Introduksjon til Solid Støttet Membran Basert Electrophysiology

Published 5/11/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

Her presenterer vi en elektrofysiologisk metode basert på solid støttet membraner med fokus på sine søknader om karakterisering av electrogenic membran transportører.

Cite this Article

Copy Citation

Bazzone, A., Costa, W. S., Braner, M., Călinescu, O., Hatahet, L., Fendler, K. Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology. J. Vis. Exp. (75), e50230, doi:10.3791/50230 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den elektrofysiologisk metoden vi presenterer er basert på et solid støttet membran (SSM) består av en octadecanethiol lag chemisorbed på en gull belagt sensor chip og en fosfatidylkolin monolag på toppen. Denne sammenstillingen er montert i en kyvette inneholdende referanseelektroden, et klorert sølvtråd.

Etter adsorpsjon av membran fragmenter eller proteoliposomes inneholdende den membran protein av interesse, er en rask utveksling løsning som brukes for å indusere transport aktivitet av membranproteinet. I de enkle løsningen utveksling protokoll to løsninger, er en non-aktivering og en aktiviserende løsning, trengte. Strømningen styres av trykkluft og en ventil-og rør-system innenfor et Faraday-bur.

Kinetikken av den electrogenic transport aktivitet oppnås via kapasitiv kopling mellom SSM og proteoliposomes-eller membran-fragmenter. Metoden er derfor gir bare transient strømninger. Toppspenningen representerer den stasjonære transport aktivitet. De tidsavhengige transporter strømninger kan rekonstrueres ved krets analyse.

Denne metoden er spesielt egnet for prokaryotiske eller eukaryotiske transportører transportører fra intracellulære membraner, som ikke kan bli undersøkt av patch clamp eller voltage-clamp-metoder.

Introduction

Her kan vi demonstrere en ny elektrofysiologisk tilnærming basert på et solid støttet membran (SSM) for karakterisering av electrogenic membran proteiner.

Den faste bærer består av et tynt lag gull på en glass-slide, sensorbrikken. Den hydrofile gull overflaten blir brukt til å binde den tiol-gruppe med en alcanethiol reagens. Etterpå fullfører selfassembly av en fosfatidylkolin monolyer dannelsen av SSM.

For å måle electrogenic reaksjoner av membranproteiner, blir proteoliposomes-eller membran-fragmenter adsorberes til SSM (figur 1). Proteinet inneholdende membranen og SSM deretter danne et kapasitivt koblet membransystem. Derfor kan lade translokasjon ved at proteinet inneholdende membran påvises ved kapasitiv kobling via SSM. Denne metoden gir bare forbigående strømninger. Toppspenningen representerer den stasjonære transport aktivitet. Den tidsavhengige transporter currents kan rekonstrueres ved krets analyse.

I sensorbrikken er montert i en kyvette system (figur 2). Kyvetten har en sylindrisk cuvette volum på 17 mL (netto volum med o-ring montert). En fjær kontaktstiften oppretter kontakten til forsterkeren. Et utløp kontakten er skrudd fast til toppen av hoveddelen og bærer referanse elektrode, en klorert sølvtråd.

Kyvetten er montert i et Faraday-bur. Den er koblet til en fluidledning, som brukes for å indusere transport aktiviteten til membranproteinet som reaksjon på en hurtig løsning utveksling (figur 3). I de enkle løsningen utveksling protokoll to løsninger, er en non-aktivering og en aktiviserende løsning, nødvendig. Flyten styres av trykkluft med en ventil kontroll programvare på en datamaskin eller manuelle brytere på et grensesnitt boksen.

Protocol

En. Sette opp et apparat for SSM-baserte Electrophysiology

Detaljer er gitt i to av våre tekniske publikasjoner, som også inneholder skjematiske tegninger og fotografier av våre kyvetter og sette opp en, to. Ulike løsning utveksle konfigurasjoner og flyt protokoller er også omtalt i vår metode papir to.

I det følgende legger vi til noen nylige forbedringer og tekniske detaljer som er av direkte relevans for videopresentasjon.

Valve kontroll og datainnsamling

Grensesnittet boksen inneholder en kommersiell USB digital utgang / analog inngang grensesnitt (NI USB 6009 National Instruments) og ventilen drivere. Den styrer løsningen flyt og er ansvarlig for datainnsamling. Ventilene er normalt drevet med 12 V. Men for rask veksling ventilene kan kjøres med en spenning på opp til 18 V. I videoen bruker vi en 12 V strømforsyning. </ P>

Ventilen driver kretskortet kan operere fire ventiler. Den ble produsert av verkstedet av Max Planck Institute of biofysikk. Ventiler kan bli kontrollert av datamaskin eller manuelt via brytere på frontpanelet. Sistnevnte er praktisk for spyling-og renhold-prosedyrer. Under måling, er grensesnittet boksen datastyrt ved hjelp av en ventil kontroll og datainnsamling programvare (Surfe 2 R programvare, IonGate biovitenskap).

2. Forberedelser

I denne delen de ulike protokoller for utarbeidelse av en SSM-baserte elektrofysiologi eksperimentet er nevnt.

2.1 bakerste lipidoppløsningen for dannelsen av SSM

  1. Bland 25 ul Octadecylamine (5 mg / ml i kloroform) og 375 pl Diphytanoylphosphatidylcholine (20 mg / ml i kloroform) i et glas hetteglass.
  2. Ved hjelp av en roterende inndamper og kontinuerlig nitrogengasstrøm, fordampe kloroformen forca 30 min.
  3. Fjern lipid fra veggene i glassampullen ved risting med 500 mL av n-dekan. Den endelige lipidkonsentrasjon på 15 mg / ml med 1:60 (w / w) octadecylamine.
  4. Overfør løsningen til glass lagring hetteglass. Oppbevar lipidoppløsningen ved -20 ° C.

2.2 Klorering av referanse-elektroden

Referansen elektrodene må være klorert i jevne mellomrom på grunn av slitasje.

  1. Fjerne resten av den gamle silverchloride lag med fint sandpapir før klorerings-prosessen.
  2. Plasser sølvtråd sammen med en platina-elektrode i en 1 M saltsyreløsning og klor i 15 min ved 0,5 mA. Etter endt klorering, endrer sølv wire sin farge til en homogen mørk grå.

2.3 Fremstilling av den polyacrylamidgel bro

  1. Tilbered en oppløsning inneholdende 100 mM KPI ved pH = 7, 100 mM KCl og 6% Akrylamid.
  2. Legg 0,3% APS (10% lager) og 0,6% TEMED og kort tid blande løsningen med en pipette.
  3. Umiddelbart etter blanding i løsning, benyttes en pipette for å injisere 30 pl av blandingen inn i den tomme gel bro beholder. Det er viktig å unngå luftbobler under injeksjonen.
  4. I løpet av en inkubasjonstid på 20 min gelen polymeriserer.
  5. Etter polymerisasjonen gelen bro er lagret i løsning (100 mM KPI pH 7, 100 mM KCl). For å forlenge levetiden på gel bridge løsningen er lagret ved 4 ° C.

2.4 Utarbeidelse av måle-løsninger

På grunn av den sterk interaksjon av de oppløste stoffer med SSM, er elektriske artifakter genereres når oppløsninger av forskjellig sammensetning utveksles. Derfor er fremstillingen av løsningene et kritisk trinn. Ta følgende forholdsregler ved løsningen forberedelse prosess for å minimere løsning utveksle gjenstander.

  1. Gjøre ikke-aktivering og aktivere løsninger fra ett parti, justere pH og ionestyrke.
  2. Høy salt bakgrunn bidrar til å redusere løsning utveksle gjenstander.
  3. Dele batch løsning i to bind.
  4. Legg den aktiverende forbindelsen til den aktiverende oppløsning. Bruk en kompenserende forbindelse i den ikke-aktiverende løsning for å holde osmolariteten og ionestyrken av begge løsningene så like som mulig.
  5. Hvis løsningene er lagret ved 4 ° C, sørg for at alle løsninger nådd romtemperatur før du starter en måling, fordi selv små forskjeller i temperatur kan produsere gjenstander.

3. En SSM-baserte Electrophysiology Experiment

Her presenterer vi en typisk protokoll for en SSM-baserte elektrofysiologisk eksperiment.

3.1 Klargjøring av SSM Setup

Mens SSM Installasjonen er ikke i bruk rørene er fylt med en 30% etanol/ Vann-oppløsning for å unngå bakterievekst.

  1. Vask systemet med rent vann for å fjerne etanol fra slangen før montering av kyvetten. Erstatte etanol beholdere med vann beholdere. Bruk av høyt trykk (0,6 til 1,0 bar) rense systemet med 20-30 ml vann.
  2. Gjenta rensingen ved hjelp av en 100 mM KPI buffer ved pH 7,6 eller ikke-aktiverende løsning.
  3. Pass på at ingen luftbobler forbli i væsken system.

3.2 Montering kyvetten

  1. Fest en o-ring til referenseelektroden
  2. Ta gelen broen fra lagringsløsning og koble referanseelektroden.
  3. Forhåndsutfyll uttaket kontakten med ikke-aktivering buffer, sette inn en o-ring og koble gel broen for å fullføre referanse elektrode forsamlingen. Vis forsiktighet at ingen luftbobler er i krysset av gel broen og utløpet løsning flyt sti.
  4. Preassemble den viktigste delen av cuveTTE ved tilsetning fjæren kontaktstift (kobling til forsterkeren), innløpsrøret (forbindelse til terminalen ventil), at o-ringen (forsegling for SSM) og skruene.
  5. Ved hjelp av en pinsett, ta sensor chip ut av lagring løsning (10 mM octadecanethiol i etanol).
  6. Ved hjelp av en pipette, vask av den gjenværende løsningen med ca. 5 ml ren etanol.
  7. Tørk elektroden som nitrogengass.
  8. Plasser følerbrikken nøyaktig på basisdelen av kyvetten, slik at innløpet boringen i hoveddelen av kyvetten er rettet mot den sirkulære aktive område av sensoren.
  9. Tilsett 1 mL av lipidoppløsningen til det aktive området til følerbrikken. Sørg for at gull laget er fullt dekket av lipid.
  10. Umiddelbart etter tilsetning av lipidoppløsningen, lukker kyvetten ved å tilsette den forhåndsmonterte hoveddelen.
  11. Før du monterer kyvetten inn i Faraday bur, være sikker på at alle flater er helt tørre.
  12. Connect forsterkeren til fjæren kontaktstiften og innløpsrøret til terminalen ventilen. Deretter fikse kyvetten med skruene inne i Faraday bur.
  13. Skru Utløpskoblingen til toppen av kyvetten. Til slutt kobles utløpsrøret til utløpet kontakten og den spenningsgeneratoren til referanse-elektroden.
  14. Umiddelbart etter montering av kyvetten vask systemet med buffer ved 0,6 bar. Dette fører til spontan dannelse SSM.

3.3 Måling membran parametere

For å sjekke kvaliteten på SSM, er kapasitans og ledningsevne målt ved hjelp av funksjonen generator.

  1. Ved hjelp av funksjonen generator, gjelder 100 mV DC spenning å måle ledningsevne.
  2. Beregn konduktans: Den aktuelle forfallet viser lading av membran kondensator. Etter at kondensatoren er helt oppladet målt strøm utbytter er videre membrankonduktans ved hjelp av Ohms lov. For enkelhets skyld bruker vi current 1 sek etter at spenningen er brukt til å beregne ledningsevne G = I / U.
  3. Påfør en trekantet vekselspenning på 50 mV topp til topp amplitude og en frekvens på 0,5 Hz for å måle kapasitans.
  4. Beregn kapasitans: Amplituden til den resulterende firkantbølge strøm representerer den ladestrøm til kondensatoren. Kapasitansen C er lik den overførte lade Q = IΔt dividert med ΔU = 100 mV. (ΔU er det dobbelte av påtrykt spenning på 50 mV for jeg er lik differansen mellom nåværende positiv minus negative hellning av den trekantede spenning.)
  5. Overvåke de elektriske parametre av membranen flere ganger hvert 10 min i ca. 30 til 40 minutter, inntil konstant verdier nås. Vask i mellom med KPI-buffer ved høyt trykk i området fra omtrent 0,6 til 1 bar.
  6. Estimer kvaliteten av SSM: optimale parametere er i området fra 0,1 til 0,2 NS, og 2 til 3,5 nF. En høy ledningsevne over 0,8 nS og lav kapasitans under en nF indikererat SSM ikke er fullstendig dannet. En høy kapasitans over 4 nF kan innebære at den aktive sonen ikke er dekket helt av SSM.
  7. Hvis parametrene ikke er i det optimale område, bør membranen kasseres og en annen SSM fremstilt, ved hjelp av en nylaget elektrode chip.

3.4 Kontroll for løsning utveksle gjenstander

Etter membranen parametrene er kontrollert, skal de måle buffere testes for løsning utveksle gjenstander.

  1. Sett de respektive løsning beholdere til væsken system.
  2. Fjerne luftbobler fra fluidumsystemet, ved hjelp av de manuelle ventiler.
  3. Bruke data oppkjøpet programvaren valgte flyten protokollen du ønsker å bruke i eksperimentet.
  4. Juster trykket til 0,6 bar og starte målingen.
  5. Bortsett fra de mekaniske ventil bytte gjenstander, bør ideelt sett ingen artefakt strømmer måles eller de bør være mye SMAller enn de forventede protein transport signaler. Dersom oppløsningen utveksling gjenstander er observert, forsøke å optimalisere buffer-blandinger og / eller tilberedning fremgangsmåten før fortsette forsøket.

3.5 Legge til protein prøven

Vanligvis proteoliposomes eller membran fragmenter lagres frosset ved -80 ° C. For en måling en alikvot av ca 30 ul er nødvendig.

  1. Skyll SSM med ikke-aktiverende oppløsning.
  2. Tine proteinprøven på is.
  3. Tre 10-sek Sonikering sykluser er vekslet med 10-sek kjøling intervaller på is. Proteoliposomes er sonicated bruker et bad sonicator. For membran fragmenter en spiss sonikator (50W, 30 kHz, en sonotrode mm diameter, intensitet 20%, syklus 0.5) brukes. Etter siste sonikeringstrinn ikke sette prøven tilbake på isen, men injisere den umiddelbart inn i kyvetten.
  4. Skru Utløpskoblingen sammen med referenseelektroden assembly.
  5. Ved hjelp av en pipette, aspirer 30 pl av protein prøven og montere pipette tips til utløpet fødte.
  6. Åpne den manuelle ventil i den ikke-aktiverende pathway til avfallsbeholderen og injiser proteoliposomes i kyvetten volum. Vær forsiktig med å injisere luft i kyvetten volum med sensoren.
  7. Før du fjerner pipette spissen, lukke manuell ventil for å hindre ytterligere væskemengde.
  8. Tillat proteoliposomes for å adsorbere til SSM for en inkubasjonstid på 1 til 2 timer. Det er også mulig å inkubere over natten.

3.6 Generell fremgangsmåte av en SSM-basert eksperiment

  1. Varm opp de måler buffere i tid, dersom den lagres ved 4 ° C. Målinger i alle buffere må ha romtemperatur før du starter målingen for å unngå artefakter.
  2. Når du endrer løsninger, først rense rørene inne i løsningen beholdere med en ikke-fuzzing vev, og sett de nye flaskene.
  3. Før du starter målingen, bruker de manuelle ventiler for å fjerne luftbobler, som kunne ha utviklet seg fra å endre prosedyren.
  4. Juster trykket rett før du starter en måling. Vi rutinemessig bruker et trykk på 0,6 bar som ved vår spesifikk ventil-og rør-konfigurasjon gir en strømningshastighet på omtrent 1,0 ml / sek.
  5. De første få målinger kan utføres rett etter hverandre, og bør avvises inntil toppspenningen forblir konstant. Hvis løsningene varierer i pH-en inkubasjonstid på minst 3 minutter er nødvendig for å justere pH-verdien av de indre proteoliposomes før start av målingen.
  6. Nå er satt opp er klart for måling. For å redusere støyen i det minste tre målinger skal gjøres og gjennomsnitt av.

3,7 kontrollmålinger

Et signal oversikt under en rekke målinger kunne oppstå på grunn av protein degradering eller tap av adsorpsjon. Hver SSM eksperiment bør jegnclude en oversikt kontroll. Dette gjøres ved gjentatte målinger med identiske løsninger. Den minimale trekk styreinnretningen en måling ved begynnelsen og en ved slutten av forsøket, ved hjelp av den samme løsning.

Vi anbefaler å gjøre trekk kontroll under forhold der du forventer den høyeste toppen amplitude i forsøket. Dette gjør det lettere å kvantifisere oversikt over signalet.

Signalet trekk kan kvantifiseres ved en sammenligning av topparealene amplitudene til de to trekk-kontrollene. Den resulterende prosentvise verdi kan brukes til å korrigere de målte signalene ved å anta en lineær tidsavhengighet av trekk.

3,8 Artifact kontroller

Hvis mulig forsøker å validere resultatene dine ved å hemme protein av interesse etter forsøket. Resterende signaler er trolig løsningen utveksle gjenstander. Signalene så må korrigeres for de målte gjenstander.

  1. Vask systemet med 20-30 ml av rent vann og 20-30 ml 30% etanol / vann. Den etanoliske oppløsningen unngår bakterievekst når systemet ikke er i bruk.
  2. Etter dette rengjøringsprosessen, slipper trykket fra anlegget og slå av alle instrumenter.
  3. Fjern kyvetten fra Faraday bur og demontere den. Alle deler av kuvetten kan rengjøres med vann og ren etanol, om nødvendig, ved hjelp av et bad sonikator.
  4. Plasser følerbrikken i et glas begerglass med ren etanol. Sonicate begerglasset i omkring 1 til 2 min ved hjelp av et bad sonikator.
  5. Tørk sensorbrikken under nitrogen gass.
  6. Oppbevar sensor chip fra lys i en 10 mM Octadecanthiol etanolløsning. Etter en inkubasjonstid på ca 30 min sensorbrikken er klar for ny bruk.

Representative Results

Inntil nå, var SSM-baserte elektrofysiologi brukes til å karakterisere mer enn 20 transportører, for det meste av prokaryote opprinnelse, f.eks 3 Melb, 4 NhaA og PutP 5 (oppsummert i seks). Men også eukaryote transportører fra intracellulære membraner, f.eks ClC7 7 samt ionekanaler, f.eks nikotin-acetylcholin reseptor 8 har blitt undersøkt.

Her presenterer som et eksempel målinger av sukker / H +-cotransporter Lacy fra Escherichia coli ved anvendelse proteoliposomes med minst 85% høyre side ut orientert Lacy ved en LPR av 5 9, 10. Vi fokuserer på de viktigste trinnene fører til en minimal kinetisk modell av denne transporten protein.

En. Elektrofysiologisk karakterisering av hvete Lacy

Det første trinnet er en generell karakteristikk av den electrogenic reaksjonen ved å måle forskjellige pH-verdier ( > Fig. 4), substrat-konsentrasjoner (figur 5) og substrater. Å validere teknikk, ble K M og pK-verdier gitt i litteratur gjengitt.

PH avhengighet av Lacy viser to forskjellige electrogenic reaksjoner. Den kapasitivt koblet strømmen øker mellom pH 5 og pH 8,5, men også forandrer form. Under alkaliske betingelser stabil tilstand transport er observert, mens for sure pH-verdier bare en hurtig reaksjon electrogenic gjenstår. For å skille de steady state signaler fra de raske electrogenic reaksjoner vi brukte krets analyse for å rekonstruere transporter strømninger (figur 6).

Ved pH 7 enfase-signalet blir tofaset. Dette indikerer også at det er to forskjellige electrogenic reaksjoner. Beregnet fra overført kostnad (integral av signaler), er de to reaksjoner har omtrent 6% og 94% av den totale electrogenicity av transport-syklus.

ove_step "> to. Overdragelse av electrogenic reaksjoner

Å tildele de to electrogenic reaksjoner på bestemte trinn i reaksjonen syklus av Lacy ble E325A Lacy variant målt (figur 7). Denne varianten viser bare laktose utveksling, men er mangelfulle for alle aktive transportmåter, på grunn av hemmingen av proton frigjøring. Signalet av E325A Lacy representerer en rask forbigående og er konstant for alle målte pH-verdier. Formen og amplituden av signalet er lik signalet villtype Lacy under sure betingelser. I tillegg ser vi en liten negativ fase etter den fallende peak strøm, noe som er karakteristisk for rask transient strøm målt i capacitively koblede systemer. Fordi laktose bindende og utgivelsen er ikke electrogenic, må det raskt forbigående korrelerer med en electrogenic konformasjonsforandringer overgang etter laktose bindende.

Det er kjent at proton utgivelsen trinnet er prisen limiting for Lacy omsetning i laktose konsentrasjonsgradient drevet transport modus. I dette tilfellet forventer vi en økning av transport sats med alkalisk pH, fordi proton utgivelsen er favorisert. Dette er tilfellet for steady state transport korrelert signal av hvete Lacy. Dessuten kunne det påvises ved pH-gradient måling at kun den indre pH påvirker det stasjonære transport av Lacy (upublisert). Derfor er det stor electrogenic reaksjonen kan være tilordnet proton frigjøring trinn.

3. Målinger for kinetisk analyse

Etter identifisering av electrogenic reaksjoner på og utenfor transport priser ble bestemt ved hjelp av en SSM Setup med en høy tid oppløsning på om lag 4,5 millisekunder. Dette er bare mulig under betingelser, når man reaksjon dominerer signalet. I dette tilfellet hastighetskonstanter kan være avledet fra forbigående strømninger under vurdering av tiden oppløsning av signaler ved hjelp av en iterativ minste kvadrat de konvolusjon algoritme (Figur 8). De konstaterte hastighetskonstanter samt den foreslåtte minimal kinetisk modell (Figur 9) til slutt ble benyttet for simulering av transportør-kinetikk. De simulerte kurver reprodusere SSM data som i tillegg beviser den kinetiske modellen.

Figur 1
Figur 1. Adsorpsjon geometrien til proteoliposomes i SSM. SSM er dannet på en sensorbrikke, en strukturert gull belagt glass-slide. For å måle electrogenic reaksjoner av membran proteiner, er proteoliposomes eller membran fragmenter adsorbert til SSM. De to membraner danner et kapasitivt koblet system. Dette er hvorfor bare transiente strømmer oppdages.

tp_upload/50230/50230fig2highres.jpg "/>
Figur 2. SSM kyvetten bærer sensorbrikken og referanseelektroden. Sensorbrikken er klemt mellom kyvetten base og kyvetten hode. Den referanse-elektroden er isolert fra strømmen sti av en polyacrylamidgel saltbro.

Figur 3
Figur 3. Fluidveien og elektriske kretsen i SSM oppsett. På den eneste løsning utveksling protokoll bare ett ikke-aktiverende (NA) og en aktiverende (A) oppløsning er nødvendig. Strømningen styres av to 2-veis ventiler (V1) og en terminal ventil (V2). Terminalenhetene Ventilen skifter mellom ikke-aktiverende og aktiverende løsninger, dirigere en av løsningene til kyvetten og den andre løsning til en avfallsbeholder (W). Følerbrikken (SSM) er koplet til forsterkeren (I / U) mens referanse-elektroden (AgCl) er forbundet med den funksjonsgenerator (F) i den ytre elektriske krets. En datamaskin (PC) og en grensesnitt-boksen brukes for ventildrift og datainnsamling.

Figur 4
Figur 4. Forbigående strømmer målt med vill-type Lacy proteoliposomes etter 100 mm laktose konsentrasjon hopp på ulike pH-verdier. Den ikke-aktiverende løsning inneholdt 100 mM glukose mens aktiverende løsningen inneholdt 100 mM laktose. Alle oppløsninger ble fremstilt i 100 mM kaliumfosfatbuffer ved det angitte pH-verdi med 1 mM DTT. For detaljer om måling forholdene i dette og følgende tall henvises til 9 og 10 år.

ftp_upload/50230/50230fig5highres.jpg "/>
Figur 5. Gjennomsnittlig normaliserte Peak strømmer målt med vill-type Lacy proteoliposomes etter laktose konsentrasjon hopp på ulike konsentrasjoner og pH-verdier. The K M verdiene er hentet fra hyperbolske passer.

Figur 6
Figur 6. Rekonstruksjon av transporter strømninger. De forbigående strøm (A) brukes til å rekonstruere transporter strømninger (B) ble målt med vill-type Lacy proteoliposomes etter 100 mm laktose konsentrasjon hopp på pH 8,5 (blå strek) og pH 5,2 (rød kurve). Ved pH 8,5 kontinuerlig omsetning er observert mens ved pH 5,2 en rask electrogenic reaksjon oppstår. Dette er tydelig observert i den rekonstruerte strøm (B).

files/ftp_upload/50230/50230fig7.jpg "alt =" Figur 7 "fo: content-width =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/50230/50230fig7highres.jpg "/>
Figur 7. Transient strøm målt med E325A Lacy proteoliposomes etter en 100 mM laktose konsentrasjon hopp ved pH 5,2. Denne Lacy varianten er hemmet i proton utgivelsen trinn av transport syklus og derfor transport-mangelfull. Den lille negative komponenten observert er karakteristisk for rask transient strøm målt i capacitively koblede systemer og er forårsaket av utslipp av membranen kapasitans etter en rask electrogenic reaksjon. Dens tid konstant π0 bestemmes av kapasitanser og conductances av systemet (figur 1).

Figur 8
Figur 8. Forbigående strømmer målt med vill-type Lacy proteoliposomes after ulike laktose konsentrasjon hopp på pH 5,2. Under disse forholdene ikke steady state transport er observert, men en electrogenic konformasjonsforandringer overgang på laktose bindende. Den stiplede linjen viser overføringsfunksjonen som representerer den tid oppløsningen til systemet. Det innfelte viser fastsettelse av og på hastighetskonstanter fra de observerte rente konstant kobs med en hyperbolsk tilpasning til data. Den observerte forekomsten konstant ble bestemt ut fra de forbigående strømmer med en iterativ minste kvadrat deconvolution algoritmen 10.

Figur 9
Figur 9. En kinetisk modell for reaksjonen syklus av Lacy. To electrogenic trinn kan bli identifisert og karakterisert ved SSM målinger. En sterkt electrogenic reaksjon representerer ~ 94% av totalkostnaden forskyvning i reaksjonensyklus er kun observert på nøytrale og basiske pH-verdier. Det kan være tilordnet proton frigjøring trinn (blå pil). En svakt electrogenic trinnet er observert ved sur pH når kontinuerlig omsetning på vill-type Lacy hemmes. Vi tilordnet denne reaksjon til et electrogenic konformasjonsforandringer overgang på laktose binding, som representerer 6% av den totale kostnad forskyvning i reaksjonen syklus.

Discussion

En. Fordeler med SSM-basert electrophysiology sammenlignet med konvensjonelle fremgangsmåter

SSM-baserte elektrofysiologi har vist seg som et verdifullt verktøy for elektrofysiologisk verktøykasse. Det er spesielt nyttig i tilfeller der konvensjonen elektrofysiologi, nemlig patch klemme og spenning klemme metoder, ikke kan brukes: Bortsett fra noen få unntak bakterielle transportører ikke kan undersøkes ved hjelp av spenning klemme eller patch clamp metoder på grunn av den lille størrelsen på bakterier og fordi de er vanskelig å uttrykke i mammalske celler eller oocytter. Men også fysiologisk relevante pattedyr transportører kan undersøkes. I dette tilfellet SSM-baserte elektrofysiologi er attraktivt for transportører fra intracellulære membraner og for screening programmer i medisiner på grunn av sin robusthet og dets potensial for automatisering.

SSM-basedUsing konvensjonell elektrofysiologi, tid løst karakterisering av transporters er utfordrende. Ettersom omsetningen av transportører er en lav 'gigantisk patch "eller en" hel celle "-konfigurasjon er nødvendig, noe som har en iboende lav tidsoppløsning i en løsning utveksling eksperiment. Komplikasjonen kan overvinnes ved hjelp fotolytisk underlaget utgivelse. Det er imidlertid bare et begrenset antall underlag egnet for denne tilnærmingen. Her den raske løsningen utveksling ved SSM tilbyr en unik mulighet til å utføre elektrofysiologiske studier med høy tid oppløsning ved hjelp av vilkårlige underlag.

2. Begrensninger og kritiske trinn

I motsetning til patch clamp og voltage-clamp-teknikker, kan SSM-basert electrophysiology ikke benyttes for å påføre et potensiale. Transporter karakterisering er derfor begrenset til transport modi som ikke er avhengige av en membran potensial.

Generelt har SSM-baserte elektrofysiologi ingen begrensninger angående type (electrogenic) transporter. Men spenning clAmp eller patch clamp metoder kan ha fordeler, hvis intracellulære komponenter som bindende proteiner er nødvendig for protein-funksjonalitet.

Begrensninger kan oppstå, hvis løsning utveksling skaper store artefakt strømninger. Dette skjer når substratet interagerer sterkt med SSM som i tilfelle av lipofile forbindelser. Artefaktregioner kontroller kan brukes for å korrigere de målte signaler. Videre høy salt bakgrunn i alle måle-buffere kan brukes til å redusere gjenstander. Men i tilfeller hvor størrelsen på gjenstanden er sammenlignbar med den protein-signal, er det nesten umulig å isolere protein-relaterte signaler fra gjenstanden. Heldigvis høye gjenstander er uvanlig i en optimalisert løsning utveksling.

Det er noen skritt som er kritiske for en vellykket realisering av en SSM-baserte elektrofysiologi eksperiment. Fremstillingen av proteinprøven er den viktigste delen. Hvis proteoliposomes brukes, må du passe på reconstitution Prosessen resulterer i et rent, reproduserbar prøve av et tilstrekkelig LPR og transportøren er orientert på riktig måte. LPR kan kontrolleres ved å fryse brudd elektronmikroskopi og orientering av en ELISA eksperiment hvis antistoffene er tilgjengelig.

Bruk kun en SSM som viser optimale parametre for ruger protein prøven. Injeksjonen av proteinet er et annet kritisk punkt. Sonikering er viktig og luftbobler bør unngås under injeksjonen. Etter at prøven inkubering målingene selv er kritisk, fordi luftbobler vil fjerne det adsorberte protein prøven fra sensorbrikken. Derfor alltid fjerne luftbobler etter endring løsninger. Ikke desto mindre et signal trekk kan forekomme. For å korrigere en mulig signal trekk, er det viktig å oppnå trekk kontroller under eksperimentet.

3. Spesialiserte Systems

SSM-oppsett kan endres i henhold til sin søknad. Videre ther er helt forskjellige, høyt spesialiserte oppsett tilgjengelig.

Det er mulighet for å måle protein signaler i henhold asymmetriske forhold, for eksempel under en pH gradient. For å etablere asymmetriske buffer komposisjoner i og utenfor proteoliposomes en tredje løsning, hvile løsning, har til å bli innført, og dette krever en dobbelt utveksling konfigurasjon. Her er en ytterligere treveisventil veksling mellom ikke-aktiverende og hviler løsninger er nødvendig.

For å øke tidsoppløsningen av systemet vi utviklet en alternativ strøm pathway mangler terminalen ventil, men ved anvendelse av en annen type av kyvetten. Her krysningspunktet mellom aktivering og ikke-aktiverende løsning er plassert inne i kyvetten, 3 mm foran SSM. Dette oppsettet er godt egnet for kinetisk analyse av rask transport prosesser. Det kunne vises at en tidsoppløsning så lav som 2 ms er mulig.

Kommersiell fully automatiserte systemer er tilgjengelig med sikte på en betydelig høyere gjennomstrømning for narkotika screening. En bevegelig enhet samler løsninger og injiserer dem på sensorens overflate i 96-brønners plater i en standard mikrotiterplate-format.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgements

Vi takker J. Garcia-Celma, jeg Smirnova og R. Kaback for bidrag til Lacy målinger og E. Bamberg for støtte og nyttige diskusjoner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Waterbath Sonicator Bandelin RK 52 H
Tip Sonicator Hielscher Ultrasonics GmbH UP50H
2-way valve NResearch, West Caldwell, USA NR225T011
Terminal valve NResearch, West Caldwell, USA NR225T031
Manometer Greisinger electronics GDH 14 AN
Faraday cage Max Planck Institute of Biophysics
Cuvette Max Planck Institute of Biophysics
100 ml solution containers Kartell 1623
O-rings Seal Science Inc.
Oscilloscope Tektronix TDS 1002
Reference electrode Max Planck Institute of Biophysics
Function generator Max Planck Institute of Biophysics
Tubings SAINT-GOBAIN Performance Plastics AAC00006
Sensor chip Fraunhofer Institut für Schicht und Oberflächentechnik
Interface box Max Planck Institute of Biophysics
Amplifier Keithley 427
Manual cog Vygon GmbH 876
USB analog-to-digital converter National Instruments 6009
Regeants
1,2‑Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids, Inc. 850356
Acrylamide/Bis-acrylamide Sigma Aldrich A3574
Ammonium persulfate Sigma Aldrich A3678
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich G8270
Dithiothreitol Sigma Aldrich 43819
Ethanol absolut VWR AnalaR NORMAPUR 603-002-00-5
Natural E. coli lipids polar extract Avanti Polar Lipids, Inc. 100600 for LacY reconstitution
n-Decane Sigma Aldrich D901
Octadecanethiol Sigma Aldrich O1858
Octadecylamine Sigma Aldrich 74750
Potassium chloride Merck 1049360500
Potassium phosphate dibasic Sigma Aldrich P3786
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P9791
Tetramethylethylenediamine BIO RAD 1610801
α-Lactose monohydrate Sigma Aldrich L8783

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seifert, K., Fendler, K., Bamberg, E. Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes. Biophys. J. 64, 384-391 (1993).
  2. Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. SSM-based electrophysiology. Methods. 46, 97-103 (2008).
  3. Garcia-Celma, J. J., et al. Rapid activation of the melibiose permease MelB immobilized on a solid-supported membrane. Langmuir. 24, 8119-8126 (2008).
  4. Mager, T., Rimon, A., Padan, E., Fendler, K. Transport mechanism and pH regulation of the Na+/H+ antiporter NhaA from Escherichia coli: an electrophysiological study. J. Biol. Chem. 286, 23570-23581 (2011).
  5. Zhou, A., et al. Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E.coli. J. Mol. Biol. 343, 931-942 (2004).
  6. Ganea, C., Fendler, K. Bacterial transporters: charge translocation and mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 1787, 706-713 (2009).
  7. Schulz, P., Werner, J., Stauber, T., Henriksen, K., Fendler, K. The G215R mutation in the Cl-/H+-antiporter ClC-7 found in ADO II osteopetrosis does not abolish function but causes a severe trafficking defect. PLoS ONE. 5, e12585 (2010).
  8. Schulz, P., Dueck, B., Mourot, A., Hatahet, L., Fendler, K. Measuring ion channels on solid supported membranes. Biophys. J. 97, 388-396 (2009).
  9. Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. Electrophysiological characterization of LacY. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 7373-7378 (2009).
  10. Garcia-Celma, J. J., Ploch, J., Smirnova, I., Kaback, H. R., Fendler, K. Delineating electrogenic reactions during lactose/H+ symport. Biochemistry. 49, 6115-6121 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats