निर्माता और मल्टिप्लेक्स Chemostat Arrays के डिजाइन का उपयोग

Published 2/23/2013
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Biology
 

Summary

हम विकसित और कम लागत के लिए आसानी से उपलब्ध भागों से निर्मित लघु chemostats की एक सरणी छोटे पदचिह्न मान्य. शारीरिक और प्रयोगात्मक विकास परिणाम बड़ी मात्रा chemostats को समान थे. पारंपरिक chemostat प्रयोगों, कार्यात्मक जीनोमिक्स, अनुप्रयोगों और रासायनिक जांच के लिए ministat सरणी एक कॉम्पैक्ट, सस्ती और सुलभ मंच प्रदान करता है.

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Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262, doi:10.3791/50262 (2013).

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Abstract

Chemostats सतत संस्कृति प्रणालियों में जो कोशिकाओं के एक कसकर नियंत्रित, रासायनिक स्थिर वातावरण जहां संस्कृति घनत्व विशिष्ट पोषक तत्वों सीमित करके विवश है में बड़े हो रहे हैं chemostats से 1,2 डेटा अत्यधिक मात्रात्मक phenotypes की माप के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं के रूप में वे एक निरंतर वृद्धि दर प्रदान पर्यावरण और स्थिर अवस्था में. इन कारणों के लिए, chemostats जीन अभिव्यक्ति 3-6 और स्थिर राज्य संतुलन पर संस्कृतियों की अन्य विशेषताओं के विश्लेषण के माध्यम से ठीक पैमाने शरीर क्रिया विज्ञान के लक्षण वर्णन के लिए उपयोगी उपकरण बन गए हैं. 7 chemostats में लंबी अवधि के प्रयोगों विशिष्ट trajectories है कि माइक्रोबियल आबादी अपनाने को उजागर कर सकते हैं एक नियंत्रित वातावरण में अनुकूली विकास के दौरान. वास्तव में, chemostats अपने आविष्कार के बाद से किया गया है प्रयोगात्मक विकास के लिए इस्तेमाल किया 8. विकास प्रयोगों में एक आम परिणाम प्रत्येक जैविक दोहराने के लिए परिवर्तन की एक अद्वितीय प्रदर्शनों की सूची प्राप्त9-13. इस विविधता से पता चलता है कि वहाँ बहुत से अभी तक अधिक से अधिक throughput के साथ विकास प्रयोगों प्रदर्शन द्वारा की खोज नहीं छोड़ा जा सकता है.

हम यहाँ और एक अपेक्षाकृत सरल, लघु chemostats या कम लागत सरणी के डिजाइन, संचालन वर्तमान ministats और शरीर क्रिया विज्ञान के दृढ़ संकल्प और खमीर के साथ विकास प्रयोगों में उनके उपयोग को मान्य. यह दृष्टिकोण chemostats के दसियों से एक एकल मल्टिप्लेक्स क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप चलाने के विकास की जरूरत पर जोर देता है. संस्कृतियों का एक 20 मिलीलीटर मात्रा काम कर रहे, जो आवेदनों की एक किस्म के लिए व्यावहारिक है पर रखा जाता है. यह हमारी आशा है कि throughput बढ़ाने, खर्च कम है, और विस्तृत निर्माण और संचालन के निर्देश प्रदान करते हैं भी कार्यात्मक उपभेदों, प्रजातियां, और विकास के मानकों के बड़ी संख्या में निस्र्पक, साथ ही आनुवंशिक के लिए एक सामान्य मंच के रूप में इस डिजाइन के अनुसंधान और औद्योगिक आवेदन के लिए प्रेरित कर सकते हैं या दवा पुस्तकालयों.

Introduction

माइक्रोबियल विकास और विकास की गतिशीलता सूक्ष्म जीव विज्ञान, पारिस्थितिकी, आनुवंशिकी, और जैव प्रौद्योगिकी के लिए मौलिक हैं. संवर्धन रोगाणुओं का सबसे आम तरीका बैच, जहां कोशिकाओं को पोषक तत्वों से भरपूर शोरबा में कम घनत्व inoculated हैं और संतृप्ति के लिए हो गई है. हालांकि मानक प्रयोगशाला उपकरण का उपयोग करते हुए प्रदर्शन के लिए सीधा, बैच संस्कृतियों एक अस्थिर रासायनिक वातावरण का अनुभव है और तदनुसार सेलुलर शरीर क्रिया विज्ञान बदल. इस विषम विकास पर्यावरण माध्यमिक विकास और तनाव के प्रभाव है कि सूक्ष्म शारीरिक मतभेद मुखौटा कर सकते हैं में परिणाम कर सकते हैं. धारावाहिक बैच हस्तांतरण द्वारा प्रायोगिक विकास विकास चरण विशिष्ट subpopulations के जटिल मिश्रण के लिए चयन करने के लिए, विशिष्ट चयनात्मक शर्तों के रूपांतरों को कनेक्ट करने का प्रयास उलझी कर सकते हैं. मात्रात्मक phenotypes का मापन imprecise नमूना और समय अंतराल के रूप में सुविधाओं में समय भिन्नता से शोर की वजह से मुश्किल हो सकता है. सतत संस्कृतियों एक विकल्प प्रदानविकास शासन की कोशिकाओं reproducibly जहां एक परिभाषित विकास दर पर किया जा सकता है एक रासायनिक सजातीय वातावरण में खेती के लिए एक शारीरिक स्थिर राज्य तक पहुँचने. इन लाभों के कारण, प्रयोगात्मक और सेलुलर राज्य के विकास के लक्षण वर्णन के अध्ययन अक्सर chemostat तरह निरंतर संस्कृतियों के नियंत्रित वातावरण का उपयोग 14.

इन फायदों की सराहना chemostat संस्कृतियों में हित में एक पुनरुत्थान का नेतृत्व किया गया है 1950 में अपनी शुरुआत के बाद से 15, 1,2 chemostat सिस्टम लीटर से microliters को लेकर तराजू के एक किस्म पर और आवेदनों की एक किस्म के लिए किया गया है कार्य करने के लिए विकसित 16. -19 इन विभिन्न डिजाइन, जो वाणिज्यिक उत्पादन बायोरिएक्टर से कस्टम microfluidics प्लेटफार्मों पर glassblown वाहिकाओं, शेयर सामान्य डिजाइन सिद्धांतों को लेकर. संस्कृति कक्ष हड़कंप मच गया है और वातित (आमतौर पर यह माध्यम से हवा बुदबुदाती) और उसमें निहित रोगाणुओं सजातीय रखा जाता हैly सभी समय पर संस्कृति कक्ष भर में छितरी हुई. परिभाषित संरचना की ताजा मध्यम लगातार कहा है और इसके अतिरिक्त की दर वृद्धि दर नियंत्रण और रासायनिक संस्कृति द्वारा अनुभवी पर्यावरण को प्रभावित करती है. एक अतिप्रवाह विकास ट्यूब में संस्कृति मात्रा सेट, संस्कृति और इस अतिप्रवाह के माध्यम से एक ही दर है जिस पर ताजा माध्यम में प्रवेश करती है पर जांचा जाएगा. इस तरह संस्कृतियों जल्दी से एक शारीरिक स्थिर अवस्था पर पहुंचते हैं, जिस पर कई जैविक मापदंडों के लिए स्थिर रहेगा. Chemostats और साहित्य में इन विभिन्न प्लेटफार्मों की रिपोर्ट के फायदे के बावजूद, व्यापक अपनाने के निर्माण और इन प्रणालियों के संचालन में कठिनाइयों, और उच्च व्यावसायिक विकल्प के साथ जुड़े लागत के द्वारा सीमित किया गया है. इसके अलावा कैसे बनाने के लिए इन उपकरणों का उपयोग करने का वर्णन अपारदर्शी हो सकता है.

हम डिजाइन और कम कीमत पर आसानी से उपलब्ध भागों से निर्मित लघु chemostats छोटे पदचिह्न की एक सरणी का उपयोग करने के लिए निर्देश उपस्थित थे. हम obsअत्यधिक लगातार प्रयोगात्मक मानकों और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम erve जब बड़ी मात्रा वाणिज्यिक बायोरिएक्टर में संवर्धित खमीर लिए डेटा की रिपोर्ट करने के लिए हमारे डिवाइस की तुलना है. यह reproducibility सेलुलर फिजियोलॉजी के रूप में 10-15 पीढ़ियों के भीतर स्थिर राज्य संतुलन तक पहुँचने और संतुलन में इसी तरह की संस्कृति घनत्व प्राप्त करने के माध्यम से देखा. इसके अतिरिक्त, जीन अभिव्यक्ति पैटर्न ministats और एक वाणिज्यिक बड़ा मात्रा मंच के बीच लगातार कर रहे हैं. कमजोर पड़ने दर, ऑप्टिकल घनत्व तीन दोहराने संस्कृतियों के बीच और जीन अभिव्यक्ति के reproducibility की स्थिरता हमारे मंच की मजबूती को प्रदर्शित करता है. हम यह भी पता चलता है कि एक ही अनुकूली परिवर्तन बड़ी मात्रा chemostats के साथ इसी तरह की प्रयोगात्मक विकास timescales पर उठता है.

Protocol

प्रोटोकॉल भर उचित बाँझ तकनीक का प्रयोग करें.

1. के लिए भागों कोडांतरण और Ministat सरणी की तैयारी

  1. सभी भागों के लिए.
  2. साफ ग्लास ट्यूब. 20 मिलीग्राम मात्रा में ट्यूबों निशान.
  3. हवा के साथ काग विधानसभाओं, मीडिया, और प्रवाह बंदरगाहों और उन्हें साफ कांच संस्कृति ट्यूबों के शीर्ष पर जगह है.
  4. Humidifying कक्षों तैयार है और सभी गैर autoclaved भागों की व्यवस्था.
  5. हवा, प्रवाह, और मीडिया पर्याप्त टयूबिंग लंबाई और संगत couplings का उपयोग टयूबिंग बनाओ.
  6. काग विधानसभाओं और पन्नी फिल्टर और मीडिया आटोक्लेव के लिए उन्हें तैयार करने के लिए त्वरित कनेक्ट. टयूबिंग के प्रत्येक प्रकार (हवा, मीडिया, और प्रवाह) कनेक्ट
  7. बाँझ chemostat माध्यम बनाने में उपयोग के लिए तैयार एक काबोइ.
  8. उचित फिटिंग के साथ एक दो छेद रबड़ डाट डालने से संस्कृति नमूने की बोतलें तैयार. प्रत्येक फिल्टर पन्नी आटोक्लेव के लिए उन्हें तैयार करने के लिए.
  9. फाईटी में बड़े करीने से एक या एक से अधिक आटोक्लेव ट्रे सरणी इकट्ठा किया और सभी भागों आटोक्लेव.
  10. बनाओ और autoclaved carboys में chemostat मीडिया फिल्टर.

2. एक प्रयोग की स्थापना

  1. 700 मिलीलीटर DDH 2 ओ के साथ प्रत्येक जलयोजन फ्लास्क भरें
  2. वांछित तापमान में हीटिंग ब्लॉक सेट में autoclaved ministats रखें.
  3. 4-बंदरगाह कई गुना में एयरलाइनों प्लेस और वायु पंप पर बारी.
  4. 100 मिलीलीटर के संग्रह की बोतलों के लिए प्रवाह लाइनों से कनेक्ट करें.
  5. मीडिया टयूबिंग और मीडिया काबोइ के अंत से पन्नी निकालें और दो त्वरित जोड़ता है कनेक्ट. एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप कारतूस के माध्यम से पंप टयूबिंग के प्रत्येक लंबाई धागा और उन्हें जगह में क्लिक करें. मीडिया पंप चालू.
  6. चलो कक्षों को भरने के. मीडिया पंप बंद.
  7. 70% इथेनॉल के साथ काग असेंबलियों स्प्रे और एक सिरिंज का उपयोग कर संस्कृतियों टीका लगाना. एक जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक के रूप में inoculum का एक नमूना सहेजेंअगर वांछित. संस्कृतियों 30 घंटा के लिए विकसित.
  8. प्रवाह सुई की ऊंचाई समायोजित करें जब तक संस्कृति की मात्रा 20 मिलीग्राम के लिए सेट कर दिया जाता है के साथ हवा का प्रवाह बंद कर दिया है. इस एक घंटे के दौरान कई समायोजन लग सकता है. जब हवा का प्रवाह पर वापस बारी समाप्त हो गया.
  9. पर मीडिया पंप चालू करें.
  10. प्रवाह नमूना बोतलें, जिसमें मीडिया के काम करते वक्त संस्कृति मात्रा एकत्र की स्थापना है, और समय रिकॉर्ड खाली.
  11. एक समय शून्य माप जगह ले 15 मिनट-2 घंटा (डीएनए विश्लेषण के लिए मात्रा क्या आप नमूना की इच्छा पर निर्भर करता है) के लिए बाँझ संग्रह ट्यूबों में प्रवाह लाइनों. इसके अलावा प्रत्येक संस्कृति के लिए इस समय एक ग्लिसरॉल जमे हुए स्टॉक अगर वांछित.

3. दैनिक माप

  1. के रूप में अपने माप समय शून्य, 15 मिनट बर्फ पर 2 घंटा (के रूप में अपने प्रयोग के लिए आवश्यक) के लिए नमूना बर्फ पर साथ और डीएनए और जमे हुए स्टॉक के नमूने के लिए नमूना समय रिकॉर्ड.
  2. शाही सेना के नमूने या तो एक छोटे से वॉल इकट्ठाएक और संस्कृति से 22G 5 "सुई सिरिंज का उपयोग Ume या ministat प्रत्येक फसल पूरी संस्कृति खोलना नमूने जल्दी से लिया जाना चाहिए, निस्पंदन द्वारा एकत्र की है, और तरल नाइट्रोजन में जमे हुए तुरंत.
  3. प्रवाह प्रत्येक कमजोर पड़ने दर यों ministat के लिए पिछले नमूना के बाद एकत्र उपाय. कमजोर पड़ने दर को समायोजित अगर पंप सेटिंग readjusting द्वारा की जरूरत या ट्यूनिंग ठीक व्यक्तिगत पंप तर्ज पर समायोजित.
  4. खाली संग्रह बोतलों में प्रवाह लाइनों बदलें.
  5. कोशिकाओं / एमएल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ब्याज की अन्य endpoints यों और एक ग्लिसरॉल जमी स्टॉक.

4. प्रयोग के बाद सफाई

  1. अलग ट्रे में सभी टयूबिंग प्लेस और DDH 2 ओ के साथ जरूरत से ज्यादा कुल्ला सूखी टयूबिंग एक मछलीघर पंप का उपयोग.
  2. साफ DDH 2 हे के साथ काग असेंबलियों और सुई डालने का उपयोग करने के लिए सुइयों को साफ करने के लिए, बदले में पानी aspirating और वितरण. सुइयों और काग के बाहर साफ करने के लिए किसी भी दूरअवशिष्ट मीडिया.
  3. साफ पानी और इथेनॉल के साथ ग्लास टयूबिंग, और 3 के साथ शारीरिक contaminants को दूर Kimwipes और संदंश balled.
  4. कुल्ला और सभी भागों का उपयोग करने से पहले फिर से सूखी.

Representative Results

ministat सरणी ऊपर और (चित्रा 1 ए, बी) नवोदित खमीर की अगुणित माता प्रयोगशाला तनाव (S288c) के तहत सल्फेट सीमित शर्तों के रूप में पहले से वर्णित 10 शरीर क्रिया विज्ञान के निर्धारण सहित हम आम chemostat अनुप्रयोगों के लिए प्रभावकारिता परीक्षण की संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया गया था और में वर्णित प्रयोगात्मक विकास. को मान्य करने के लिए ministats, हम दोहराया कई पहले औद्योगिक fermentors में प्रदर्शन प्रयोगों chemostat उपयोग के लिए संशोधित 10,20,21 fermentors एटीआर Sixfors एक 300 मिलीलीटर मात्रा में काम दस बार ministats की मात्रा पर चलाए जा रहे थे, और काफी अलग मोड संस्कृति वातन और आंदोलन की. हम उपकरण स्थिरता, स्थिर राज्य शरीर क्रिया विज्ञान, प्रयोगात्मक विकास परिणाम, और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के इन fermentors साथ प्राप्त की नकल करने का प्रयास किया.

कमजोर पड़ने दर और वातन की एकरूपता के बाद से chemostat डिजाइन के महत्वपूर्ण पहलू हैं, मुझे हम32 ministats भर में विकास की 15 पीढ़ियों के बाद वास्तविक कमजोर पड़ने की दर और asured पाया कि 0.17 वॉल / घंटा (4-5 बूँदें / मिनट) के एक लक्ष्य के कमजोर पड़ने की दर के साथ हम .0075 के एक मानक विचलन के साथ 32 के पार ०.१७,२०८ के एक औसत कमजोर पड़ने दर हासिल की replicates. इस रेंज हमारे ठेठ सहिष्णुता + / -0.01 लक्ष्य सेटिंग, जो परे जीन अभिव्यक्ति में बड़े पैमाने पर परिवर्तन देखा गया है से अंतर वॉल / घंटा के भीतर 22-23 4 ministats भर में हवा के प्रवाह की दर 307.5 मिलीलीटर होना निर्धारित किया गया था. 9.57 मिलीग्राम / मिनट के एक मानक विचलन के साथ / मिनट. यह पता चलता है कि कक्षों में हवा के प्रवाह मजबूत है और 4 कक्षों के बीच समान रूप से विभाजित और एक औद्योगिक fermentors में वातन के लिए वर्णित है कि समान मूल्य है 20.

हम पहले 8/8 सल्फेट सीमित खमीर में विकास के प्रयोगों में उच्च आत्मीयता ट्रांसपोर्टर सल्फर आयन SUL1 की आवर्तक प्रवर्धन मनाया 10 थी तहत परिणामों की स्थिरता को देखते हुएहालत हम सल्फेट सीमा हमारी प्रणाली की क्षमता का परीक्षण करने के लिए चुना. Chemostat संस्कृति का एक आवश्यक तत्व एक निरंतर रासायनिक वातावरण को बनाए रखने की जरूरत है. वातावरण में एक सीमित पोषक तत्व या अन्य परिवर्तन की बहुतायत में उतार चढ़ाव को आम तौर पर एक भी संस्कृति में कोशिकाओं की संख्या में एक परिवर्तन में परिणाम. हम 16 दोहराने संस्कृतियों में सेल नंबर (2A चित्रा) और मापा reproducibility के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में ऑप्टिकल घनत्व मापा, 0.057 इकाइयों के एक मानक विचलन के साथ 1.12 की औसत विकास की 15 पीढ़ियों के बाद (~ 10 9 कोशिकाओं) A600 खोजने के, या 5.1 %. तुलना के लिए, 4 दोहराने औद्योगिक fermentors में हो संस्कृतियों से माप लिया 2.5% की एक मानक विचलन से पता चला है. सेल विकास चैम्बर में अच्छी तरह से मिश्रित थे: आयुध डिपो और सेल प्रवाह ट्रैक से लिया गिनती के मापन संस्कृति ट्यूब (नहीं दिखाया डेटा) से सीधे लिया नमूनों के बराबर थे. ये परिणाम हमारे मंच की मजबूती का प्रदर्शनघ औद्योगिक FERMENTOR रूप में एक समान सहिष्णुता के भीतर एक निरंतर रासायनिक वातावरण बनाए रखने की क्षमता है.

शरीर क्रिया विज्ञान के एक और अधिक संवेदनशील readout के रूप में, हम के ministats में और औद्योगिक FERMENTOR में सल्फेट सीमा के अधीन हो संस्कृतियों से जीनोम चौड़ा स्थिर राज्य जीन की अभिव्यक्ति की तुलना में. Ministats में जीन अभिव्यक्ति तीन जैविक replicates (चित्रा 2B) भर में समानता का एक उच्च डिग्री दिखाया. हम पहले उल्लेख किया है कि शाही सेना के लिए दो दोहराने Sixfors chemostats से व्युत्पन्न और एक माइक्रोएरे सह संकरित, जीनों के 99% की अभिव्यक्ति एक सीमा के 1.5 गुना के भीतर गिर गया, 1.5X के एक अनुभवजन्य महत्व cutoff के रूप में उपयोग की अनुमति 21 जीन से अभिव्यक्ति. तीन दोहराने ministats, जोड़ो में तुलना से पता चला जीनों के 99% एक 1.5-1.7 गुना सीमा के भीतर गिर, औद्योगिक fermentors से परिणाम के लिए बराबर है. तीन नमूने व्यक्ति arrays और जोड़ो बाद की गणना अनुपात संकरित किया गया है, तो इन vaलूस जैविक शोर के अलावा में अंतर सरणी शोर, संभवतः replicates के बीच भिन्नता के रूप में प्रकाशित, सह hybridized परिणाम की तुलना में overestimating शामिल हैं. 138 जीन विभिन्न व्यक्त किया गया> सभी तीन ministat में 1.5 गुना के रूप में एक नमूना एक मिलान औद्योगिक FERMENTOR में उगाई संस्कृति से एकत्र की तुलना में replicates. जीन ministats में अभिव्यक्ति में कमी आई भारी लोहे के चयापचय के लिए समृद्ध थे. यह हस्ताक्षर प्रत्येक युक्ति विन्यास के विभिन्न धातु संरचना को प्रतिबिंबित कर सकते हैं: Sixfors तंत्र संस्कृति में डूबे एक धातु प्ररित करनेवाला और वातन विधानसभा शामिल है, और मीडिया पहले से इस्तेमाल किया carboys भी धातु हार्डवेयर की आवश्यकता है. ministat स्टेनलेस स्टील की सुई है, लेकिन कोई अन्य धातु घटकों का उपयोग किया जाता है. वृद्धि की अभिव्यक्ति के साथ जीन कोशिका झिल्ली के साथ काफी हद तक जुड़े थे, हालांकि इस संघ के जैविक महत्व स्पष्ट नहीं है.

अंत में, हम प्रयोगात्मक विकास unde का परीक्षणr इन शर्तों. सल्फेट सीमित विकास के 250 पीढ़ियों के बाद, 4/4 4 स्वतंत्र उभरती आबादी से परीक्षण किया क्लोन SUL1 के प्रवर्धन के रूप में दिखाया सरणी तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (CGH, चित्रा 2C) से पता चला. इस परिणाम समान समय अंतराल पर बड़ी मात्रा chemostats में निष्कर्षों के साथ संगत है 10.

चित्रा 1
चित्रा 1 ए डिजाइन और ministat सरणी की व्यवस्था संस्कृति चैम्बर के बी डिजाइन.

चित्रा 2
चित्रा 2. ए Experimental कि संस्कृतियों दिखा डेटा विकास के दस पीढ़ियों (n = 16) के भीतर संतुलन तक पहुँचने बी तीन स्थिर अवस्था के दौरान जैविक नमूना S1 तीन एक आम मिलान सल्फेट सीमित Sixfors chemostat हो संदर्भ के लिए तुलना replicates लिए सल्फेट सीमा के तहत अभिव्यक्ति डेटा. सी.. SUL1 amplifications एक सल्फेट सीमित वातावरण में 250 विकास की पीढ़ियों बाद ministats में बरामद किया. CGH द्वारा पैतृक डीएनए प्रत्येक विकसित क्लोन से जीनोमिक डीएनए की तुलना में किया गया था के रूप में वर्णित 21 मीन प्रतिलिपि संख्या प्रवर्धित प्रत्येक क्षेत्र के लिए गणना की गई और है प्रत्येक amplicon अगले दिखाया. सभी माइक्रोएरे डेटा भू डेटाबेस में GSE36691 परिग्रहण के तहत जमा कर रहे हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

खेती, Chemostat ministats में के रूप में किसी भी chemostat साथ, विस्तार और मुसीबत शूटिंग के लिए ध्यान देने की आवश्यकता है. चूंकि संदूषण निरंतर संस्कृति प्रयोगों में बड़ी चिंता का विषय है, हम आम तौर पर टीका पर बैक्टीरियल और फंगल प्रदूषण और लंबी अवधि के विकास के प्रयोगों के दौरान हर 50 पीढ़ियों के लिए माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखो. हम तारीख करने के 96 विकास प्रयोगों भर में 300 से अधिक पीढ़ियों (नहीं दिखाया डेटा) के प्रदूषण को नहीं मनाया है. रोगाणुओं के लिए ministats और संभावित प्रवाह लाइन के माध्यम से संस्कृति कक्ष उपनिवेश के बीच पार संदूषण के लिए परीक्षण करने के लिए हम 16 ऐसी है कि हर दूसरे ministat ऊपर के रूप में खमीर और शेष किसी भी संस्कृति के साथ नहीं inoculated थे साथ inoculated था ministats भागा. संस्कृतियों एक सांप्रदायिक अपशिष्ट कंटेनर है, जो हर दूसरे दिन खाली कर दिया गया था में जांचा गया. इस प्रकार अगर यह संभव हो गया के लिए contaminants प्रवाह लाइन के माध्यम से प्रवेश करने के लिए हम संभावना देखा होगा कि इस experim मेंईएनटी. तीन सप्ताह के दौरान और संस्कृतियों inoculated और गैर inoculated हम गैर inoculated ministat संस्कृति ट्यूबों में वृद्धि का पालन नहीं किया इस बिसात पैटर्न में वृद्धि के 100 से अधिक पीढ़ियों, सुझाव है कि बाहर खमीर या अन्य रोगाणुओं से संक्रमण के प्रयोगों में होने की संभावना नहीं है इसी तरह समय फ्रेम.

हालांकि ministats लिए एक वाणिज्यिक chemostats अनुरूप फैशन में काम करने के लिए डिजाइन किए गए थे, इस व्यवस्था के मॉड्यूलर प्रकृति के अनुकूलन के लिए उपयोगकर्ताओं की जरूरत है और बजट को फिट करने के लिए अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप 0.0186 वॉल / घंटा वॉल 3.6 / घंटा (नहीं दिखाया डेटा) के बीच प्रवाह दर को हासिल कर सकते हैं. कमजोर पड़ने दरों की वृद्धि पर नियंत्रण वैकल्पिक पंप मॉडल के साथ प्राप्त किया जा सकता है. ध्यान दें कि कमजोर पड़ने कम दरों पर आपरेशन के एक उच्च गेज सुई के प्रतिस्थापन की आवश्यकता के लिए छोटी बूंद वितरण का एक ही आवृत्ति को प्राप्त कर सकते हैं. जनसंख्या आकार विकास प्रयोगों के उचित डिजाइन के लिए एक महत्वपूर्ण विचार है.मानक कमजोर पड़ने दर और पोषक तत्वों की एकाग्रता यहां इस्तेमाल किया प्रकाशित विकास अध्ययन के रूप में परिमाण के एक ही आदेश के एक अपेक्षाकृत बड़ी जनसंख्या के आकार प्रदान करता है (~ 10 9 कोशिकाओं) 11 बड़े या छोटे आबादी काम कर रहे मात्रा बदल या पोषक तत्व एकाग्रता सीमित द्वारा बनाए रखा जा सकता है. बढ़ उत्परिवर्तन की आपूर्ति भी बुलंद उत्परिवर्तन दरों के साथ उपभेदों के साथ काम करके प्राप्त किया जा सकता है.

ministats भी हमारे वर्तमान डिजाइन पर सुधार किया जा सकता है. उदाहरण के संघनन संस्कृति ट्यूब दीवारों पर जमा और बहुत एक गहरी waterbath, मशीन, या लगातार तापमान के कमरे का उपयोग करके कम किया जा सकता है कर सकते हैं. हालांकि clumping और सल्फेट सीमित संस्कृतियों में दीवार के विकास के लिए अपेक्षाकृत दुर्लभ हो सकता है, 300 (नहीं दिखाया डेटा) पीढ़ियों surfactants की एक किस्म के द्वारा 5/48 विकास प्रयोगों में प्रदर्शित होता है कि कम या देरी इस विशेषता में सहायता कर सकते हैं. घटना में है कि clumping पर्याप्त संस्कृति के साथ हस्तक्षेपमिश्रण, और वृद्धि आंदोलन तरीकों की संख्या को कम करने, प्रत्येक वायु पंप विभाजित है या एक भावप्रवण तंत्र जोड़कर प्राप्त किया जा सकता है. अतिरिक्त जांच भंग गैस एकाग्रता, पीएच, या अन्य मानकों के लिए भी कुछ अन्य डिजाइन के रूप में शामिल किया जा सकता है, 17.

संभावित संशोधनों के बावजूद, के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित ministats का उपयोग कर, हम अत्यधिक लगातार प्रयोगात्मक मानकों और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम मनाया जब बड़ी मात्रा वाणिज्यिक chemostats लिए रिपोर्ट डेटा हमारे डिवाइस की तुलना. यह reproducibility सेलुलर फिजियोलॉजी के 10-15 पीढ़ियों (2A चित्रा) के भीतर स्थिर राज्य संतुलन तक पहुँचने और संतुलन में इसी तरह की संस्कृति घनत्व प्राप्त करने के माध्यम से देखा के रूप में शामिल है. जीन अभिव्यक्ति पैटर्न तीन जैविक ministats में replicates के पार और ministats और वाणिज्यिक बड़ी मात्रा प्लेटफार्मों (चित्रा 2B) के बीच लगातार लोहे के चयापचय जीन के अपवाद के साथ थे. ये ऍक्स्पression मतभेद की संभावना दो उपकरणों या मीडिया सामग्री की गुणवत्ता में सुधार के धातु सामग्री में परिवर्तन की वजह से कर रहे हैं. हमारे आंकड़े बताते हैं कि ministats फिजियोलॉजी या प्रतियोगिता प्रयोगों जहां एक सुसंगत वातावरण की आवश्यकता है के लिए उपयोगी होगा.

करने के लिए अगर ministat डिजाइन हम 250 पीढ़ियों के लिए सल्फेट सीमा के तहत संस्कृतियों विकसित और CGH इस्तेमाल को SUL1 लोकस में प्रवर्धन विशेषताएँ प्रयोगात्मक विकास अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त है परीक्षण इन शर्तों के तहत बड़ी मात्रा chemostats में लंबी अवधि के विकास की एक बानगी 10 हम मनाया SUL1 4/4 सल्फेट सीमित मीडिया में स्वतंत्र विकास प्रयोगों (चित्रा 2C) से क्लोन में प्रवर्धन. एक पूरे के रूप में लिया ये आंकड़े बताते हैं कि ministats एक मजबूत मंच है कि पारंपरिक chemostat अनुप्रयोगों के एक किस्म के लिए उपयोगी हो सकता है. हालांकि हम नवोदित खमीर संवर्धन में उनके उपयोग का प्रदर्शन करना चाहिए, ministatsवास्तव में भी अन्य जीवों और इसी तरह के डिजाइन के साथ संगत किया जा संवर्धन बैक्टीरिया और अन्य खमीर प्रजातियों के लिए 16,17,25 इसके अलावा छोटे संस्कृति मात्रा और सहसंबद्ध मीडिया के लिए कम की जरूरत का उपयोग किया. ministats की आवश्यकता होती है प्रयोगों के लिए एक आकर्षक विकल्प हो सकता है महंगा या विदेशी अभिकर्मकों के रूप में रासायनिक या आनुवंशिक स्क्रीन में मामला हो सकता है.

Disclosures

लेखकों को घोषणा की कि वे ब्याज की कोई संघर्ष है.

Acknowledgements

वीडियो का निर्माण अनुसंधान संसाधन के लिए राष्ट्रीय केंद्र (5P41RR011823 17) और जनरल मेडिकल साइंसेज के राष्ट्रीय संस्थान (8 p41 GM103533 17) स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. यह काम भी NSF 1120425 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. MJD एक रीता एलन फाउंडेशन विद्वान है. AWM हिस्सा में NIH HG00035 T32 द्वारा समर्थित है. हम प्रोटोकॉल में सुधार के साथ सहायता के लिए अन्ना सनशाइन धन्यवाद. इसके अतिरिक्त, हम सारा DiRienzi, सेलिया Payen, और एमी Sirr ministats के प्रारंभिक उपयोगकर्ता के रूप में स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3/32" x 7/32" silicone tubing VWR 63009-260 Tubing: Order: (50' coil pack)
1/2" x 5/8" silicone tubing (extra large) VWR 63009-299 Tubing: Order: (50' coil pack)
1/4" x 3/8" silicone tubing (medium) VWR 63009-279 Tubing: Order: (50' coil pack)
Orange green marprene pump tubing Watson-Marlow 978.0038.00+ Tubing: Order: 6x(pack of 6)
Female luer, 1/8" barb Cole Parmer HV-45500-04 Connectors: Order: 4x(pack of 25)
Male luer lock, 1/8" barb Cole Parmer HV-45503-04 Connectors: Order: 1x (pack of 25)
Reducing connector, PVDF, 1/4" to 1/8" Cole Parmer EW-30703-50 Connectors: Order: 1x (pack of 10)
Barbed Y connector, 1/8" ID Cole Parmer HV-30703-92 Connectors: Order: 3x(pack of 10)
Medium tubing clamps VWR 63022-405 Clamps: Order: 1x(pack of 12)
Day Pinchcock (metal clamp for tubing) VWR 21730-001 Clamps: Order: 1x(pack of 10)
Male inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. Fisher 05-112-39 Connectors: Order: 1x(pack of 25)
Female inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. I.D.,Polypropylene Fisher 05-112-37 Connectors: Order: 1x(pack of 5)
Silent Air Pumps Aquarium Guys.com 212422 Air Supply: Order: 4 pumps
PTFE filters, 0.45 μm, for air filtration Cole Parmer HV-02915-22 Air Supply: Order: 1x(box of 100)
1L Flask with sidearm Fisher 10-181F Air Supply: Order: 2x(Pack of 6)
#8 silicone stopper, 3/8 in hole, for sidearm flasks Fisher K953715-0801 Air Supply: Order: 8 stoppers
4-Port manifold Cole Parmer EW-06464-85 Air Supply: Order: 8 manifolds
55 ml Screw cap culture tubes Corning Life Sciences 9825-25 Culture Chamber: Order: 2x(pack of 48)
Regular hypodermic white hub needle, 16G, 5 in. length for effluent line Fisher 14-817-105 Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100)
Spinal tap needle VWR BD40836 Culture Chamber: Order: 4x(pack of 10)
Regular hypodermic pink needle Fisher 14-817-104 Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100)
Foam Silicone stopper size "2", pink Cole Parmer EW-06298-06 Culture Chamber: Order: 2x(pack of 20)
8-Well tube Rack VWR 82024-452 Culture Chamber: Order: 4 racks
10L Reservoir bottle with bottom hose outlet: vacuum safe VWR 89001-530 Media: Order: 2 or more
Yellow foam silicone stopper, non-standard size 12 Cole Parmer EW-06298-22 Media: Order: 2 or more
Carboy Venting Filter Fisher SLFG 050 10 Media: Order: 1x(pack of 10)
Electrical tape, green Amazon.com 10851-BA-10 Media: Order 1 roll.
Bottle top filter, 1L, .2 μm, 45 mm VWR 29442-978 Media: Order: (1 case of 12)
5000 ml Reservoir bottle with bottom outlet: vacuum safe VWR 89003-384 Media: (Optional)
Blue Foam Silicone stopper, nonstandardsize 10 1/2 Cole Parmer EW-06298-18 Media: (Optional)
205S/CA16, 16 Cartridge pump Watson-Marlow 020.3716.00A Media Pump: Order: 1
16-channel 205CA Extension pump head Watson-Marlow 023.1401.000 Media Pump: Order: 2 extension pump heads
Silicone aquarium sealer Fisher S18180B Media Pump: Order: 1
6-block dry bath VWR 12621-120 Heatblock: Order: 2 for 32 ministats or 1 for 16.
Block for drybath, 6 x 25 mm test tube per block VWR 12621-120 Heatblock: Order: 12 for 32 ministats or 6 for 16.
Nylon Membrane Filters, 0.45 μm Pore Size; Dia.: 25 mm Fisher R04SP02500 Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional)
Nylon Membrane Filters,0.45 μm Pore Size; 45 mm Fisher R04SP04700 Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional)
47 mm, large filter apparatus Fisher XX10 047 30 Harvesting: Order: 1 (optional)
Glass filter holder, 25 mm, small filter apparatus VWR 26316-692 Harvesting: Order: 1 (optional)
Dewar flask, 1L for Liquid Nitrogen VWR 63380-052 Harvesting: Order: 1 (optional)

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References

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Comments

3 Comments

  1. Our more detailed lab manual for building and running the ministats is also posted on my lab website:
    http://dunham.gs.washington.edu/protocols.shtml
    We'd love to hear from anyone who builds a set, especially if you improve on our design!

    Reply
    Posted by: Maitreya D.
    March 1, 2013 - 4:28 PM
  2. This is great! I was about to email you and ask about small chemostats (I used to run chemostat experiments for F Rosenzweig, so I know about those custom-blown glass babies!). I'll be building a set of these ministats to use in experiments with Chlamydomonas reinhardtii. Have you had any problems with the effluent needle clogging, or with back growth up the needle? Since the vessel is under slight positive pressure, I guess that I could clean the exterior of the needle every so often with EtOH -- this is going to be a very long long experiment!

    Heidi Kuehne, U Edinburgh

    Reply
    Posted by: Heidi K.
    August 26, 2013 - 9:43 AM
  3. Hi Heidi. I'm excited you're building a setup for Chlamydomonas! We have not had backflow problems, as long as the pump head is fastened down. You do need to clamp the media lines if you are loosening the pump heads. However, we have had growth in the needle on occasion (never on the exterior of the needle). One nice thing is that the setup is modular, so if it happens, you can just swab the cork with ethanol and swap in another piece of sterile tubing with a new needle. However, for yeast, line growth is highly correlated with the evolution of clumping/wall growth, so we do get recolonization at some frequency. We have not gotten effluent needle clogging, even with cultures that evolve large clumps, and we have never seen back-contamination via the effluent lines. The air flow seems to be sufficient to empty the line efficiently and keep it cleared. Let me know if you have any other questions, and I'd love to hear how it turns out. Good luck!

    Reply
    Posted by: Maitreya D.
    August 26, 2013 - 4:31 PM

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