Étiquetage immunologique post-enrobage des protéines synaptiques dans l'hippocampe cultures Slice

Neuroscience

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Summary

La localisation et la distribution des protéines fournissent des informations importantes pour la compréhension de leurs fonctions cellulaires. La résolution spatiale supérieure de la microscopie électronique (EM) peut être utilisé pour déterminer la localisation subcellulaire d'un antigène donné à la suite immunohistochimie. Pour les tissus du système nerveux central (SNC), la préservation de l'intégrité structurelle tout en maintenant antigénicité a été particulièrement difficile en EM études. Ici, nous adoptons une procédure qui a été utilisée pour préserver les structures et les antigènes du système nerveux central d'étudier et de caractériser les protéines synaptiques dans l'hippocampe de rat neurones pyramidaux CA1.

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Zhong, L., Brown, J. C., Wells, C., Gerges, N. Z. Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures. J. Vis. Exp. (74), e50273, doi:10.3791/50273 (2013).

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Abstract

Immunoélectromicroscopie est un outil puissant pour étudier les molécules biologiques au niveau subcellulaire. Anticorps couplés à des marqueurs denses aux électrons tels que l'or colloïdal peut révéler la localisation et la distribution des antigènes spécifiques dans différents tissus 1. Les deux techniques les plus utilisées sont des techniques de pré-enrobage et de post-intégration. En pré-enrobage immuno-microscopie électronique (EM) techniques, le tissu doit être perméabilisées pour permettre la pénétration d'anticorps avant d'être embarqué. Ces techniques sont idéales pour la préservation des structures, mais la faible pénétration de l'anticorps (souvent, seuls les quelques premiers micromètres) est un inconvénient considérable 2. Les méthodes de marquage post-enrobage peut éviter ce problème, parce que l'étiquetage se fait sur des coupes de tissus fixes où les antigènes sont plus facilement accessibles. Au fil des ans, un certain nombre de modifications ont permis d'améliorer les méthodes de post-enrobage à améliorer l'immunoréactivité et de préserver l'ultrastructure

La fixation des tissus est un élément essentiel des études EM. Fixateurs chimiquement réticuler les macromolécules pour verrouiller les structures tissulaires en place. Le choix du fixateur affecte non seulement la préservation mais aussi structurelle antigénicité et le contraste. Tétroxyde d'osmium (OsO 4), le formaldéhyde et le glutaraldéhyde ont été les fixateurs standards depuis des décennies, y compris pour le système nerveux central (SNC) des tissus qui sont particulièrement exposés à des dommages structurels au cours de traitement chimique et physique. Malheureusement, OsO 4 est très réactif et a été montré pour masquer les antigènes 6, résultant en mauvais étiquetage et insuffisante. Des approches alternatives pour éviter la fixation chimique comprennent le gel des tissus. Mais ces techniques sont difficiles à réaliser et nécessitent des instruments coûteux. Pour résoudre certains de ces problèmes et d'améliorer l'étiquetage des tissus du système nerveux central, Phend et al. remplacé OsO 4 avec de l'acétate d'uranyle (UA) et tannique acid (TA), et introduit avec succès des modifications supplémentaires pour améliorer la sensibilité de détection de l'antigène et de préservation de structure dans le cerveau et les tissus de la moelle épinière 7. Nous avons adopté cette osmium sans post-intégration méthode aux tissus du cerveau de rat et d'optimiser la technique de marquage immunologique pour détecter et étudier les protéines synaptiques.

Nous présentons ici une méthode pour déterminer la localisation ultrastructurale des protéines synaptiques dans l'hippocampe de rat neurones pyramidaux CA1. Nous utilisons organotypiques d'hippocampe en culture tranches. Ces tranches de maintenir le circuit trisynaptic de l'hippocampe, et sont donc particulièrement utiles pour l'étude de la plasticité synaptique, un mécanisme largement considéré comme sous-tendent l'apprentissage et la mémoire. Organotypiques de coupes d'hippocampe postnatales jour 5 et 6 souris / rat chiots peuvent être préparés comme décrit précédemment 8, et sont particulièrement utiles pour effet de choc aiguë ou surexpriment les protéines exogènes. Nous avons déjà utilisé ce protocole pour characterize neurogranine (Ng), une protéine spécifique des neurones avec un rôle critique dans la régulation de la fonction synaptique 8,9. Nous avons aussi utilisé pour caractériser la localisation ultrastructurale de la calmoduline (CaM) et Ca 2 + / CaM-dépendante protéine kinase II (CaMKII) 10. Comme le montrent les résultats, ce protocole permet une bonne préservation ultrastructurale des épines dendritiques et d'étiquetage efficace de Ng pour aider à caractériser sa distribution dans la colonne 8. En outre, la procédure décrite ici peut avoir une large applicabilité dans l'étude de nombreuses autres protéines impliquées dans les fonctions neuronales.

Protocol

1. Fixation

Fixateurs sont cancérigènes, porter des gants et manipuler les fixateurs dans une hotte. Sauf indication contraire, toutes les incubations sont effectuées sur la glace et toutes les solutions doivent être filtrés avant utilisation. Utilisez la microscopie électronique réactifs de qualité.

Jour 1

  1. Après conditions expérimentales (par exemple, injection virale, le traitement médicamenteux), placez la membrane avec organotypiques coupes d'hippocampe dans un 60 x 15 mm boîte de Petri en polystyrène contenant glacée phosphate 0,1 M de tampon (tampon phosphate de Sorensen), pH 7,3. Ajouter 1 à 2 ml de tampon phosphate 0,1 M directement sur le dessus des tranches de les garder au froid.

ÉTAPE CRITIQUE: Utilisez toujours fraîchement préparés tampons et fixateurs. Assurez-vous que le pH du tampon est dans la plage souhaitée. A défaut de le faire pourrait endommager les structures cellulaires.

  1. Pour isoler le sous-champ CA1 de la tranche, utilisez unscalpel jetable en douceur couper à travers la tranche suivante à la DG, parallèlement à la couche CA1 cellule (figure 1). Ensuite, couper la tranche restante à la verticale pour enlever le sous-champ CA3 et le subiculum. Couper un coin de la tranche d'aider à identifier la surface supérieure du tissu.

REMARQUE: En cas pas de livraison virale de la protéine d'intérêt est nécessaire, la tranche de tissu ensemble peut être fixé après que les médias est enlevée avec un rinçage délicat de tampon glacé. Cette étape est suivie par découpage de la CA1.

ÉTAPE CRITIQUE: Gardez la trace de la face supérieure du tissu afin de sectionnement adéquate des grilles plus tard.

  1. Enlever soigneusement le tissu de la membrane à l'aide de la face arrière du scalpel. Utiliser une pipette Pasteur en douceur transférer le tissu sur une plaque à 12 puits contenant 0,1 M de tampon phosphate.
  2. Retirer le tampon dans le puits de la plaque et ajouter 500 m etu, L - 1 ml de fixatif glacé (pH 7,3) constituées des éléments suivants: 0,1% d'acide picrique, du paraformaldéhyde à 1%, et 2,5% de glutaraldéhyde dans un tampon phosphate 0,1 M. Incuber pendant 2 heures à 4 ° C.

REMARQUE: L'acide picrique peut être explosif à l'état sec. Gardez-le mouillé avec de l'eau dans un récipient hermétiquement fermé. Conserver dans un endroit sec et bien aéré.

  1. Retirer le fixateur du puits et laver les échantillons 3 fois (20 min chacun) dans 0,1 M de tampon phosphate.
  2. Incuber pendant 40 min dans de l'acide tannique à 1% (p / v) dans 0,1 M de tampon maléate pH 6,0.
  3. Rincer deux fois (20 min chacun) dans un tampon maléate.
  4. Incuber pendant 40 min dans de l'acétate d'uranyle 1% (p / v) dans du tampon maléate dans l'obscurité. L'acétate d'uranyle est sensible à la lumière et est radioactif. Couvrir le bécher avec du Parafilm lors de la dissolution et de stocker n'importe quel tampon utilisé dans l'obscurité à 4 ° C.
  5. Rincer deux fois (20 min chacun) dans un tampon maléate.
  6. Incuber pendant 20 min dans du chlore de platine de 0,5%IDE (p / v) dans du tampon maléate.
  7. Rincer deux fois (20 min chacun) dans un tampon maléate. Conserver les échantillons à 4 ° C jusqu'à ce qu'ils soient prêts pour un traitement ultérieur.

2. La déshydratation et la Embedding

L'oxyde de propylène est cancérigène. Éviter les vapeurs en travaillant avec lui dans une hotte. Utilisez absolue, l'éthanol pur à 100% qui ne contient aucune trace d'eau. Diluer cette éthanol absolu pour produire des concentrations différentes de déshydratation.

Jour 2

  1. Incuber pendant 5 min dans de l'éthanol 50% puis pendant 5 min dans de l'éthanol à 70%.
  2. Incuber pendant 15 min à 1% fraîchement préparée p-phénylènediamine (PPD) dans l'éthanol à 70%.
  3. Rincer trois fois dans de l'éthanol à 70%.
  4. Incuber pendant 5 min dans de l'éthanol 80% puis pendant 5 min dans de l'éthanol à 95%.
  5. Incuber dans l'éthanol à 100% deux fois 5 min à chaque fois.
  6. Préparer des flacons en verre avec bouchon à vis et assurez-vous qu'ils sont propres et sèches. Transfert tranches de flacons en verre etétiqueter chaque flacon simple et claire.
  7. Incuber pendant 5 min dans un mélange 1:1 éthanol: l'oxyde de propylène.
  8. Incuber dans l'oxyde de propylène à 100% deux fois 5 min à chaque fois.
  9. Ajouter de la résine (Epon) dans chaque flacon pour faire un mélange 1:1 avec de l'oxyde de propylène. Mélanger doucement pendant 2 heures. Ne pas secouer les flacons avec trop de rigueur pour éviter les bulles qui pourraient interférer avec encastrement.
  10. Ajouter de la résine pour faire un mélange 3:1 avec l'oxyde de propylène, et mélanger pendant 2 heures.
  11. Transfert à la résine 100% et incuber O / N.

Jour 3

  1. Échantillons en sandwich entre des bandes de plastique ACLAR et la guérison de 24 heures à 60 ° C.

3. La coupe et de montage sur les grilles

Jour 4

  1. Couper semi-fines (0,5 um) sections et colorer avec 1% de bleu de toluidine + 1% de borax pour déterminer l'orientation correcte des échantillons.
  2. Couper coupes ultrafines (60 nm) et monter sur des grilles de nickel, une section par grille.

4. Immunohistochimie

Tous les tampons et l'eau doit être filtrée avant utilisation.

Jour 5

  1. Déposer une goutte (~ 50 pi) de tampon Tween-20/phosphate 1% (T / PB), pH 7,5, sur un morceau de parafilm propre sur une surface plane. Délicatement ramasser la grille avec des pinces propres par le bord et le faire flotter sur le tampon, la section vers le bas, et incuber pendant 10 min à température ambiante.
  2. Égoutter l'excès de liquide de la grille en plaçant côté de la partie sur un papier filtre puis flotter sur la glycine 50 mM dans T / PB pendant 15 min à température ambiante.

ÉTAPE CRITIQUE: Pour éviter de trop «report» de solutions d'une gouttelette de solution à l'autre au cours des incubations, les égoutter l'excès de liquide par un léger toucher le bord de la grille n ° 1 sur du papier filtre entre chaque changement de solution. Également éliminer toute solution emprisonnée entre les branches de l'EM Pince de maintien de la grille par effet de mèche doucement avec un ruban de papier-filtre entre les branches de pince tout en ENSUsonner les sections ne se dessèchent pas complètement.

  1. Séchez la grille avec du papier filtre, puis flotter sur une solution de blocage contenant de la BSA 2,5% et 2,5% de sérum de l'animal de l'anticorps secondaire dans T / PB pendant 30 min à température ambiante.
  2. Incuber avec l'anticorps primaire (en T / PB) à la température ambiante ou O / N à 4 ° C. Le temps optimal et la température d'incubation, ainsi que la concentration d'anticorps, doivent être déterminées expérimentalement.
  3. Laver la grille à trois reprises (2 min chacun) avec T / PB.
  4. Incuber avec l'anticorps secondaire (1:20 anti-lapin ou anti-souris couplé à 10 nm d'or) pendant 1 heure à température ambiante.
  5. Laver trois fois (2 min chacun) avec T / PB.
  6. Postfix avec le glutaraldéhyde à 2% en T / PB pendant 5 min.
  7. Laver trois fois (2 min chacun) avec T / PB et ensuite trois fois (2 min chacun) avec de l'eau filtrée.
  8. Incuber avec de l'acétate d'uranyle 2% dans de l'eau pendant 10 min.

Alors que la grille est la coloration, préparer une émission de CO 2 par chambre Placinpar pièce de Parafilm au centre d'un plat en verre de Pétri. Puis placer 4-6 pastilles de NaOH dans le plat autour du Parafilm à absorber le CO 2 dans l'air. Gardez le couvercle fermé pendant quelques minutes. Utiliser une pipette Pasteur et de transférer rapidement un petit volume de solution de citrate de plomb de Reynolds à l'Parafilm dans le plat en verre de Pétri. Ouvrez le haut juste assez pour insérer la pipette Pasteur afin de minimiser la réintroduction de CO 2 dans la chambre.

REMARQUE: Pour faire une solution de Reynolds citrate de plomb, faire bouillir 100 ml d'eau déminéralisée dans un four à micro-ondes et laisser refroidir dans un récipient hermétique. Dans un ballon volumétrique de 50 ml avec bouchon, mélange de nitrate de plomb 1,33 g, 1,76 g de citrate de sodium et 30 ml de l'eau bouillie en agitant vigoureusement pendant 1 min. Puis serrer de façon intermittente pendant 30 min. A cette solution trouble, ajouter 8 ml d'hydroxyde de sodium 1 M et lentement inverser le flacon plusieurs fois. Solution deviendra clair. Porter la solution à 50 ml avec le wa bouillieter. Conserver la solution hermétiquement fermés. Si un précipité apparaît, le jeter et en faire une nouvelle.

  1. Dans trois béchers petits préparer de l'eau chaude bouillante désionisée. Laver l'acétate d'uranyle par trempage de la grille dans le premier bécher et doucement tourbillonner autour pendant 30 sec. Répétez cette étape pour les deux autres béchers.
  2. Ouvrez la partie supérieure de la boîte de Petri en verre juste assez pour placer la grille sur la goutte de solution de Reynolds citrate de plomb. Si possible, portez un masque tout en faisant ceci pour éviter de respirer le citrate de plomb et d'empêcher la formation d'un précipité. Incuber pendant 10 min.
  3. Ouvrez le haut juste assez pour retirer la grille. Éviter de respirer sur le citrate de plomb. Laver la grille à trois reprises en le plongeant successivement dans trois béchers avec de l'eau chaude distillée fraîchement bouillie. Laissez sécher la grille sur un morceau de papier filtre, section vers le haut. L'échantillon est maintenant prêt pour le microscope électronique.

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Representative Results

La figure 2B représente un exemple de la distribution des molécules endogènes Ng à épines dendritiques des neurones pyramidaux CA1 hippocampique. Grilles de nickel avec ultrafines (60 nm) tissus contenant la région CA1 de l'hippocampe (comme on le voit sur ​​la figure 2A) étaient couverts de 1% T / PB, 50 mM de glycine, puis bloquées avec de la BSA 2,5% et 2,5% de sérum avant l'incubation avec des anticorps anti Ng-anticorps. Après lavage avec T / PB, les grilles ont ensuite été recouvert de lapin anti-anticorps secondaire couplé à 10 nm d'or. Enfin, les grilles ont été lavées avec T / PB et post-fixes avec glutaraldéhyde à 2%, suivi par l'acétate d'uranyle 2% et citrate de plomb Reynold coloration pour augmenter le contraste. Gauche, micrographies électroniques représentatifs montrant des synapses asymétriques. Identification du compartiment post-synaptique est facilitée par le PSD denses aux électrons (tête de flèche) et la membrane plasmique bien défini. A droite, la distance la plus courte entre chaque Ng (flèches) et la membrane plasmique n'a pasrmalized au rayon de la colonne vertébrale. Ng molécules dans la colonne vertébrale (mais pas au PSD) présentent une localisation préférentielle à la membrane plasmique. Cet histogramme a été initialement publié dans le Journal EMBO 8.

Figure 1
Figure 1. Schéma de dissection zone CA1 de l'hippocampe les cultures tranche. Après un traitement expérimental pour la tranche, le traitement médicamenteux par exemple, ou une infection virale, la membrane contenant la tranche a été placée dans un tampon phosphate glacée. La tranche a été coupé horizontalement sous le gyrus denté (DG), parallèle à la couche CA1 cellule. Le sous-champ CA1 a ensuite été isolé en éliminant le sous-champ CA3 et le subiculum (sous-). Pour aider à identifier la surface supérieure du CA1, un coin a été coupé pour orienter le tissu (dans ce cas, la partie supérieureà droite).

Figure 1
Figure 2. L'étiquetage des immuno neurogranine au CA1 synapses dans l'hippocampe culture organotypique de tranche. (A) micrographies électroniques à transmission montrant la zone CA1 de l'hippocampe et le rat des synapses. Dendrites (d) de neurones pyramidaux CA1 sont faciles à distinguer. Identification des synapses asymétriques entre le terminal axonal 9t) et des épines dendritiques (s) est facilitée par la présence de la densité post-synaptique (PSD, tête de flèche) et la membrane plasmique bien défini. (B) Répartition des neurogranine (Ng) dans les épines dendritiques. gauche, micrographies électroniques à transmission montrent immuno-EM étiquetage des nG (flèches). Pour la quantification, la distance de chaque particule d'or (à l'exclusion de ceux PSD, tête de flèche) de la membr plasmaane est normaliser (axe x) et le rayon de la colonne vertébrale. Par conséquent, 0 correspond à une particule se trouvant sur ​​la membrane et 1 à une particule se trouvant au centre de la colonne vertébrale. Droite, une répartition aléatoire (rose) est généré en utilisant un générateur de nombre aléatoire macro (Microsoft Excel) dans une colonne en forme de surface. Ng (bleu) montre le pic le plus élevé de distribution à proximité de la membrane plasmique. La barre d'échelle, à 200 nm. Cet histogramme a été initialement publié dans le Journal EMBO 8.

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Discussion

Dans ce protocole, nous avons adopté la méthode Phend et Weinberg pour le cerveau et les tissus de la moelle épinière pour étudier épines dendritiques dans les cultures rat tranche d'hippocampe. Épines dendritiques dans l'hippocampe CA3-CA1 région sont délicates structures contenant une grande variété de protéines qui jouent un rôle important dans la régulation des fonctions neuronales. La méthode présentée permet une approche équilibrée pour atteindre antigénicité accrue tout en conservant une bonne préservation ultrastructurale (figure 2A), ce qui permet l'efficacité d'étiquetage raisonnable et une bonne reproductibilité utile pour caractériser la distribution des antigènes spécifiques à l'intérieur de la colonne vertébrale. Ici, nous avons appelé Ng à 10 nm d'or colloïdal. Nous avons ensuite quantifié l'or pour générer modèle de l'étiquetage des Ng qui a aidé à comprendre son rôle dans la fonction synaptique (figure 2B) 8.

L'analyse quantitative de immunologique peut être fait dans une variété de façons 11-13 14-17.

Le remplacement de l'osmium par TA, UA, et p-phénylènediamine (PPD) dans cette approche grandement amélioré la sensibilité de détection de l'antigène dans les tissus neuronaux par rapport aux méthodes précédentes 7. L'utilisation de formaldéhyde et de glutaraldéhyde et assure la conservation de structure de rétention de petits antigènes solubles tels que les acides aminés. Époxy à base de résines acryliques, plutôt que de résines plastiques, assurent une meilleure stabilité pour l'enrobage sous le faisceau d'électrons sans compromettre antigénicité 7. Par rapport à la norme d'osmium protocole, Phend et al. </ Em> avait montré que l'AT, AU, et le PPD a également amélioré la préservation structurelle (voir la figure 1 de l'article Phend d'origine) 7, et que immunocoloration efficace a été trouvée pour plusieurs protéines, y compris la substance P, la calcitonine gene-related peptide (CGRP), l'acide sous-unité de récepteur AMPA 1 (GluA1), et la gamma-aminobutyrique (GABA) 7. Ces résultats démontrent la capacité de cette procédure pour étudier différentes protéines dans les tissus neuronaux. Un autre avantage de cette méthode est que l'AT, AU et PPD sont faciles à préparer et à manipuler, et posent beaucoup moins dangereuses que les risques d'osmium, qui est extrêmement volatil et très toxique par inhalation et par contact avec la peau.

Une limitation de cette méthode est que, même si elle préserve et conserve antigènes de petite taille tels que les acides aminés, il ne montre pas immunomarquage améliorée pour ces molécules par rapport au traitement conventionnel osmium. L'avantage du chlorure de platine métal lourd pour préserver structure et d'améliorer l'immunoréactivité semble également être limitée à la moelle épinière, pour des raisons qui ne sont pas complètement élucidés 7. Bien que la méthode d'osmium sans antigénicité et améliore le contraste des tissus, il ne semble pas bien fonctionner pour la préservation des autres structures telles que des vésicules présynaptiques (voir Figure 2). En outre, Phend et al. Ont observé que l'absence d'osmium a également entraîné une réduction de myéline préservation, TA a pénétrabilité limitée dans les composants intracellulaires de préserver les membranes 7. Pour ces raisons, les méthodes de congélation pour la préparation des échantillons peut être de meilleures alternatives si la préservation ultrastructurale est la préoccupation la plus importante. Congélation ultrarapide de l'échantillon permet la préservation des molécules d'une manière plus naturelle 18, sans artefacts qui pourraient être introduits par l'utilisation de fixateurs chimiques.

Avant d'effectuer l'EM, la présence d'l'antigène dans l'échantillon doivent être confirmés par des moyens tels que l'analyse par Western blot. Comme pour toutes les études immuno-marquage, l'interprétation correcte des données repose sur l'utilisation d'anticorps spécifiques appropriées,. Hautement purifiées des anticorps monoclonaux devraient toujours être utilisés s'ils sont disponibles. Des expériences de contrôle sont essentiels pour s'assurer que le modèle de l'étiquetage généré est due à l'interaction spécifique entre l'anticorps primaire et l'immunogène. La spécificité du marquage peut être testée en effectuant des contrôles positifs et négatifs. Par exemple, dans un contrôle négatif, l'anticorps primaire peut être remplacé par un sérum de contrôle indépendant de la non-immune IgG, sans modifier les autres étapes du protocole de coloration. D'autre part, une protéine qui est présente dans une cellule compartiment mais pas dans d'autres, peuvent être utilisés comme témoin positif. Par exemple au niveau des synapses glutamatergiques, PSD-95 est un marqueur post-synaptique alors que GAP-43 est principalement présent dans la terminaison présynaptique 19-22.Si l'étiquetage est visible lorsque l'anticorps primaire est omise ou dans des compartiments où la protéine est connue pour ne pas être présent, l'étiquetage n'est pas spécifique.

Une fois la spécificité de l'anticorps primaire est rigoureusement testée, il faut être conscient que les échantillons avec un bon étiquetage ne doit pas présenter de nombreux agglutination ou avoir des particules d'or excessives dans le contexte où aucun tissu est présent. Si la quantité d'or est trop élevée ou trop basse, régler le niveau et la durée de blocage, et la concentration d'anticorps en conséquence. Maunsbach et Afzelius fournir d'excellents exemples et des conseils pour immunomarquage 23.

Bonne conservation structurelle des échantillons permet d'éliminer les artefacts qui peuvent interférer avec la morphologie et fausser l'interprétation des données. Par conséquent, la préservation des structures supérieures illustré par cette méthode rend cette technique applicable à un certain nombre de tissus biologiques en particulier là où les structures délicates peuvent êtrefacilement déformés ou détruits pendant le traitement des échantillons. Par conséquent, en plus de organotypiques coupes d'hippocampe, cette méthode peut aussi être extrêmement utile pour d'autres préparations neuronales, y compris les tranches cérébraux aigus et des cultures primaires de neurones. Organotypiques coupes d'hippocampe sont facilement modifiable pour traitement de la toxicomanie et l'expression des protéines par une infection virale, qui peut être applicable pour l'étude de la plasticité synaptique hippocampique. Cette méthode est également utile d'examiner les effets de différentes conditions expérimentales sur la distribution des antigènes ou de la localisation dans le corps cellulaire, des dendrites, ou épines dendritiques. En outre, des particules d'or colloïdales ayant des tailles de 6, 10, 15 ou 25 nm sont disponibles, ce qui permet de réaliser l'étiquetage multiple sans chevauchement. Nous croyons que l'avantage de l'antigénicité accrue, la flexibilité de sondes et de la reproductibilité de l'étiquetage immunogold démontrer la puissance de cette technique pour étudier une variété d'antigènes. Il est potentiellement useful pour caractériser la localisation et la distribution des récepteurs, des récepteurs interagissant avec des protéines, des transporteurs, canaux ioniques et de nombreux autres tissus cérébraux différents, y compris le cortex, le thalamus, le cervelet et le bulbe olfactif.

En résumé, le présent protocole d'osmium libre, l'étiquetage immunologique post-intégration des cultures hippocampiques de rat tranche est un outil précieux pour étudier divers antigènes dans les épines dendritiques. Le potentiel d'application de cette méthode dans d'autres délicats tissus nerveux centraux sera très utile pour examiner les caractéristiques ultrastructurales de différentes molécules clés et d'aider à comprendre leur rôle dans les fonctions biologiques.

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Disclosures

Nous n'avons rien à déclarer.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Matthew Florence pour la préparation des cultures de tranches d'hippocampe. Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Institut national américain sur le vieillissement et l'Association Alzheimer NZG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 x 15 mm polystyrene Petri dish Falcon 351007
Disposable scalpel EXELINT 29552
Cell culture inserts Millipore PICM03050
10 nm Goat-anti-rabbit gold Electron Microscopy Sciences 25108
Anti-Neurogranin antibody Millipore AB5620
100% Picric acid Electron Microscopy Sciences 19550
96% Paraformaldehyde Acros Organics AC41678-0030
25% Glutaraldehyde (EM grade) Sigma G5882
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 22400
p-Phenylenediamine Sigma P6001
Platinum (IV) chloride Sigma 379840
Tannic acid Electron Microscopy Sciences 21710

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