مقدمة إلى صلب غشاء المعتمدة واستنادا الكهربية

Published 5/11/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

هنا نقدم طريقة الكهربية يعتمد على الأغشية الصلبة معتمدة مع التركيز على تطبيقاتها لتوصيف نقل غشاء كهربي.

Cite this Article

Copy Citation

Bazzone, A., Costa, W. S., Braner, M., Călinescu, O., Hatahet, L., Fendler, K. Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology. J. Vis. Exp. (75), e50230, doi:10.3791/50230 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وتستند هذه الطريقة الكهربية التي نعرضها على غشاء بدعم الصلبة (SSM) تتألف من طبقة octadecanethiol chemisorbed على الذهب المطلي رقاقة الاستشعار وأحادي الطبقة فسفاتيديل على القمة. هي التي شنت هذه الجمعية في نظام كفيت يحتوي على الإلكترود المرجعي، سلك الفضة المكلورة.

بعد امتصاص شظايا غشاء أو proteoliposomes يحتوي على بروتين غشاء من الفائدة، يتم استخدام تبادل حل سريع للحث على نشاط النقل من البروتين الغشاء. في حل واحد تبادل بروتوكول حلين، وهناك حاجة واحدة غير تفعيل وتنشيط حل واحد،. يتم التحكم في تدفق بواسطة الهواء المضغوط ونظام صمام والأنابيب داخل قفص فاراداي.

يتم الحصول على حركية ونشاط النقل كهربي عبر اقتران بالسعة بين SSM وproteoliposomes أو شظايا غشاء. الأسلوب، وبالتالي، ينتج transien فقطر التيارات. يمثل الحالي ذروة نشاط النقل ثابتة. التيارات الوقت نقل تعتمد يمكن بناؤها بواسطة تحليل الدوائر.

يناسب هذا الأسلوب وخاصة بالنسبة للنقل بدائية النواة أو نقل حقيقية النواة من أغشية الخلايا، والتي لا يمكن التحقيق من قبل المشبك التصحيح أو أساليب المشبك الجهد.

Introduction

نحن هنا لشرح نهج الكهربية جديدة تقوم على غشاء الصلبة المدعومة (SSM) لتوصيف البروتينات الغشاء كهربي.

يتكون دعم قوي من طبقة رقيقة من الذهب على شريحة زجاجية، ورقاقة الاستشعار. يتم استخدام سطح ماء الذهب لربط مجموعة ثيول من كاشف alcanethiol. بعد ذلك، selfassembly من monolyer فسفاتيديل اكتمال تشكيل SSM.

لقياس ردود فعل كهربي من بروتينات الغشاء، وكثف proteoliposomes أو شظايا الغشاء إلى SSM (الشكل 1). البروتين تحتوي على غشاء وSSM ثم تشكيل نظام غشاء جانب capacitively. ولذلك، إزفاء المسؤول في البروتين تحتوي على غشاء يمكن الكشف عنها بواسطة اقتران بالسعة عن طريق SSM. هذه الطريقة تعطي فقط تيارات عابرة. يمثل الحالي ذروة نشاط النقل ثابتة. الساعة تعتمد مكعب نقلrrents يمكن بناؤها بواسطة تحليل الدوائر.

هي التي شنت على رقاقة الاستشعار في نظام كفيت (الشكل 2). كفيت لديها حجم كفيت اسطواني من 17 ميكرولتر (الحجم الصافي مع O-حلقة شنت). A دبوس الاتصال الربيع يخلق الاتصال إلى مكبر للصوت. هو مشدود موصل منفذ إلى الجزء العلوي من الجزء الرئيسي ويحمل الإلكترود المرجعي، سلك الفضة المكلورة.

هي التي شنت كفيت في قفص فاراداي. توصيله إلى مسار السائل، والذي يستخدم للحث على نشاط النقل من البروتين غشاء ردا على تبادل حل سريع (الشكل 3). في حل واحد تبادل بروتوكول حلين، يطلب من واحد غير تفعيل وتنشيط حل واحد،. يتم التحكم في تدفق بواسطة الهواء المضغوط باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة صمام على الكمبيوتر أو التبديل دليل على واجهة مربع.

Protocol

1. إنشاء جهاز للالكهربية المستندة إلى SSM

وترد التفاصيل في اثنين من المنشورات التقنية لدينا، والتي تحتوي أيضا على رسومات تخطيطية وصور cuvettes لدينا وإعداد 1، 2. وتناقش مختلف تكوينات تبادل الحلول والبروتوكولات تدفق أيضا في ورقة أسلوب لدينا 2.

في ما يلي نضيف بعض التحسينات الأخيرة والتفاصيل التقنية التي لها صلة مباشرة لعرض الفيديو.

صمام التحكم والحصول على البيانات

يحتوي على مربع واجهة تجارية USB الإخراج الرقمي / واجهة مدخلات تناظرية (NI USB 6009 الصكوك الوطنية) وبرامج تشغيل صمام. لأنها تسيطر على تدفق الحل، وهي مسؤولة عن الحصول على البيانات. هي التي تحرك الصمامات عادة مع 12 V. ومع ذلك، للتبديل السريع يمكن أن تكون مدفوعة الصمامات مع الجهد تصل إلى 18 V. وفي شريط الفيديو نستخدم 12 امدادات الطاقة الخامس. </ P>

ويمكن للسائق صمام لوحات الدارات الكهربائية تعمل أربعة صمامات. تم تصنيعها من قبل ورشة العمل من معهد ماكس بلانك للفيزياء الحيوية. يمكن التحكم صمامات عن طريق الكمبيوتر أو يدويا عبر مفاتيح في اللوحة الأمامية. وهذا الأخير هو مريحة للبيغ وتنظيف الإجراءات. أثناء القياس، مربع واجهة الكمبيوتر التي تسيطر عليها باستخدام صمام التحكم والبرمجيات الحصول على البيانات (SURFE 2 R البرمجيات، IonGate العلوم البيولوجية).

2. الاستعدادات

في هذا القسم يتم ذكر بروتوكولات مختلفة لإعداد تجربة الكهربية المستندة إلى SSM.

جعل 2.1 الحل الدهون لتشكيل SSM

  1. خلط 25 ميكرولتر Octadecylamine (5 ملغ / مل في الكلوروفورم) و 375 Diphytanoylphosphatidylcholine ميكرولتر (20 ملغ / مل في الكلوروفورم) في قارورة الزجاج.
  2. باستخدام المبخر الدوار ومستمرة النيتروجين تدفق الغاز، تتبخر كلوروفورم للحوالي 30 دقيقة.
  3. إزالة الدهون من جدران القارورة الزجاجية التي تهز مع 500 ميكرولتر من N-ديكان. تركيز الدهون النهائي هو 15 ملغ / مل مع 1:60 (W / W) octadecylamine.
  4. نقل الحل إلى القارورة تخزين الزجاج. تخزين الدهون الحل في -20 درجة مئوية.

2.2 بالكلور من القطب مرجع

الأقطاب المرجعية يجب أن تكون المعالجة بالكلور في فترات منتظمة بسبب التآكل.

  1. إزالة ما تبقى من طبقة silverchloride القديمة باستخدام ورق زجاج ناعم قبل عملية الكلورة.
  2. وضع الأسلاك الفضية جنبا إلى جنب مع القطب البلاتين إلى 1 M الهيدروكلوريك والكلور محلول حمض لمدة 15 دقيقة عند 0.5 مللي أمبير. بعد الانتهاء من المعالجة بالكلور، وسلك الفضة يتغير لونه إلى الرمادي الداكن متجانسة.

2.3 إعداد الجسر هلام بولي أكريلاميد

  1. تحضير محلول يحتوي على 100 ملي KPI في الرقم الهيدروجيني = 7، 100 ملي بوكل و 6Acrylamid٪.
  2. إضافة APS 0.3٪ (10٪ اسهم) و 0.6٪ TEMED وخلط فترة وجيزة من حل مع ماصة.
  3. مباشرة بعد خلط الحل، واستخدام ماصة لحقن 30 ميكرولتر من الخليط في وعاء فارغ جسر جل. ومن المهم تجنب فقاعات الهواء أثناء الحقن.
  4. خلال فترة حضانة من 20 دقيقة يبلمر الجل.
  5. بعد البلمرة يتم تخزين جسر جل في حل (100 ملي KPI درجة الحموضة 7، 100 ملي بوكل). لإطالة العمر الافتراضي للجسر جل يتم تخزين الحل في 4 درجات مئوية.

2.4 إعداد حلول قياس

ويرجع ذلك إلى تفاعل قوي من المواد المذابة مع SSM، يتم إنشاء التحف الكهربائية عندما يتم تبادل حلول مختلفة التركيب. لذلك، وإعداد الحلول هو خطوة حاسمة. اتخاذ الاحتياطات التالية أثناء عملية إعداد حل للحد من التحف تبادل حل.

  1. جعل غير تفعيل وتفعيل حلول من دفعة واحدة، وضبط درجة الحموضة وقوة الأيونية.
  2. ارتفاع خلفية الملح يساعد على الحد من التحف تبادل حل.
  3. تقسيم الحل دفعة في مجلدين.
  4. إضافة مركب تفعيل لتفعيل الحل. استخدام مركب التعويضية في حل غير تفعيل للحفاظ على الأسمولية والقوة الأيونية من كلا حلول مماثلة قدر الإمكان.
  5. إذا تم تخزين الحلول في 4 درجات مئوية، تأكد من أن جميع الحلول وصلت درجة حرارة الغرفة قبل البدء في القياس، لأنه حتى الفروق الصغيرة في درجة الحرارة يمكن أن تنتج القطع الأثرية.

3. A الكهربية التجربة المستندة إلى SSM

هنا نقدم بروتوكول نموذجي لإجراء تجربة الكهربية المستندة إلى SSM.

3.1 إعداد إعداد SSM

في حين أن الإعداد SSM ليس في استخدام تمتلئ أنابيب مع الايثانول 30٪حل / الماء لتجنب نمو البكتيريا.

  1. يغسل النظام مع الماء النقي لإزالة الإيثانول من الأنبوب قبل التركيب كفيت. استبدال حاويات الإيثانول مع حاويات المياه. باستخدام الضغط العالي (0،6-1،0 بار) تنظيف النظام مع 20-30 مل من الماء.
  2. كرر الإجراء التنظيف باستخدام ملي KPI العازلة 100 في درجة الحموضة 7.6 أو حل غير تفعيل.
  3. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في نظام السوائل.

3.2 تصاعد كفيت

  1. إرفاق يا الدائري إلى الإلكترود المرجعي
  2. خذ جسر جل من حلول التخزين وتوصيل الإلكترود المرجعي.
  3. ملء مسبق موصل منفذ مع العازلة غير المفعل، إدراج يا الدائري وربط جسر جل لإكمال الجمعية الإلكترود المرجعي. عناية خاصة أن عدم وجود فقاعات الهواء هي عند تقاطع الجسر هلام وتدفق حل مخرج الطريق.
  4. Preassemble الجزء الرئيسي من CUVEتتي بإضافة دبوس الاتصال الربيع (اتصال مكبر للصوت)، وأنبوب مدخل (اتصال صمام محطة)، يا الدائري (ختم لSSM) ومسامير.
  5. باستخدام الملقط، واتخاذ رقاقة الاستشعار من الحل تخزين (10 octadecanethiol ملي في الإيثانول).
  6. باستخدام ماصة، يغسل الحل المتبقية مع تقريبا. 5 مل من الإيثانول النقي.
  7. تجف القطب تحت غاز النيتروجين.
  8. وضع رقاقة الاستشعار بدقة على جزء من قاعدة كفيت بحيث مدخل تتحمل الجزء الرئيسي من كفيت توجه إلى منطقة نشطة دائرية من أجهزة الاستشعار.
  9. إضافة 1 ميكرولتر من الحل الدهون إلى المنطقة النشطة من رقاقة الاستشعار. تأكد، أن طبقة الذهب تغطيتها بالكامل من قبل الدهن.
  10. فورا بعد إضافة حل الدهون، وإغلاق كفيت بإضافة الجزء الرئيسي مجمعة سلفا.
  11. قبل التركيب كفيت في قفص فاراداي، أن تتأكد من أن جميع الأسطح جافة تماما.
  12. كونإلخ مكبر للصوت لدبوس الاتصال الربيع وأنبوب مدخل إلى صمام محطة. ثم إصلاح كفيت مع مسامير داخل قفص فاراداي.
  13. المسمار موصل منفذ إلى أعلى كفيت. ربط أخيرا أنبوب منفذ إلى منفذ موصل ومولد الجهد إلى الإلكترود المرجعي.
  14. فورا بعد تصاعد كفيت يغسل النظام مع العازلة عند 0.6 بار. وهذا يؤدي إلى تشكيل SSM عفوية.

3.3 المعلمات غشاء قياس

للتحقق من جودة SSM، يتم قياس السعة وتصرف باستخدام وظيفة المولد.

  1. باستخدام وظيفة مولد، تطبيق 100 بالسيارات DC الجهد لقياس تصرف.
  2. حساب تصرف: يظهر تسوس الحالية تقاضي مكثف الغشاء. بعد مكثف مشحونة بالكامل العوائد الحالية قياس تصرف غشاء باستخدام قانون أوم. من أجل بساطة نستخدم مكعبrrent 1 ثانية بعد الجهد هو تطبيق لحساب تصرف G = I / U.
  3. تطبيق الجهد AC الثلاثي من 50 الذروة بالسيارات إلى الذروة السعة والتردد من 0.5 هرتز لقياس السعة.
  4. حساب السعة: السعة من مربع الناتج موجة الحالية تمثل تيارات شحن للمكثف. السعة C يساوي تهمة نقل س = IΔt مقسوما ΔU = 100 بالسيارات. (ΔU هو ضعف الجهد المطبق من 50 بالسيارات لأنني هو الفرق ميل إيجابي ناقص السلبية الحالية من الجهد الثلاثي.)
  5. رصد المعلمات الكهربائية للغشاء مرارا كل 10 دقيقة لمدة تقريبا. 30-40 دقيقة، حتى يتم التوصل إلى قيم ثابتة. يغسل مع العازلة بين KPI في ارتفاع الضغط في حدود حوالي 0،6-1 بار.
  6. تقدير نوعية SSM: المعلمات الأمثل في نطاق 0،1-0،2 NS و 2-3،5 طراز NF. A تصرف عاليا السعة 0.8 NS والمنخفضة أقل من 1 طراز NF يشيرأن SSM غير مشكلة بشكل صحيح. A السعة العالية فوق 4 طراز NF قد يعني أن منطقة نشطة لم تتم تغطيتها بشكل كامل من قبل SSM.
  7. إذا كانت المعلمات ليست في نطاق الأمثل، يجب التخلص من الغشاء وأعدت SSM آخر، وذلك باستخدام رقاقة القطب الطازجة.

3.4 تدقيق لتبادل التحف الحل

بعد وقد تم فحص المعلمات غشاء، ينبغي اختبار المخازن المؤقتة لقياس القطع الأثرية تبادل حل.

  1. إدراج حاويات حل منها إلى نظام السوائل.
  2. إزالة فقاعات الهواء من نظام السوائل، وذلك باستخدام الصمامات اليدوية.
  3. باستخدام برنامج الحصول على البيانات اختار بروتوكول تدفق تريد استخدامها في تجربتك.
  4. ضبط الضغط إلى 0.6 بار والبدء في القياس.
  5. وبصرف النظر عن تبديل صمام الميكانيكية التحف، يجب أن تقاس من الناحية المثالية لا التيارات قطعة أثرية أو أنها ينبغي أن تكون الكثير SMAروزينمولر من الإشارات نقل البروتين المتوقع. إذا لوحظ التحف تبادل حل، في محاولة لتحسين التراكيب العازلة و / أو الإجراء إعداد قبل مواصلة التجربة.

3.5 إضافة العينة البروتين

عادة يتم تخزين proteoliposomes أو شظايا غشاء المجمدة في -80 درجة مئوية. لقياس واحد هو مطلوب قسامة من حوالي 30 ميكرولتر.

  1. شطف SSM مع حل غير تفعيل.
  2. ذوبان الجليد العينة البروتين على الجليد.
  3. وتناوبت ثلاث دورات صوتنة 10 ثانية مع فترات التبريد 10 ثانية على الجليد. يتم sonicated Proteoliposomes باستخدام sonicator حمام. لشظايا غشاء يستخدم sonicator غيض (50W، 30 كيلو هرتز، 1 مم sonotrode، وكثافة 20٪، دورة 0.5). بعد خطوة صوتنة مشاركة لا تضع عينة مرة أخرى على الجليد، ولكن حقنه مباشرة في كفيت.
  4. فك منفذ موصل مع إشارة القطب ASSEmbly.
  5. باستخدام ماصة، نضح 30 ميكرولتر من العينة البروتين وتركيب طرف ماصة للمخرج حمل.
  6. فتح صمام دليل في مسار غير المفعل إلى حاوية النفايات وحقن proteoliposomes في حجم كفيت. يجب الحرص على عدم ضخ الهواء إلى حجم كفيت مع أجهزة الاستشعار.
  7. قبل إزالة غيض ماصة، وإغلاق صمام دليل لمنع مزيد من تدفق الحل.
  8. السماح للproteoliposomes بأن يمتص إلى SSM لفترة الحضانة من 1-2 ساعة. ومن الممكن أيضا لاحتضان بين عشية وضحاها.

3.6 الإجراء العام من تجربة المستندة إلى SSM

  1. الاحماء المخازن المؤقتة قياس في الوقت المناسب، إذا تخزينها في 4 درجة مئوية. جميع مخازن قياس يجب أن تكون في درجة حرارة الغرفة قبل بدء القياس لتجنب القطع الأثرية.
  2. عند تغيير الحلول، أولا تنظيف أنابيب داخل حاويات حل بمنديل غير التضبيب، ثم إدراج زجاجات جديدة.
  3. قبل البدء في القياس، استخدام الصمامات اليدوية لإزالة فقاعات الهواء، والتي يمكن أن تطورت من إجراء تغيير.
  4. ضبط الضغط فقط قبل البدء في القياس. نحن عادة استخدام ضغط 0.6 بار الذي في صمام محددة لدينا وأنبوب التكوين تعطي معدل تدفق ما يقرب من 1.0 مل / ثانية.
  5. ويمكن إجراء القياسات القليلة الأولى خارج مستقيم واحد بعد آخر، وينبغي رفض حتى يبقى ذروة تيار مستمر. إذا الحلول تختلف في درجة الحموضة هناك حاجة إلى فترة حضانة من 3 دقائق على الأقل لضبط درجة الحموضة الداخلية للproteoliposomes قبل البدء في القياس.
  6. الآن مجموعة تصل مستعدة للقياس. للحد من الضوضاء وينبغي بذل لا يقل عن 3 قياسات وبلغ متوسط.

3.7 قياسات التحكم

A المتهدمة إشارة خلال سلسلة من القياسات يمكن أن تحدث نتيجة لتدهور البروتين أو فقدان الامتزاز. ينبغي لكل تجربة SSM أنا NCLUDE عنصر تحكم المتهدمة. يتم ذلك عن طريق القياسات المتكررة مع حلول متطابقة. السيطرة المتهدمة الحد الأدنى يعني قياس واحد في بداية واحدة في نهاية التجربة، وذلك باستخدام نفس الحل.

نحن ننصح به لمراقبة المتهدمة في ظل ظروف حيث تتوقع أعلى السعة الذروة في التجربة. هذا يجعل من الأسهل لقياس المتهدمة للإشارة.

المتهدمة إشارة يمكن قياسها كميا بواسطة مقارنة بين سعة ذروة الضوابط المتهدمة اثنين. قيمة النسبة المئوية الناتجة يمكن استخدامها لتصحيح الإشارات المقاسة من خلال افتراض الاعتماد الزمن الخطي للالمتهدمة.

3.8 الضوابط قطعة أثرية

إذا كان ذلك ممكنا في محاولة للتحقق من صحة نتائجك عن طريق تثبيط هذا البروتين من الفائدة بعد التجربة. إشارات المتبقية هي على الأرجح التحف تبادل حل. إشارات لديهم ثم لابد من تصحيح للالتحف المقاسة.

معشوقة = "jove_step"> 3.9 بعد التجربة

  1. يغسل النظام مع 20-30 مل من الماء النقي و 20-30 مل من 30٪ من الإيثانول / المياه. الحل الايثانول يتجنب نمو البكتيريا عندما يكون النظام لا تكون قيد الاستعمال.
  2. بعد هذا الإجراء تنظيف، الافراج عن الضغط من النظام وإيقاف جميع الصكوك.
  3. إزالة كفيت من قفص فاراداي وترجل ذلك. يمكن تنظيفها جميع أنحاء كفيت مع الماء والإيثانول النقي، إذا لزم الأمر، باستخدام sonicator حمام.
  4. وضع رقاقة الاستشعار في كوب غلاس مع الإيثانول النقي. يصوتن الكأس لمدة 1-2 دقيقة باستخدام sonicator حمام.
  5. تجفيف رقاقة الاستشعار تحت غاز النيتروجين.
  6. تخزين رقاقة الاستشعار بعيدا عن الضوء في 10 ملي Octadecanthiol حل الايثانول. بعد فترة حضانة حوالي 30 دقيقة على رقاقة الاستشعار مستعدة لإعادة استخدامها.

Representative Results

حتى الآن، تم استخدام الكهربية المستندة إلى SSM لتوصيف أكثر من 20 الناقلون، معظمهم من أصول بدائية النواة، على سبيل المثال ميلب NhaA 4 و 5 PutP (تلخيصها في 6). ولكن أيضا نقل حقيقية النواة من أغشية الخلايا، على سبيل المثال ClC7 7 وكذلك القنوات الأيونية، على سبيل المثال تم التحقيق مستقبلات أستيل النيكوتينيك 8.

هنا نقدم كمثال على قياسات السكر / H + cotransporter لاسي من الإشريكية القولونية باستخدام proteoliposomes مع الجانب الأيمن لا يقل عن 85٪ من التوجه لاسي في LPR من 5 9، 10. ونحن نركز على الخطوات الرئيسية المؤدية إلى الحد الأدنى من نموذج الحركية من هذا البروتين النقل.

1. توصيف الكهربية من لاسي wildtype

الخطوة الأولى هي توصيف العام للرد فعل كهربي عن طريق قياس قيم درجة الحموضة مختلفة ( > الشكل 4)، وتركيزات الركيزة (الشكل 5) وركائز. للتحقق من صحة هذه التقنية، واستنسخت K M والقيم PK بالنظر في الأدب.

اعتماد الرقم الهيدروجيني للاسي يظهر اثنين من ردود الفعل كهربي مختلفة. الزيادات الحالية إلى جانب capacitively بين درجة الحموضة ودرجة الحموضة 8.5 5، ولكن أيضا إلى تغيير شكله. تحت ظروف قلوية ويلاحظ نقل حالة مستقرة، في حين أن الرقم الهيدروجيني الحمضية القيم فقط يبقى رد فعل كهربي السريع. لتمييز الإشارات حالة مستقرة من ردود فعل كهربي سريع استخدمنا تحليل الدوائر لإعادة بناء التيارات نقل (الشكل 6).

في درجة الحموضة 7 يصبح إشارة الطور ثنائي الطور. هذا يشير ايضا الى ان هناك نوعان من ردود الفعل كهربي مختلفة. يقدر من تهمة نقل (يتجزأ من الإشارات)، وردود الفعل لهما حوالي 6٪ و 94٪ من electrogenicity الإجمالية للدورة النقل.

ove_step "> 2. التنازل عن ردود فعل كهربي

لتعيين اثنين من ردود فعل كهربي إلى خطوات معينة في دورة رد فعل من لاسي، تم قياس متغير لاسي E325A (الشكل 7). هذا البديل لا يظهر الا تبادل اللاكتوز ولكن منقوصة لجميع وسائل النقل النشط، وذلك بسبب تثبيط إطلاق بروتون. إشارة من E325A اسي يمثل عابر سريع وثابت لجميع قيم الرقم الهيدروجيني قياس. الشكل والسعة للإشارة مشابه لإشارة من wildtype لاسي في ظل الظروف الحمضية. وبالإضافة إلى ذلك نلاحظ مرحلة سلبية صغيرة بعد انخفاض الذروة الحالية، والذي هو سمة لتيارات عابرة السريع في نظم قياس جانب capacitively. لأن اللاكتوز ملزمة والإفراج ليس كهربي، وسريع عابر يجب ربط مع الانتقال بتكوين جزئي كهربي بعد اللاكتوز ملزمة.

ومن المعروف أن الخطوة الافراج بروتون هو معدل limitiنانوغرام للدوران لاسي في الانحدار وضع اللاكتوز تركيز النقل مدفوعة. في هذه الحالة نحن نتوقع زيادة في معدل النقل مع درجة الحموضة القلوية، لأنه يفضل إطلاق بروتون. هذا هو الحال بالنسبة لنقل حالة مستقرة ترتبط إشارة من wildtype المزركشة. وعلاوة على ذلك يمكن أن تظهر من قبل قياس درجة الحموضة التدرج الا ان درجة الحموضة الداخلية يؤثر على نقل حالة مستقرة من لاسي (غير منشورة). ولذلك يمكن تعيين رد فعل كهربي كبير إلى الخطوة الافراج البروتون.

3. قياسات لتحليل الحركية

بعد التعرف على ردود فعل كهربي داخل وخارج أسعار النقل تم تحديد باستخدام الإعداد SSM مع قرار الأوان من حوالي 4.5 ميللي ثانية. هذا ممكن فقط في ظل ظروف، عندما يهيمن رد فعل واحد إشارة. في هذه الحالة يمكن أن تستمد الثوابت معدل من التيارات عابرة تحت النظر في القرار وقت من الإشارات باستخدام تكرارية المربعات الصغرى دي خوارزمية الإلتواء (الشكل 8). الثوابت معدل العزم وكذلك الحد الأدنى من نموذج الحركية المقترح (الشكل 9) واستخدمت أخيرا لمحاكاة حركية نقل. منحنيات محاكاة إنتاج البيانات SSM وهو ما يثبت بالإضافة إلى ذلك النموذج الحركية.

الشكل 1
الشكل 1. الامتزاز هندسة proteoliposomes على SSM. ويتكون SSM على رقاقة الاستشعار، والذهب منظم المغلفة شريحة زجاجية. لقياس ردود فعل كهربي من بروتينات الغشاء، وكثف proteoliposomes أو شظايا الغشاء إلى SSM. الأغشية اثنين من تشكيل نظام يقترن capacitively. هذا هو السبب في الكشف عن تيارات عابرة فقط.

tp_upload/50230/50230fig2highres.jpg "/>
الشكل 2. وSSM كفيت يحمل رقاقة الاستشعار والإلكترود المرجعي. محصورة رقاقة الاستشعار بين قاعدة كفيت ورئيس كفيت. يتم عزل القطب المرجع من مسار تدفق بواسطة مادة هلامية جسر الملح بولكرلميد.

الشكل (3)
الشكل (3). المسار السوائل والدائرة الكهربائية من إعداد SSM. في البروتوكول تبادل حل واحد ومطلوب واحد فقط غير المفعل (NA) وتفعيل واحد (A) حل. يتم التحكم في تدفق من قبل اثنين من الصمامات 2 في اتجاه (V1) وصمام محطة واحدة (V2). رموز تبديل صمام محطة بين الحلول غير تفعيل وتنشيط وتوجيه واحدة من الحلول لكفيت والحل الآخر إلى حاوية النفايات (W). يتم توصيل رقاقة الاستشعار (SSM) إلى مكبر للصوت (I / U)، في حين يتم توصيل القطب المرجعي (أجكل) إلى وظيفة مولد (F) في الدائرة الكهربائية الخارجية. ويستخدم جهاز الكمبيوتر (PC) ومربع واجهة للتشغيل صمام والحصول على البيانات.

الشكل 4
الشكل 4. تيارات عابرة يقاس مع proteoliposomes لاسي من النوع البري بعد 100 ملي اللاكتوز يقفز تركيز على قيم درجة الحموضة مختلفة. الحل غير تفعيل الواردة الجلوكوز 100 ملم بينما يحتوي الحل تفعيل 100 ملي اللاكتوز. تم إعداد جميع الحلول في 100 ملي العازلة الفوسفات البوتاسيوم في درجة الحموضة المشار إليه مع 1 ملي DTT. للحصول على تفاصيل من شروط القياس في هذا والأرقام التالية يرجى الرجوع إلى 9 و 10.

ftp_upload/50230/50230fig5highres.jpg "/>
الشكل 5. بلغ متوسط ​​التيارات الذروة تطبيع قياس مع proteoliposomes لاسي من النوع البري بعد يقفز تركيز اللاكتوز بتركيزات مختلفة وقيم درجة الحموضة. ويتم الحصول على القيم K M من نوبات القطعي.

الشكل (6)
الشكل (6). إعادة الإعمار من التيارات نقل. التيارات عابر (A) استخدامها لإعادة بناء التيارات نقل (B) تم قياس مع proteoliposomes لاسي من النوع البري بعد 100 ملي اللاكتوز يقفز تركيز في درجة الحموضة 8.5 (تتبع الأزرق) ودرجة الحموضة 5.2 (التتبع الحمراء). في الرقم الهيدروجيني لوحظ 8.5 دوران مستمر بينما عند pH 5.2 حدوث رد فعل كهربي سريع. ويلاحظ هذا بشكل واضح في التيار أعيد بناؤها (B).

files/ftp_upload/50230/50230fig7.jpg "بديل =" الشكل 7 "FO: محتوى العرض =" 4IN "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50230/50230fig7highres.jpg "/>
الرقم 7. الحالية عابرة يقاس مع E325A proteoliposomes لاسي بعد ملي اللاكتوز الانتقال تركيز 100 في درجة الحموضة 5.2. هذا البديل لاسي هو تحول دون في خطوة الافراج بروتون من دورة النقل وبالتالي النقل التي تعاني من نقص. المكون السلبية الصغيرة احظ هو سمة للتيارات عابرة السريع في نظم قياس جانب capacitively ويسببه تصريف السعة غشاء بعد رد فعل كهربي سريع. يتم تحديد وقت لها π0 مستمرة من جانب السعة والمواصلة للنظام (الشكل 1).

الرقم 8
الرقم 8. تيارات عابرة يقاس مع proteoliposomes لاسي من النوع البري بعد عملية الشراءويلاحظ R مختلفة يقفز تركيز اللاكتوز في درجة الحموضة 5.2. في ظل هذه الظروف لا نقل حالة مستقرة، ولكن انتقال متعلق بتكوين كهربي على اللاكتوز ملزمة. يظهر خط متقطع وظيفة النقل التي تمثل القرار وقت للنظام. وأقحم يظهر عزم وإيقاف ثوابت معدل من الملاحظ kobs ثابت معدل مع نوبة القطعي للبيانات. تم تحديد ثابت المعدل المرصود من التيارات عابرة مع تكرارية المربعات الصغرى deconvolution خوارزمية 10.

الرقم 9
الشكل 9. يمكن التعرف على نموذج الحركية للدورة رد فعل من لاسي. خطوتين كهربي وتتميز القياسات SSM. رد فعل كهربي بقوة يمثلون ~ 94٪ من إجمالي النزوح تهمة في رد فعللوحظ دورة إلا عند قيم الرقم الهيدروجيني محايدة والقاعدية. يمكن أن تسند إلى خطوة الإفراج البروتون (السهم الأزرق). ويلاحظ وجود خطوة كهربي ضعيف في درجة الحموضة الحمضية عندما يتم تحول دون دوران مستمر من النوع البري لاسي. نحن تعيين هذا رد فعل على عملية انتقال بتكوين جزئي كهربي على اللاكتوز ملزم، وهو ما يمثل 6٪ من إجمالي النزوح تهمة في دورة التفاعل.

Discussion

1. مزايا الكهربية المستندة إلى SSM بالمقارنة مع الطرق التقليدية

وقد ثبت الكهربية المستندة إلى SSM نفسها كأداة قيمة من مربع الأدوات الكهربية. انها مفيدة بشكل خاص في الحالات التي لا يمكن فيها تطبيق اتفاقية الكهربية، وهي المشبك التصحيح وطرق المشبك الجهد، و: وبصرف النظر عن بعض الاستثناءات النادرة نقل البكتيرية لا يمكن التحقيق باستخدام المشبك الجهد أو أساليب المشبك التصحيح بسبب صغر حجم البكتيريا، ولأن أنها صعبة للتعبير في خلايا الثدييات أو البويضات. ولكن أيضا من الناحية الفسيولوجية نقل الثدييات ذات الصلة يمكن التحقيق. في هذه الحالة الكهربية المستندة إلى SSM جذابة للنقل من أغشية الخلايا وللتطبيقات الفحص في اكتشاف المخدرات بسبب متانة وقدرته على التشغيل الآلي.

SSM-basedUsing التقليدية الكهربية، والوقت توصيف حل من TRANSPorters يمثل تحديا. منذ دوران ناقلات منخفضة A 'التصحيح العملاقة' أو مطلوب التكوين 'خلية كاملة "، والتي يكون لها القرار وقت منخفضة بطبيعتها في تجربة تبادل الحلول. ويمكن التغلب على المضاعفات باستخدام الإفراج الركيزة التحلل الضوئي. ومع ذلك، هي مناسبة فقط لعدد محدود من ركائز لهذا النهج. هنا تبادل حل سريع في SSM يوفر فرصة فريدة لإجراء دراسات الكهربية مع قرار الأوان باستخدام ركائز التعسفي.

2. القيود والخطوات الحاسمة

وعلى النقيض من المشبك التصحيح وتقنيات المشبك الجهد، لا يمكن الكهربية المستندة إلى SSM استخدامها لتطبيق المحتملة. ولذلك يقتصر توصيف نقل لنقل وسائط التي لا تعتمد على غشاء المحتملة.

بشكل عام، الكهربية المستندة إلى SSM لا يوجد لديه قيود تتعلق بنوع الناقل (كهربي). ولكن CL الجهديمكن أن أساليب المشبك أمبير أو التصحيح لديها مزايا، إذا كانت هناك حاجة مكونات داخل الخلايا مثل البروتينات ملزمة حصول على وظائف البروتين.

يمكن أن تنشأ القيود، إذا تبادل حل يخلق تيارات قطعة أثرية كبيرة. يحدث هذا عندما يتفاعل بقوة مع الركيزة SSM مثل في حالة مركبات محبة للدهون. ضوابط قطعة أثرية يمكن استخدامها لتصحيح الإشارات المقاسة. خلفية عالية من الملح علاوة على ذلك في جميع مخازن قياس يمكن استخدامها للحد من القطع الأثرية. ولكن في حالات، حيث حجم قطعة أثرية مشابه لإشارة البروتين، فإنه يكاد يكون من المستحيل عزل إشارة ذات صلة البروتين من القطع الأثرية. لحسن الحظ، والتحف عالية غير عادية في تبادل حل الأمثل.

هناك بعض الخطوات التي تعتبر بالغة الأهمية لتحقيق النجاح في تجربة الكهربية المستندة إلى SSM. إعداد نموذج البروتين هو الجزء الأكثر أهمية. إذا تم استخدام proteoliposomes، تأكد من أن reconsعملية titution غلة نظيفة، عينة استنساخه من LPR كافية ونقل هو المنحى في الطريق الصحيح. وLPR يمكن فحصها من قبل تجميد كسر المجهر الإلكتروني والتوجه تجربة ELISA إذا كانت الأجسام المضادة المتاحة.

لا تستخدم سوى SSM مما يدل على المعلمات الأمثل لاحتضان العينة البروتين. حقن هذا البروتين هو خطوة حاسمة أخرى. صوتنة ضروري وينبغي تجنب فقاعات الهواء أثناء الحقن. بعد مرور فترة الحضانة عينة القياسات نفسها هي الحاسمة، لأن فقاعات الهواء سيزيل عينة بروتين كثف من رقاقة الاستشعار. لذلك دائما إزالة فقاعات الهواء بعد تغيير الحلول. ومع ذلك يمكن أن يحدث المتهدمة إشارة. لتصحيح ممكن المتهدمة إشارة، فإنه من الضروري لإنجاز الضوابط المتهدمة أثناء التجربة.

3. الأنظمة المتخصصة

يمكن تعديل الإعداد SSM وفقا لتطبيقه. وعلاوة على ذلك رهنا مختلفة تماما الاجهزة درجة عالية من التخصص المتاحة،.

هناك إمكانية لقياس إشارات البروتين في ظل ظروف غير متكافئة، على سبيل المثال في إطار التدرج درجة الحموضة. لإنشاء التراكيب العازلة غير المتكافئة داخل وخارج proteoliposomes حل ثالثا، الحل يستريح، لابد من عرضه وهذا يتطلب تكوين Exchange مزدوجة. هنا لا بد من وضع صمام ثلاثي إضافية التبديل بين حلول غير تفعيل ويستريح.

لزيادة دقة الوقت للنظام وضعنا مسارا تدفق البديلة تفتقر إلى صمام محطة، ولكن باستخدام نوع مختلف من كفيت. هنا يقع على تقاطع تفعيل وحل غير تفعيل داخل كفيت، 3 ملم أمام SSM. هذا الإعداد هو مناسبة تماما لتحليل الحركية من عمليات النقل السريعة. ويمكن أن يتبين من ذلك أن القرار وقت منخفضة تصل إلى 2 ميللي ثانية هو ممكن.

و التجاريةمع ully تتوفر النظم الآلية تهدف إلى إنتاجية أعلى بكثير لفحص المخدرات. وحدة منقولة بجمع الحلول ويحقن لهم على سطح جهاز الاستشعار في لوحات 96 بئر في شكل وحة microtiter القياسية.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر J. جارسيا لسيلما، أنا سميرنوفا وR. Kaback من أجل التبرع لقياسات المزركشة وE. بامبرج للحصول على الدعم ومناقشات مفيدة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Waterbath Sonicator Bandelin RK 52 H
Tip Sonicator Hielscher Ultrasonics GmbH UP50H
2-way valve NResearch, West Caldwell, USA NR225T011
Terminal valve NResearch, West Caldwell, USA NR225T031
Manometer Greisinger electronics GDH 14 AN
Faraday cage Max Planck Institute of Biophysics
Cuvette Max Planck Institute of Biophysics
100 ml solution containers Kartell 1623
O-rings Seal Science Inc.
Oscilloscope Tektronix TDS 1002
Reference electrode Max Planck Institute of Biophysics
Function generator Max Planck Institute of Biophysics
Tubings SAINT-GOBAIN Performance Plastics AAC00006
Sensor chip Fraunhofer Institut für Schicht und Oberflächentechnik
Interface box Max Planck Institute of Biophysics
Amplifier Keithley 427
Manual cog Vygon GmbH 876
USB analog-to-digital converter National Instruments 6009
Regeants
1,2‑Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids, Inc. 850356
Acrylamide/Bis-acrylamide Sigma Aldrich A3574
Ammonium persulfate Sigma Aldrich A3678
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich G8270
Dithiothreitol Sigma Aldrich 43819
Ethanol absolut VWR AnalaR NORMAPUR 603-002-00-5
Natural E. coli lipids polar extract Avanti Polar Lipids, Inc. 100600 for LacY reconstitution
n-Decane Sigma Aldrich D901
Octadecanethiol Sigma Aldrich O1858
Octadecylamine Sigma Aldrich 74750
Potassium chloride Merck 1049360500
Potassium phosphate dibasic Sigma Aldrich P3786
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P9791
Tetramethylethylenediamine BIO RAD 1610801
α-Lactose monohydrate Sigma Aldrich L8783

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seifert, K., Fendler, K., Bamberg, E. Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes. Biophys. J. 64, 384-391 (1993).
  2. Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. SSM-based electrophysiology. Methods. 46, 97-103 (2008).
  3. Garcia-Celma, J. J., et al. Rapid activation of the melibiose permease MelB immobilized on a solid-supported membrane. Langmuir. 24, 8119-8126 (2008).
  4. Mager, T., Rimon, A., Padan, E., Fendler, K. Transport mechanism and pH regulation of the Na+/H+ antiporter NhaA from Escherichia coli: an electrophysiological study. J. Biol. Chem. 286, 23570-23581 (2011).
  5. Zhou, A., et al. Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E.coli. J. Mol. Biol. 343, 931-942 (2004).
  6. Ganea, C., Fendler, K. Bacterial transporters: charge translocation and mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 1787, 706-713 (2009).
  7. Schulz, P., Werner, J., Stauber, T., Henriksen, K., Fendler, K. The G215R mutation in the Cl-/H+-antiporter ClC-7 found in ADO II osteopetrosis does not abolish function but causes a severe trafficking defect. PLoS ONE. 5, e12585 (2010).
  8. Schulz, P., Dueck, B., Mourot, A., Hatahet, L., Fendler, K. Measuring ion channels on solid supported membranes. Biophys. J. 97, 388-396 (2009).
  9. Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. Electrophysiological characterization of LacY. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 7373-7378 (2009).
  10. Garcia-Celma, J. J., Ploch, J., Smirnova, I., Kaback, H. R., Fendler, K. Delineating electrogenic reactions during lactose/H+ symport. Biochemistry. 49, 6115-6121 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats