لين العريكة التهابات خلايا الثدييات مع طفيل وحيد الخلية، تستعد البكتيريا

Published 4/02/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

هذه التقنية يوفر طريقة لجني، وتطبيع وقياس النمو داخل الخلايا من مسببات الأمراض البكتيرية التي تم مسبقا المزروعة في الطبيعية الخلايا المضيفة الأوالي قبل التهابات خلايا الثدييات. يمكن تعديل هذه الطريقة لاستيعاب مجموعة واسعة من الخلايا المضيفة للمرحلة فتيلة وكذلك أنواع الخلايا المستهدفة.

Cite this Article

Copy Citation

Drennan, S. L., Lama, A., Doron, B., Cambronne, E. D. Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria. J. Vis. Exp. (74), e50300, doi:10.3791/50300 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

العديد من مسببات الأمراض البكتيرية استخدام الخلايا الأوليات المياه العذبة الطبيعية كمستودع للانتشار في البيئة. الفيلقية المستروحة، العامل المسبب للالتهاب الرئوي يدجينيرز "، يسعى إلى اكتساب ميزة على الممرضة في المختبر البكتيريا مثقف عندما تحصد الأولى من الخلايا وحيدة الخلية قبل إصابة الضامة الثدييات. هذا يشير إلى أن هناك عوامل قد لا يمكن التعبير عنها الفوعة المهم بشكل صحيح في المختبر. قمنا بتطوير نظام للين العريكة L. فتيلة المستروحة من خلال المضيف الطبيعي الأوالي الشوكميبة castellanii قبل للإصابة خلايا الثدييات. يمكن فحص مساهمة أي عامل الفوعة بمقارنة النمو داخل الخلايا متحولة إلى سلالة البرية من نوع البكتيريا بعد فتيلة الأوالي. ، معربا عن GFP L. البرية من نوع ومتحولة وتستخدم سلالات المستروحة لتصيب monolayers الأوالي في خطوة فتيلة وسمح للوصول إلى المراحل المتأخرة من نمو الخلايا. ثم يتم حصاد هذه البكتيريا الفلورسنت من الخلايا المصابة وتطبيع بواسطة القياس الطيفي لتوليد أرقام قابلة للمقارنة من البكتيريا لعدوى لاحقة في الضامة الثدييات. لالكمي، ويتم رصد البكتيريا الحية بعد الإصابة باستخدام المجهر مضان، التدفق الخلوي، والطلاء مستعمرة. هذه التقنية تعتمد على الضوء ومساهمة الجينات التعبير المضيف الخلية التي تعتمد على عن طريق محاكاة البيئة التي ستواجه في طريق اكتساب الطبيعية. يمكن تعديل هذا النهج لاستيعاب أي بكتيريا يستخدم المضيف الوسيط كوسيلة لكسب ميزة المسببة للأمراض.

Introduction

وقد تكيفت العديد من مسببات الأمراض البكتيرية استراتيجيات عامة لاستغلال الخلايا المضيفة من أجل البقاء والتكرار في حجرة داخل الخلايا. في كثير من الحالات، وآليات متشابهة بين الممرضة والخلايا metazoan الأوالي. ومع ذلك، فإن هذه microenvironments مختلفان جدا ويمكن أن يؤدي إلى التعبير الفرق من عوامل الفوعة 1-4. ويرتبط بتواجد مطلق هذه الكتائب 'المرض بكتيريا البكتيريا المستروحة مع بيئات المياه العذبة في جميع أنحاء العالم 5. الأهم من ذلك، L. المستروحة المزروعة في خلايا الأوالي قبل إصابة الإنسان حيدات اكتساب ميزة المسببة للأمراض، مما يوحي بأن ملامح التعبير الجيني العالمي للبكتيريا تخرج خلية الأوالي مختلفة من أن من يزرع في المختبر الكائن 6-8. في الطبيعة، الأميبات المياه العذبة توفير حدود الغنية بالمغذيات لتضخيم السريع للبكتيريا الغازية. الإنسان اقتناء L. pneumophوغالبا ما تعزى إلى دائرة الأراضي استنشاق قطرات المياه الملوثة التي تحتوي على البكتيريا. ومن المرجح أن هذه قطرات الميناء الأوالي الخلية المرتبطة البكتيريا؛ حيث الخلايا وحيدة الخلية هي أكثر مقاومة للممارسات التقليدية لمعالجة المياه 9،10. إصابة عائدات الرئة الضامة السنخية بطريقة مماثلة تقريبا لدورة حياة الخلايا من البكتيريا في الخلايا المضيفة الأوالي 11-13.

من أجل البقاء على قيد الحياة والتكاثر في الخلايا حقيقية النواة، L. المستروحة يستخدم نظام IVB المتخصصة إفراز نوع يسمى دوت / ICM لتقديم ما يقرب من 300 "المستجيب" البروتينات في العصارة الخلوية للخلية المضيفة 14-16. هذه البروتينات تعمل بشكل جماعي المستجيب لتخريب العمليات الخلوية من أجل توليد حجرة النسخ المتماثل للبكتيريا الإباحية 17،18. الحذف في أي من الجينات ال 26 التي تتألف منها نتيجة نقل دوت / ICM في سلالات الخلايا التالفة لmultiplication 19-23. تاريخيا، حذف الجينات الفردية ترميز المستجيب نادرا ما أسفرت سلالات موهنة للنمو داخل الخلايا. وقد تعزى هذه الظاهرة إلى عدة فرضيات بما في ذلك وظيفة زائدة عن الحاجة ونسخ paralogous من المستجيبات.

وأعرب فقط بعض عوامل الفوعة في سياق النمو داخل الخلايا المضيفة الخلية المرتبطة 24. ترشيد أننا إذا وأعرب سوى المستجيب سيما في سياق الإصابة الأوالي، ثم لا يمكن أن مساهمة المستجيب يمكن مقارنتها مع سلالة من النوع البري عندما تم تربيتها على حد سواء في المختبر. L. المستروحة التحولات من تنسخي قابل للنقل إلى مرحلة وهي تدخل مرحلة ثابتة في الثقافة 25. النمط الظاهري التحول يمثل مرحلة نضوب المغذيات واجهتها خلال النمو داخل الخلايا ويتمثل من خلال جمعية حركية للسياط 26. لأن L. المستروحة أكثر invaسعينا SIVE وضراوة عندما تحصد من الخلايا وحيدة الخلية، وضع مقايسة أن أكثر بأمانة تمثل الدولة المسببة للأمراض من البكتيريا عندما واجهت الضامة المضيف.

ولهذه الغاية، قمنا بتطوير فتيلة الأوالي تنوعا الفحص التي يمكن أن تستوعب أي مضيف مناسبة لكلا من الإصابات الأولى (الخلية فتيلة) والمرحلة الثانية (الخلية الهدف). عملية العدوى لين العريكة من خلال استخدام البكتيريا التعبير عن ثابت بروتين الفلورية الخضراء (GFP). نموذج للعدوى castellanii الشوكميبة الأوالي يتبع المنهجية المستخدمة على نطاق واسع في مجال 27. للخطوة فتيلة، L. تزرع سلالات المستروحة في المختبر لمرحلة ثابتة في وسائل الإعلام لإنتاج السائل "قابل للنقل" المسمى البكتيريا (الشكل 1A). وتستخدم القادمة البكتيريا لتصيب monolayers من A. castellanii لمدة 18 ساعة لتحقيق مرحلة متأخرة من دورة الحياة داخل الخلايا. فجوات كبيرة تحتوي علىويمكن تصور جي البكتيريا في هذه المرحلة باستخدام المجهر مضان الوقت (الشكل 1A). وهي lysed ثم الخلايا الأوالي ويتم قياس البكتيريا التي عثر عليها على المحللة للالانبعاثات في 512 نانومتر باستخدام قارئ لوحة مضان. ويرتبط مضان مع الكثافة البصرية لحساب تعدد من بين العدوى (وزارة الداخلية) لإصابة الخلايا المستهدفة (الشكل 1، * كيرف الارتباط). بعد ساعة الغزو (T 0) و 18 في مرحلة ما بعد الغزو (T 18)، وكمية الخلايا المستهدفة لمضان، تمثل البكتيريا داخل الخلايا. يمكن رصدها مضان المجهري والتدفق الخلوي، ويمكن قياس التهم قابلة للحياة من خلال الطلاء مستعمرة. ويرافق دائما الفحص عن طريق العدوى مع فتيلة من النوع البري L. المستروحة وسلالة عيب في النظام نوع دوت / ICM إفراز الرابع (Δ DOTA) (الشكل 1A). هذا يوفر الأهم الضوابط الداخلية للمقارنات مباشرة بين البرية من نوع أالثانية أي سلالات متحولة إسوية الجينات المستخدمة في عملية العدوى. إدراج سلالة عديم الفوعة DOTA Δ خلال المرحلة فتيلة يحدد الحد الأدنى لمراقبة الظواهر يضعف من نمو المرتبطة سلالات متحولة إسوية الجينات التي يتم تربيتها في المختبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الثقافات المستروحة البكتيريا لعدوى مرحلة الاشعال

  1. تحويل جميع L. سلالات المستروحة المستخدمة في الفحص مع pAM239 البلازميد، ترميز الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) قابل للتحريض بروتين الفلورية الخضراء (GFP) 28. خط السلالات البكتيرية على الحديد والسيستين تستكمل N-(2-Acetamido)-2-حمض aminoethanesulfonic (ACES) مخزنة أجار الفحم خلاصة الخميرة (CYEA) التي تحتوي على 6،25 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول (CM) (للصيانة بلازميد) واحتضان لمدة 72 ساعة في 37 ° C.
  2. نقل مجموعة اللقاح من السلالة البكتيرية في ACES تستكمل مخزنة الخميرة مرق استخراج (آي) مع 6،25 ميكروغرام / CM مل و 1 IPTG ملم وزراعة إلى الطور الثابت (O / N) على شاكر المداري في 37 ° C.
  3. تأكيد التعبير GFP في المختبر في الثقافات باستخدام المجهر مضان. نقل 10 ميكرولتر من الثقافة على شريحة زجاجية تحت غطاءزلة والصورة باستخدام الهدف 60X مع الإثارة GFP / مكعب الانبعاثات (AMG EVOS فلوريدا).
  4. تمييع 100 ميكرولتر مأخوذة من كل في الثقافة المختبر ل1:10 باستخدام معقم H 2 O. جعل فارغة باستخدام 100 ميكرولتر AYE وسائل الاعلام مع IPTG مم 1 و 6.25 ميكروغرام / مل الطول والماء. اتخاذ OD600 قياسات التخفيفات باستخدام الطيف (بيو راد الذكية المواصفات زائد). حساب حجم اللازمة لنقل العدوى بشكل جيد في ل20 = وزارة الداخلية لكل ثقافة في المختبر: V = [(الأميبا المصنف) × زارة الداخلية] / [OD 600 × (عامل تخفيف) × (الثابتة)] = [(1 X 10 6 ) × (20)] / [OD 600 × (10) × (1 × 10 6)] = 2/OD 600. يتم تحديد تركيز البكتيريا وOD 600 = 1.0 = 1 × 10 9 CFU / مل.

2. فتيلة العدوى عن طريق الشوكميبة المرحلة castellanii

  1. صيانة وزراعة الأميبات في المتوسط ​​ATCC PYG 712 في 175 سم 2 القوارير في RT
  2. استبدال وسائل الإعلام في طريق مسدود الأميباتتوريس 24 ساعة قبل بدء الثقافات البكتيرية السائلة. في نفس اليوم تم تشغيلها الثقافات البكتيرية السائلة، وجمع والاعتماد على الخلايا المجهر ضوء باستخدام عدادة الكريات.
  3. تمييع الأميبات مع وسائل الاعلام جديدة لتركيز النهائي من 1 × 6 10 خلايا / مل. بذور ثقافة الخلية 12-وحات جيدة مع مليلتر مأخوذة 1 من الأميبات باستخدام pipettor تكرار واحتضان في O RT / N.
  4. بعد الحضانة، وغسل الآبار لوحات خلية ثقافة 12-3X جيدا مع 1 مل العقيمة PBS باستخدام 10 مل ماصة المصلية والمساعدات ماصة اليدوي.
  5. بعد تطلع PBS، إضافة 1ml من وسائل الإعلام العدوى (712 ATCC سائل الإعلام PYG ناقص الجلوكوز، ببتون، وخلاصة الخميرة) مع IPTG مم 1 و 6.25 ميكروغرام / مل سم إلى كل بئر. احتضان لوحات في لRT 1 ساعة.
  6. تصيب آبار في وزارة الداخلية 20 =. لوحة أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق (إيبندورف 5810R) وتطفو في حمام مائي 37 ° C لمدة 5 دقائق. نقل لوحة إلى C ° 37، 5٪ CO 2 حاضنة لمدة 18 ساعة.
  7. تأكيد العدوى باستخدام الحية التصوير الخلية على المجهر مضان قبل استضافة تحلل الخلايا والحصاد من البكتيريا.

3. بذر THP-1 لخلايا الخلية المستهدفة العدوى المرحلة

  1. (بدء هذه العملية 24 ساعة قبل إقامة الثقافات البكتيرية السائلة). زراعة THP-1 الخلايا في قوارير 75 سم 2 إلى ثقافة confluency القريب في وسائل الإعلام مع RPMI 1640 مصل الجنين 10٪ للحرارة المعطل البقري (FBS).
  2. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات التعليق، تخفيف-1 THP الخلايا في وسائل الإعلام مع FBS 1640 RPMI 10٪ و 100 نانوغرام / مل phorbol-12-ميريستات-13-خلات (PMA) إلى تركيز الخلايا من 1 X 6 10 / مل ، وصفيحة في 1 مليلتر مأخوذة في 12 لوحات جيدة ثقافة الخلية. احتضان لوحات لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.

4. تجهيز البكتيريا لعدوى الخلية المستهدفة بعد مرحلة الاشعال العدوى المرحلة

  1. نضح وسائل الإعلام من الأميبات معبي.
  2. ليز اmoebae باستخدام 500 ميكرولتر من الجليد الباردة، عقيمة جدا تصفيتها (UF) O 2 H واحتضان في RT لمدة 10 دقيقة.
  3. بركة لست] وفقا لنوع سلالة واتخاذ قياس نانومتر E 512 للكل من المجمعة لست] باستخدام قارئ لوحة مضان (الجزيئية الأجهزة Spectramax الجوزاء EM).
  4. حساب بقيمة 600 OD قياس لتجميع لست]: 600 = 0.0008 calcOD (E 512 - المحللة الخلفية) + 0.0019. وقد سبق تحديدها الصيغة من الرسوم البيانية المقارنة المباشرة لOD ​​كل من 600 و لE القياسات نانومتر 512 من التخفيفات من L. المستروحة البرية من نوع GFP التعبير من الطور الثابت في الثقافة المختبر (الشكل 1 *). يتم استخدام لست] من الأميبا غير مصاب، مع مراعاة الشروط التجريبية نفس الاميبا المصابة، وفارغة، وقدمت قيمة التصحيح (على سبيل المثال خلفية المحللة)، والتي تأسست في المعادلة. ر حجم اللازمةس تصيب بئر في وزارة الداخلية ويتم احتساب = 20 لكل تجمع المحللة: V = [(THP-1 المصنف) × زارة الداخلية] / [calcOD 600 × (الثابتة)] = [(1 × 10 6) × (20)] / [calcOD 600 × (1 × 10 6)] = 20 / calcOD 600.
  5. غسل-1 THP الخلايا 3x مع PBS وإضافة 1 RPMI مل الطازجة 1640 (10٪ FBS) إلى كل بئر. احتضان خلايا THP-1: 1 ساعة عند 37 ° C، 5٪ CO 2.
  6. تصيب الخلايا THP-1 في وزارة الداخلية محسوبة باستخدام لست] المجمعة. تسمح مجموعة من الآبار في البقاء غير مصاب، بمثابة المراقبة السلبية لتدفق تحليل cytometric. وينبغي استكمال تجهيز المرحلة فتيلة في أقل من 30 دقيقة. يتم الاحتفاظ لست] على الجليد للحد من أي تغييرات في التعبير الجيني البكتيري قبل الإصابة.
  7. لوحة أجهزة الطرد المركزي، تطفو الى رفع درجة الحرارة، واحتضان كما هو الحال في المرحلة فتيلة.
  8. ساعة واحدة بعد الإصابة، وإزالة وسائل الإعلام من الطموح وغسل الآبار 3x مع PBS لإزالة البكتيريا خارج الخلية.
  9. إضافة 1 مل الصحائفSH RPMI 1640 (10٪ FBS) إلى الآبار والعودة إلى لوحة الحاضنة. الوقت مباشرة بعد استبدال وسائل الإعلام بمثابة صفر الوقت (T 0). احتضان خلايا THP-1 ل14-16 ساعة عند 37 ° C، 5٪ CO 2.

5. التجريبية التحليل

5.1 التصوير الخلية الحية

صورة الآبار المصابة باستخدام مجهر مضان (AMG EVOS فلوريدا) في 10X 20X التكبير أو (أرقام 1A-D). ويمكن مقارنة هذه الصور نوعيا أو كميا لتحديد مستويات الإصابة في كل مرحلة فتيلة والتهابات الهدف مرحلة الخلية.

5،2 تدفق الخلوي

  1. ويمكن مقارنة القمم الانبعاثات من الإصابات المختلفة من خلال التدفق الخلوي (BD FACS Calibur). يعرض للتريبسين المصابين THP-1 الخلايا وغسل بلطف لهم من الآبار عن طريق خلط في برنامج تلفزيوني مع ماصة.
  2. تجمع الخلايا وفقا لنوع السلالة إلى 15 أنابيب فالكون مل وبيليه عند 1،800 XG لمدة 2دقيقة في الجدول الطرد المركزي الأعلى.
  3. تعليق الكريات في 1 مل PBS ونقل إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge.
  4. أجهزة الطرد المركزي في المعلقات في ز X 1800 (5424 إيبندورف) واعادة تعليق الكريات في 1 مل PBS. إذا عكرا عاليا المعلقات الناتجة يجب (OD 600 ≥ 1.0) أن تضعف أنها في PBS إضافية (1:3) لمنع انسداد خطوط تدفق عداد الكريات في.
  5. استخدام معقم PBS تصفيتها لموازنة تدفق عداد الكريات من وإلى اتخاذ خطوات غسل بين الحقن العينة. رسم مبعثر إلى الأمام / جانب من الخلايا المستهدفة غير مصاب قبل حقن العينات المستهدفة عدوى الخلية.
  6. جمع 20000 الأحداث الإجمالية لكل حالة استخدام 488 الإثارة الليزر نانومتر وقناة FL1.
  7. السكان بوابة الخلية بعد التقاطها لاستبعاد الخلايا غير المصابة وشدة المؤامرة مضان في الرسم البياني (FlowJo) (الشكل 1E).

5.3 CFU الطلاء

  1. دراسة كفاءة سالعدوى و من الطلاء CFU من الخلايا حصاد لالتدفق الخلوي. إعداد التخفيفات التسلسلي للعينات في فائقة تصفيتها O 2 H في 10 -1، 10 -2، و10 -3.
  2. لوحة 20 ميكرولتر من كل تخفيف على 1/3 من لوحة CYEA مع 6،25 ميكروغرام / مل CM.
  3. احتضان لوحات في C ° 37 لمدة 72 ساعة.
  4. عد المستعمرات باستخدام مسواك ومكافحة الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وأوجز نتيجة نموذجية لعملية العدوى كامل في الشكل 1. يعيش micrographs مضان الخلية تصور monolayers من A.castellanii المصابين من النوع البري L. ويرد المستروحة خلال المرحلة فتيلة في 1A الشكل. ومن شأن الإجراء الناجح للخطوة تؤدي إلى فتيلة يبلغ عدد سكانها ما يقرب من 90٪ من الخلايا التي تحتوي على فجوات كبيرة المضيف ملؤها مع GFP المسمى البكتيريا في هذه MOI. في 18 ساعة العدوى آخر، فإن معظم A. حققت الخلايا castellanii الأحمال البكتيرية أقصى بعد تحلل من السكان هو الحد الأدنى. تحت المجهر الضوئي، وعدوى فتيلة ناجحة تكشف الأميبات تقريب وفصل. جنتاميسين [25 ميكروغرام / مل] يمكن أن تضاف إلى ثقافة المتوسط ​​30 دقيقة إلى 1 ساعة للقضاء على العدوى آخر مساهمة البكتيريا خارج الخلية. ينبغي أن سلالة متحولة Δ DOTA، والتي لا تدعم دوت / ICM بوساطة إزفاء من المستجيبات، لا تنمو فيA. castellanii وعلى الرغم من أن الثقافة في المختبر يجب أن يتألق وكذلك سلالة من النوع البري، ينبغي الكشف عن مضان مع الحد الأدنى من هذه السلالة في 18 ساعة إصابة آخر. سوف تظهر الأميبات شقة وينبغي أن يكون أحادي الطبقة سليمة.

مجموع لست] بإيواء L. تخضع مباشرة المستروحة والحطام الخلية المضيفة لتحليل الطيفي لحساب تركيز البكتيريا في العينة. ويمكن حساب وزارة الداخلية باستخدام منحنى العلاقة (الشكل 1 *). يجب أن يكون مستعدا للإصابة الخلايا المستهدفة بحيث تستخدم البكتيريا تستعد أقل من 30 دقيقة بعد تحلل للحفاظ على سلامة ملامح التعبير الجيني. وبمجرد الاصابة بالعدوى، يتم تحضين الخلايا المستهدفة ل14-18 ساعة قبل أن يتم معالجتها. micrographs مضان في الشكل 1B تظهر ميزة المسببة للأمراض التي حصل عليها الأوالي-معبي من النوع البري L. المستروحة في مرحلة العدوى الهدف من الخلية A. جastellanii بالمقارنة مع السلالة متطابقة الذي انحصر في زراعة المختبر قبل الإصابة. التهابات الهدف مرحلة الخلية أقل قوة من مرحلة فتيلة بسبب إدراج غسل العدوى آخر خطوة ساعة 1-2 (هدف الخلية التابعة). هذه الخطوة استبدال وسائل الإعلام يزيل البكتيريا غير الغازية، مزامنة العدوى والحد من مضان الخلفية في تطبيقات اللاحقة. أرقام 1C-D إظهار مضان من micrographs L. البرية من نوع نموذجي المستروحة السيناريو العدوى على مرحلتين، حيث يتم تستعد 1 البكتيريا عن طريق العدوى من A. castellanii، تحصد من الخلايا وحيدة الخلية هي lysed، كميا باستخدام منحنى العلاقة واستخدامها لتصيب THP-1 الضامة لمدة 14 ساعة.

بعد الفحص المجهري، وtrypsinized الخلايا لالتدفق الخلوي (BD FACS Calibur). وتستخدم الخلايا غير المصابة لمعايرة الجهاز للأمام والجانب مبعثر. العدوى مع كل سلالة هي عمليةسجلت إد مع 20،000 الأحداث. يستخدم FlowJo 7.6.1 برنامج لتحليل البيانات الخام. عادة، يتم رسم 1 مضان (488 الإثارة نانومتر) ضد مبعثر الجانب لتحديد مضان الخلفية من السكان الخلية غير مصاب. المؤامرات هي بوابات لاستبعاد هذه الفئة من السكان وإعادة رسم ورسم بياني من العدد الكلي مقابل كثافة مضان. لأن كل خلية بكتيرية تمثل وحدة من مضان، شدة إشارة يعطي تمثيل تحميل فجوي في كل خلية المصابة. ويرد مؤامرة نموذجية من عدوى من النوع البري في 1E الشكل. وعموما، فإن العدد النسبي للخلايا المصابة الكشف عنها بواسطة قياس التدفق الخلوي أقل مما كان متوقعا عند مقارنة مع بيانات المجهر. يعيش التدفق الخلوي الخلية حساسة بما يكفي للكشف عن الفروق لكن التوتر.

يتم تنفيذ الكمي للفي CFU الكلي في عينات عن طريق توليد التخفيفات التسلسلي للخلايا التي أعدت لقياس التدفق الخلوي والطلاء اللاحقةعلى CYEA سائل الإعلام. بعد 72 ساعة عند 37 ° C ينبغي، المستعمرات واحد يكون واضحا بما فيه الكفاية لمتفرق والعد.

الشكل 1
الشكل 1. الأوالي فتيلة والتهابات الهدف مرحلة الخلية باستخدام البكتيريا المستروحة. A. البرية من نوع أو نوع إفراز الرابع ناقصة (Δ DOTA) L. وقد حثت سلالات المستروحة للتعبير عن GFP في الثقافة من خلال المختبر (إطارات صغيرة) وتستخدم لنقل العدوى A. monolayers لمدة 18 ساعة castellanii في 20 = وزارة الداخلية. مضان micrographs من الإصابات مع كل L. وتظهر المستروحة سلالة (إطارات كبيرة) ودمج النقيض من المرحلة وE الصور مضان 512 نانومتر مع الهدف 20X على المجهر مضان (AMG EVOS فلوريدا). الهلال الأخضر ممثل vacuolesharbori داخل الخلايانانوغرام L. المستروحة. B. GFP مضان micrographs من 18 ساعة المرحلة العدوى الهدف من الخلية A. castellanii مع من النوع البري L. المستروحة تحصد من العدوى فتيلة المرحلة الأوالي (أعلى) أو مثقف في المختبر (أسفل)، حيث وزارة الداخلية = 10 لتم حساب كل باستخدام المعادلة المشتقة من منحنى العلاقة أظهرت (الأزرق *). تم إنتاج منحنى باستخدام التخفيفات المسلسل من النوع البري L. المستروحة معربا عن GFP من ساعة 18 في الثقافة المختبر. C. الإسفار صورة مجهرية من فتيلة العدوى مرحلة A. castellanii مع من النوع البري L. المستروحة كما في (A) صورة مجهرية مضان. D. من هدف ساعات 14 إصابة مرحلة خلية من سلطة النقد الفلسطينية متباينة THP-1 الضامة مع من النوع البري L. المستروحة تحصد من العدوى فتيلة المرحلة الأوالي في (C). تم حساب وزارة الداخلية = 20 باستخدام المعادلة المشتقة من مجلس النوابمنحنى العلاقة أظهرت (الأزرق *). الإطار أظهرت هو على النقيض من المرحلة الدمج وE512 نانومتر الصور مضان كما في (A). مؤامرة الرسم البياني للبيانات E. التدفق الخلوي مقارنة غير مصاب THP-1 الضامة (أحمر) والخلايا المصابة مع L. الأوالي من النوع البري تستعد المستروحة (الخضراء). شريط النطاق = 100 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتم التحكم بإحكام البكتيرية التعبير الجيني من خلال مزيج من تقدم دورة الحياة والاستجابة لإشارات في المكروية المحيطة بها. فجوي مسببات الأمراض مثل L. المستروحة الاستجابة لعدد وافر من العظة الخلية المستمدة من المضيف عند مجزأة في يبلوع. ونتيجة لذلك الجماعي استنفاد المغذيات في الخلية المضيفة، والبكتيريا يعوض بالإعراب عن العوامل اللازمة لنشر ناجحة لخلية المضيفة لاحقة 25. L. تكييفها لالمستروحة تتطفل بكفاءة مجموعة متنوعة واسعة من الخلايا وحيدة الخلية وتؤوي ذلك نشرة واسعة من البروتينات المستجيب لدفع هذه العملية. وهذه البروتينات المستجيب translocated مباشرة في السيتوبلازم المضيف خلال العدوى من قبل النظام نوع دوت / ICM إفراز IVB 16. مطلوب المستجيب إزفاء البروتين، والطفرات التي تؤدي إلى نقل معيبة تلغي تماما نمو الخلايا في أي مضيف نوع من الخلايا. تحفةusly، والحذف الفردية في البروتينات المستجيب خاصة نادرا ما أسفرت توهين النمو داخل الخلايا. وقد تم التحقق من صحة ما يقرب من 300 البروتينات المستجيب، أو ما يقرب من 10٪ من البروتين الجينوم ترميز كما دوت / ICM ركائز 14،15. ظهرت عدة فرضيات لتفسير الظواهر عدم وجود ملاحظتها لحذف المستجيب، بما في ذلك وجود نسخ paralogous أو اقتناء الأفقي من الإنزيمات orthologous الناجمة عن مجموعة واسعة من المضيف L. المستروحة.

لأن L. المستروحة مكاسب ميزة الممرضة عندما كنا قبل في الخلايا المستزرعة الأوالي (أرقام 1A-B)، معللة ذلك في المختبر البكتيريا مثقف لن يعرض التعبير الجيني الشخصي واضحا في نفس البكتيريا تخرج من المضيف الأوالي. ولذلك، يمكن فقط التعبير عن البروتينات المستجيب خاصة أن يتسبب في سياق النمو داخل الخلايا في الخلايا وحيدة الخلية. إذا لم يسببها أحد المستجيب خاصة للبريدلا يمكن أن xpression في المختبر خلال الثقافة، من مساهمة المستجيب حذفها تقييم فعال في سيناريو العدوى التقليدية. لن يؤدي إلا إلى الظواهر لعوامل الفوعة هامة لإنشاء العدوى أو نشرها يتم الكشف عن حالات العدوى المطول الذي سمح للخلية إلى انتشار الخلية. سعينا لذلك لتطوير الفحص التي يمكن قياس مساهمة عوامل الفوعة المحتملة في سياق عدوى متسلسلة. في حالة L. الطبيعية المستروحة الاستحواذ، فمن المحتمل أن الإنسان مجموعة سيواجه نوعا من البكتيريا التي قد تم تجهيزهم للعدوى في خلية وحيدة الخلية، حيث الأوليات يمكن أن يكون أكثر مقاومة للممارسات التقليدية البلدية معالجة المياه 10.

من أجل تحسين عملية تنقية جزئية لكميات كافية من البكتيريا معبي، ونحن أنشئت لأول مرة سلالة لين العريكة بصريا من L. المستروحة باستخدام IPTG محرض GFP شالغناء نسخ البلازميد التي تنقلها من مكان GFP. ونحن ولدت أيضا الإدراج نسخة واحدة الكروموسومات من IPTG GFP محرض على الجينوم البرية من نوع. على الرغم من كل سلالات يتألق في المختبر، وخلال العدوى، أنتجت عدد أكبر نسخة من GFP البلازميد التي تنقلها إشارة كافية للتطبيقات المصب في مقايسة. أنشأنا أن استخدام L. مرق مثقف كان المستروحة في ل20 = وزارة الداخلية كافية لتصيب بشكل كبير A. monolayers castellanii. تم تحديد ثمانية عشر ساعة من الحضانة والأمثل لتصور فجوات كبيرة الفلورسنت دون التوصل إلى مرحلة تحلل الخلية المضيفة (الشكل 1A). لم يتم التقيد monolayers الأوالي والبلاستيك زراعة الخلايا، وبالتالي فهي منزعجة بسهولة مع خطوات الغسيل. أنتجت 12-وحات جيدة ثقافة الخلية monolayers الأكثر استقرارا بالمقارنة مع السفن الأخرى (6 أو 24 أيضا، 10 طبق سم). لأن L. يمكن المستروحة لا تنمو في المتوسط ​​العدوى المستخدمة في الالخطوة e فتيلة، اخترنا التخلي عن أي خطوة الغسيل لإزالة البكتيريا خارج الخلية. هذا يحسن كثيرا من محصول الأميبا المصابة في أحادي الطبقة. كما جنتاميسين غالبا ما تستخدم لقتل البكتيريا خارج الخلية. وجدنا آثار سمية الأوالي بتركيزات أكثر من 25 ميكروغرام / مل، والعثور على الاختلافات في العدد الإجمالي من البكتيريا التي عثر عليها على فتيلة العدوى المرحلة في 18 ساعة. تم إجراء تحلل الخلايا أحادي الطبقة من الجليد الباردة مع الأوالي فائقة تصفيتها O 2 H، مذيب أن ينال osmotically الخلية المضيفة دون الإضرار L. المستروحة. إذا تكييفها للاستخدام مع مسببات الأمراض التي ليست مستقرة في H 2 O، يمكن 0.1٪ أن تستخدم تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لليز والأميبات مع نتائج مماثلة.

كان من أجل مقارنة مباشرة سلالة إلى سلالة الاختلافات في الإصابات اللاحقة الخلية المستهدفة، إنشاء معادلة لربط الكثافة البصرية من البكتيريا في 600 نانومتر مع مضان الانبعاثات من GFP في 512 نانومتر (الارقام ..ه 1 *). اخترنا لاستخدام الانبعاثات مضان كوسيلة لالكمي نظرا لمساهمة كبيرة من الحطام الخلية المضيفة في القياسات OD 600 من خلية حقيقية النواة لست]. هذه الخلفية عالية يتناقض مع القيم لا تذكر ولاحظ لالانبعاثات في 512 نانومتر من لست] واحدة. قيم OD 600 = 1.0 = 1x10 ومحددة سلفا 9 CFU / مل لL. المستروحة، مما يسمح لحساب تركيز البكتيريا أكثر من مجموعة واسعة من القيم مضان. العديد من الكائنات الحية وضعت القيم CFU لOD 600 = 1.0، والتي من شأنها أن تسمح لتطبيق هذه التقنية إلى أي الممرض الأخرى من خلال جيل من منحنى العلاقة على أساس الانبعاثات مضان. اخترنا لتجنب خطوة تنقية البكتيرية خلال تحلل الخلايا وحيدة الخلية من أجل 1) تعظيم العائد من البكتيريا تستعد المتاحة لهدف عدوى الخلية و2) تقليل الوقت بين الحصاد والعدوى اللاحقة للحفاظ العالمية ع التعبير الجينيatterns.

في المختبر L. البرية من نوع مثقف كان المستحث المستروحة للتعبير عن GFP لمدة 18 ساعة مع IPTG مم 1. واستخدمت التخفيفات المسلسل من هذه الثقافة لقياسات طيفية. باستخدام المعادلة المشتقة، وأجريت بشكل روتيني العدوى الخلية المستهدفة في لMOI متغير مع الانتاج متسقة. أنتجت وزارة الداخلية من 10 تقريبا 1/2 عدد الخلايا المصابة بالمقارنة مع إجمالي الإصابات التي تلقت وزارة الداخلية من 20 (أرقام 1A-B). لقد اختبرت لدينا ثلاثة المضيفين الخلية المستهدفة مع هذا الاختبار؛ A. castellanii، الفئران J774 الضامة والبشرية PMA-متباينة الضامة THP-1. في كل حالة، كان للعدوى الناجمة أبدا قوية كما العدوى فتيلة في نفس زارة الداخلية (أرقام 1C-D). قررنا أن ذلك خطوة غسيل إضافية خلال مرحلة العدوى الهدف الخلية، والتي تتم على كل من مزامنة عدوى الخلية المستهدفة والحد من البكتيريا خارج الخلية، هو التركيبonsible لهذه الملاحظة. ومع ذلك، فمن الأهمية بمكان أن يتم التحكم داخليا التجربة مع سلالة من النوع البري لفتيلة على حد سواء والتهابات الهدف مرحلة الخلية. كميات البكتيريا استرداد في الخطوة فتيلة يحد بدلا عن الإصابات اللاحقة، ولذلك ينبغي أن تستخدم فقط خلية هدف واحد في نوع التجربة.

وقد تحقق الكمي لهدف عدوى الخلية باستخدام ثلاثة أساليب في هذا الاختبار. تم استخدام المجهر مضان مع الهدف 20X. صور من فجوات إيواء L. احصي يدويا المستروحة من عدة حقول لكل سلالة اختبارها. تقديم تحليل تدفق cytometric مقياس حساس للاختلافات في الخلايا المصابة إجمالي، فضلا عن تقريب تحميل فجوي، حيث ارتبط أعلى إشارة مضان بمساهمة من إشارة GFP من الأعداد المتزايدة من L. الخلايا المستروحة. المسلسل الطلاء التخفيف توفير القيم الكمية لعددحجم CFU نصيب في عينات الخلايا التي تم جمعها عن التدفق الخلوي. بشكل جماعي، هذه الأساليب تسمح لنتائج قابلة للقياس الكمي ولين العريكة تماما في سيناريو العدوى متتابعة.

الفحص فتيلة هي متعددة للغاية ويناسب للتكيف مع أي الممرض البكتيرية التي تستخدم المياه العذبة الأوليات كمادة وسيطة البيئية 29،3. يمكن اختيار الخلية المستهدفة تهتم لتناسب الطريق العدوى الطبيعية للممرض محدد. الأهم، يمكن استخدام نموذج العدوى متتابعة لدراسة السلالات الطافرة التي لم يقدم مع النمط الظاهري النمو في نموذج عدوى البكتيريا في التقليدية باستخدام المختبر مثقف. يمكن النسخي في المختبر البكتيريا مثقف لعوامل الفوعة المفترضة تكشف الاختلافات الرئيسية في الملف التعبير في المضيف وسيطة المصابة. وهذا يمكن فتح خط جديد من التحقيق لوظيفة البروتينات uncharacterized ومساهمتها في الطبيعيةعدوى الطرق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

Acknowledgements

نشكر الدكتور كريج روي والدكتور Zamboni داريو لتقديم نموذج للالتهابات الخلايا وحيدة الخلية. نشكر الدكتور Jagdeep Obhrai الدكتور بوردي جورجيانا، الدكتور فريد Heffron وتود ويزنر للمعدات والكواشف، والدكتور Cambronne ولو لمراجعة نقدية للمخطوطة. تم إجراء التدفق الخلوي في قياس التدفق الخلوي OHSU مرفق الموارد المشتركة. وأيد هذا العمل في جزء من منحة من مؤسسة أبحاث الطبية ولاية أوريغون ومنحة المعاهد الوطنية للصحة R21 AI088275 (EDC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
chloramphenicol Fisher Scientific BP904-100 antibiotic
IPTG Fisher Scientific BP1755-10
ACES Sigma A9758-1KG media component
ATCC medium: 712 PYG ATCC growth media for protozoans
1X PBS Fisher Scientific SH30256FS phosphate buffered saline
activated charcoal Fisher Scientific C272-212 media component
yeast extract Fisher Scientific BP1422-500 media component
peptone BD Diagnostics 211677 media component
agar Fisher Scientific BP1423-2 media component
L-cysteine, 99%+ Acros organics 173601000 media supplement
Ferric nitrate nonahydrate Fisher Scientific I110-100 media supplement
Equipment
EVOS fl AMG EVOS fl fluorescence microscope
Smart Spec Plus Bio-Rad 170-2525 spectrophotometer
5810 R centrifuge Eppendorf 22627023 bench top centrifuge
Repeater plus Eppendorf 22230201 repeating pipette
SpectraMax Gemini EM Molecular Devices microplate reader
Softmax Pro 5.3 Molecular Devices 0200-310 microplate reader software
5424 microfuge Eppendorf 22620401 table top microcentrifuge
Fast-release pipette pump II Scienceware 379111010 pipette aid
FACS Calibur BD Bioscience flow cytometer
FlowJo 7.6.1 FlowJo license flow cytometery software
15 ml tube BD Falcon 352096 polypropylene conical tube
1.6 ml microfuge tube Neptune 3745.X microcentrifuge tubes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues. Science. 259, 686-688 (1993).
  2. Mahan, M. J., et al. Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 669-673 (1995).
  3. Rankin, S., Isberg, R. R. Identification of Legionella pneumophila promoters regulated by the macrophage intracellular environment. Infect. Agents Dis. 2, 269-271 (1993).
  4. Rankin, S., Li, Z., Isberg, R. R. Macrophage-induced genes of Legionella pneumophila: protection from reactive intermediates and solute imbalance during intracellular growth. Infect. Immun. 70, 3637-3648 (2002).
  5. Fields, B. S. The molecular ecology of legionellae. Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).
  6. Cirillo, J. D., et al. Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 67, 4427-4434 (1999).
  7. Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S. Growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii enhances invasion. Infect. Immun. 62, 3254-3261 (1994).
  8. Faucher, S. P., Mueller, C. A., Shuman, H. A. Legionella pneumophila Transcriptome during Intracellular Multiplication in Human Macrophages. Front Microbiol. 2, 60 (2011).
  9. Kilvington, S., Price, J. Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure. J. Appl. Bacteriol. 68, 519-525 (1990).
  10. King, C. H., Shotts, E. B., Wooley, R. E., Porter, K. G. Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination. Appl. Environ. Microbiol. 54, 3023-3033 (1988).
  11. Horwitz, M. A. Formation of a novel phagosome by the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 1319-1331 (1983).
  12. Horwitz, M. A. Phagocytosis of the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil. Cell. 36, 27-33 (1984).
  13. Horwitz, M. A., Silverstein, S. C. Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes. J. Clin. Invest. 66, 441-450 (1980).
  14. Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).
  15. Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638 Forthcoming.
  16. Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Front Microbiol. 2, 136 (2011).
  17. Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
  18. Shin, S., Roy, C. R. Host cell processes that influence the intracellular survival of Legionella pneumophila. Cell Microbiol. 10, 1209-1220 (2008).
  19. Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
  20. Marra, A., Blander, S. J., Horwitz, M. A., Shuman, H. A. Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9607-9611 (1992).
  21. Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
  22. Segal, G., Shuman, H. A. Characterization of a new region required for macrophage killing by Legionella pneumophila. Infect Immun. 65, 5057-5066 (1997).
  23. Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
  24. Haghjoo, E., Galan, J. E. Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi. Mol. Microbiol. 64, 1549-1561 (2007).
  25. Molofsky, A. B., Swanson, M. S. Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle. Mol. Microbiol. 53, 29-40 (2004).
  26. Hammer, B. K., Tateda, E. S., Swanson, M. S. A two-component regulator induces the transmission phenotype of stationary-phase Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 44, 107-118 (2002).
  27. Ninio, S., Zuckman-Cholon, D. M., Cambronne, E. D., Roy, C. R. The Legionella IcmS-IcmW protein complex is important for Dot/Icm-mediated protein translocation. Mol. Microbiol. 55, 912-926 (2005).
  28. Neild, A. L., Roy, C. R. Legionella reveal dendritic cell functions that facilitate selection of antigens for MHC class II presentation. Immunity. 18, 813-823 (2003).
  29. Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
  30. Huws, S. A., Smith, A. W., Enright, M. C., Wood, P. J., Brown, M. R. Amoebae promote persistence of epidemic strains of MRSA. Environ. Microbiol. 8, 1130-1133 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats