, y tejidos de colon se puede medir. Figura 2 muestra las cargas bacterianas típicos medidos a día 7 después de la infección tejidos cecal y colon, así como en el lumen intestinal de ratones C57BL / 6 ratones.

La mayoría de la patología observada durante C. rodentium infección en ratones C57BL / 6 se produce en los distales 2 cm de la colon11. Macroscópicamente por día 7 después de la infección, un engrosamiento de la mucosa del colon, así como un acortamiento de la longitud del colon se observó, con poco daño evidente visto en ratones C57BL / 6. Normalmente, durante la infección, los ratones C57BL / 6 sufren sólo moderada inflamación y de la patología que se caracteriza histológicamente por infiltración de células inmunes, alargamiento de cripta del colon y el agotamiento de las células caliciformes (Figura 3).

Como se ve en las secciones de H & E en la Figura 3, las respuestas de varios receptores están montados durING infección con C. rodentium. Para caracterizar mejor estos cambios, la tinción de inmunofluorescencia se pueden utilizar para examinar los cambios en las proteínas de interés, tales como los marcadores de proliferación, muerte celular, o de las respuestas inmunes innatas y adaptativas. La tinción de inmunofluorescencia es también útil para examinar los aspectos de la respuesta bacteriana, tales como su localización dentro del tejido infectado. Un ejemplo de esta técnica de tinción, el examen de una proteína huésped ki67 (rojo), un marcador para la proliferación celular y la C. rodentium proteína tir, verde, para examinar la localización bacteriana en día 12 después de la infección se presenta en la Figura 4.

Figura 1
Figura 1. Medición de suero de FITC-dextrano para evaluar la integridad de la barrera epitelial. Los ratones fuerongavage con 4 FITC-dextrano kDa en condiciones no infectadas y a los 7 días después de la infección, tras lo cual suero FITC-dextrano se determinaron los niveles. C57BL / 6 (WT) ratones muestran un aumento insignificante de FITC-dextrano niveles en suero a los 7 días después de la infección en comparación con las condiciones no infectadas. En contraste, TLR2 - / - ratones han aumentado significativamente los niveles de FTIC-dextrano en suero en comparación con el valor basal sugiriendo integridad de la barrera gravemente alterada en esta cepa durante C. infección rodentium, como ya ha sido demostrado.

Figura 2
Figura 2. C. rodentium carga en el lumen, el ciego y el colon de ratones C57BL infectado / 6 ratones a los 7 días después de la infección. Lumen, cecal, y tejidos de colon se recogieron, se homogeneiza y se colocaron en placas en serie de dilución en agar LB. Cada circle representa una única muestra obtenida de animales individuales. Las líneas continuas indican la media geométrica mientras que las barras verticales de error indican SEM.

Figura 3
Figura 3. El análisis histológico de los daños causados ​​por C. infección rodentium. Durante el día 7 post-infección moderada infiltración de células inmunes, así como el alargamiento de las criptas, el agotamiento de las células caliciformes y edema leve se observa comparación con el control del tejido infectado. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 4
Figura 4. La tinción de inmunofluorescencia en no infectados y 12 días post-infecciónción tejidos de ratones C57BL / 6. tejido del colon distal se tiñeron para la proteína de acogida ki67 (rojo) y la C. rodentium proteína tir (verde).

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Discussion

Citrobacter rodentium infección proporciona un modelo valioso para el estudio tanto de la enfermedad infecciosa y colitis en ratones. Este modelo único permite la caracterización de las dos respuestas del huésped, así como las propiedades patógenas de bacterias. Los pasos descritos en este detalle el protocolo del uso exitoso de este modelo.

Hay varios pasos críticos en este protocolo a tener en cuenta cuando se provoque colitis y el análisis de las respuestas. En primer lugar, la preparación de un nuevo C durante la noche rodentium inóculo en caldo LB que se requiere para la infección con éxito de ratones. Como una dosis de 10 8 -10 9 organismos se requiere para infectar a la mayoría de cepas de ratones, si el inóculo se deja en el agitador o en la mesa de laboratorio a temperatura ambiente durante largos períodos de tiempo, no habrá suficientes organismos viables que permanecen en la cultura para inducir la colitis después de la infección. También es importante agitar el inóculo bacteriano antescargar la jeringa para la infección, para asegurar que cada ratón recibe una dosis igual de las bacterias. Al recoger los tejidos a terminal de la infección, la inmersión completa de los tejidos de colon en un amplio volumen de formalina al 10% es necesario para la fijación del tejido adecuado que se produzca. Se sugiere que los tejidos se añade a la formalina en un vial de 5 ml, en lugar de en tubos de microcentrífuga como una relación de 10:1 de fijador de tejido es recomendado. La fijación correcta es esencial para su posterior análisis histológico, así como la tinción de inmunofluorescencia de estos tejidos. También es importante tener en cuenta que las diferentes cepas knockout tendrán diferentes respuestas a la inducción de C. rodentium colitis. Al infectar una cepa nueva, por primera vez, los ratones deben ser estrechamente monitorizados para determinar una integridad de punto final para el experimento, si es necesario. Los puntos del tiempo para el análisis de la integridad de la barrera epitelial, las cargas bacterianas, y la histología puede ser definido basado en la respuesta del ratóncepa de interés para la infección.

Como chapado de homogeneizados de tejido en placas de LB para determinar las cargas bacterianas no es un método totalmente selectivo, la realización de PCR para un C. rodentium gen específico en las colonias de bacterias se puede hacer para diferenciar C. rodentium de bacterialcolonies otros en el plato. Otra opción es homogeneizados de tejido de placas en agar MacConkey, como este medio es más selectivo para C. rodentium de agar LB. Un enfoque alternativo es utilizar un estreptomicina resistente de tipo salvaje C. instead.Substitution rodentium cepa con una cepa resistente a la estreptomicina se traducirá en la inducción de la colitis mismo modelo descrito en este protocolo. La ventaja de usar la cepa resistente a la estreptomicina es más fácil para el análisis de las cargas bacterianas, como homogeneizados de tejidos de estas infecciones se pueden sembrar en agar LB suplementado con estreptomicina en lugar de agar LB solo. Esto evita el potencial de crecimiento de commensal microbios de la placa, haciendo que el proceso de conteo de CFU más fácil y más precisa. Otra alternativa, mientras que la medición de las cargas bacterianas, es incubar las placas después de placas diluciones de homogeneizados de tejido en agar LB a 37 ° C o bien durante la noche o a temperatura ambiente durante 2-3 días, lo que resulta en un menor crecimiento bacteriano, antes del conteo.

Este protocolo describe los pasos necesarios para producir un sólido modelo de colitis infecciosa, así como los métodos utilizados para caracterizar C. rodentium infección en ratones. Aparte de usar este modelo para examinar las interacciones huésped-patógeno y la respuesta inmune, también puede ser usado para estudiar cómo una infección bacteriana puede aumentar el riesgo de cáncer de colon. Esto se puede hacer mediante la exposición de C. rodentium infectaron ratones a la azoximetano carcinógeno, o mediante el estudio de cómo los impactos de infección sobre la proliferación de células epiteliales, o en genes implicados en la diferenciación de células epiteliales o el desarrollo del tumor 15. NosotrosING el modelo de colitis infecciosa se describe en este protocolo, el número de bacterias también pueden ser evaluados en extraintestinales sitios, tales como los ganglios linfáticos mesentéricos, bazo e hígado. Los números más altos en estos órganos puede indicar que la cepa de ratón que se prueba es altamente susceptible a la infección. Utilizando la técnica de tinción de inmunofluorescencia descrito, un número casi ilimitado de mecanismos en respuesta a la infección puede ser explorado. Una vez familiarizado con las técnicas detalladas aquí, el protocolo puede ser modificado para recoger tejidos para medir otros parámetros, tales como para la extracción de ARN y la evaluación de los niveles de expresión de genes, para caracterizar más a fondo las respuestas a C. rodentium infección.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Acknowledgments

Esta labor fue apoyada por subvenciones de funcionamiento para BAV de la enfermedad de Crohn y Colitis Foundation of Canada (CCFC) y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR). GB fue financiado por una beca de postgrado de CIHR. BAV es de Niños con Trastornos intestinales y hepáticas (CHILD) Cátedra Fundación de Investigación Pediátrica EII y la Cátedra de Investigación de Canadá en Gastroenterología Pediátrica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Luria Broth ABM G247 Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using.
Square bottom plate with grid Fisher 08-757-11A
Falcon culture tube Sarstedt 62.515.006
Bulb tipped gastric gavage needle Fine Science Tools 18060-20
1 ml syringe BD Biosciences 309659
4 kDa FITC-dextran Sigma FD-4
Citric acid Sigma C7129
Sodium citrate Fisher S279-500
Dextrose Fisher D16.1
Acid citrate dextrose 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose
Black 96-well plate Fisher 07-200-762
Metal beads (5 mm) Qiagen 69989
10% formalin Fisher 5F93-4
5 ml vial DiaMed STK3205
Hematoxylin Fisher H345-23
Eosin Fisher E511-100
Xylene Fisher HC700-1GAL
Tween 20 Sigma P5927
Coplin staining jar VWR 47751-792
Sodium citrate buffer 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0
Pap pen Cedarlane Mu22
Goat serum Sigma G902-3
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP1600-100
Triton X-100 Sigma T8532
Sodium azide Sigma SZ002
Blocking buffer 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C.
Antibody dilution buffer 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA
Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20)
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen P-36931
Coverslips Fisher 12.54SE
Benchtop incubation shaker Barnstead Lab Line Max Q4000
Fluorometer Perkin Elmer Victor2D
Refrigerated centrifuge Beckman Coulter Microfuge 22R
Steamer Black Decker
Fluorescence microscope Zeiss Axio Image.Z1

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References

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