विनयशील प्रोटोजोआ primed जीवाणु के साथ स्तनधारी सेल संक्रमणों

Published 4/02/2013
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Immunology and Infection

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Summary

इस तकनीक में एक फसल, मानक के अनुसार और बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के intracellular विकास कर रहे हैं कि प्राकृतिक प्रोटोजोआ मेजबान कोशिकाओं में स्तनधारी कोशिकाओं के संक्रमण से पहले पूर्व की खेती की जाती है यों विधि प्रदान करता है. इस विधि भड़काना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मंच लक्ष्य सेल प्रकार के लिए एक मेजबान कोशिकाओं के एक विस्तृत विविधता को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.

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Drennan, S. L., Lama, A., Doron, B., Cambronne, E. D. Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria. J. Vis. Exp. (74), e50300, doi:10.3791/50300 (2013).

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Abstract

कई intracellular बैक्टीरियल रोगज़नक़ों वातावरण में प्रसार के लिए एक प्राकृतिक जलाशय के रूप में मीठे पानी protozoans उपयोग लीजोनेला pneumophila, 'Legionnaires निमोनिया का प्रेरणा का एजेंट है, पर इन विट्रो सुसंस्कृत बैक्टीरिया है जब पहली बार प्रोटोजोआ कोशिकाओं स्तनधारी मैक्रोफेज की संक्रमण से पहले काटा रोगजनक लाभ लाभ. यह पता चलता है कि महत्वपूर्ण विषैलापन कारकों इन विट्रो में ठीक से व्यक्त नहीं किया जा सकता है. हम भड़काना एल के लिए एक विनयशील प्रणाली विकसित की है pneumophila के माध्यम से अपनी प्राकृतिक प्रोटोजोआ मेजबान Acanthamoeba castellanii स्तनधारी सेल संक्रमण पहले. किसी भी विषैलापन कारक के योगदान प्रोटोजोआ भड़काना के बाद जंगली प्रकार के बैक्टीरिया के लिए एक उत्परिवर्ती तनाव के intracellular वृद्धि की तुलना द्वारा जांच की जा सकती है. GFP व्यक्त जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती एल pneumophila उपभेदों के लिए एक भड़काना कदम में प्रोटोजोआ monolayers को संक्रमित करने के लिए उपयोग किया जाता है और intracellular विकास की देर चरणों तक पहुँचने की अनुमति दी. प्रतिदीप्त बैक्टीरिया तो इन संक्रमित कोशिकाओं से काटा जाता है और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा सामान्यीकृत स्तनधारी मैक्रोफेज में एक बाद के संक्रमण के लिए बैक्टीरिया की तुलना संख्या उत्पन्न. मात्रा का ठहराव के लिए, जीवित बैक्टीरिया के संक्रमण के बाद निगरानी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, प्रवाह cytometry, और कॉलोनी चढ़ाना द्वारा का उपयोग कर रहे हैं. इस तकनीक पर प्रकाश डाला गया है और वातावरण है कि एक प्राकृतिक अधिग्रहण मार्ग में सामना किया जाएगा नकल उतार द्वारा मेजबान सेल निर्भर जीन अभिव्यक्ति के योगदान पर निर्भर करता है. इस दृष्टिकोण के लिए किसी भी जीवाणु है कि एक रोगजनक लाभ पाने के लिए एक साधन के रूप में एक मध्यस्थ की मेजबानी का उपयोग करता है को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.

Introduction

कई बैक्टीरियल रोगज़नक़ों सामान्यीकृत रणनीतियों और एक intracellular कम्पार्टमेंट में जीवित रहने की प्रतिकृति के लिए मेजबान कोशिकाओं का फायदा उठाने के लिए अनुकूलित किया है. कई मामलों में, रोगजनक तंत्र प्रोटोजोआ और metazoan कोशिकाओं के बीच इसी तरह के हैं. हालांकि, इन दो microenvironments बहुत अलग हैं और डाह कारकों 1-4 के अंतर अभिव्यक्ति में परिणाम कर सकते हैं. Legionnaires रोग जीवाणु लीजोनेला pneumophila सर्वत्र 5 दुनिया भर में मीठे पानी वातावरण के साथ जुड़ा हुआ है. महत्वपूर्ण बात, एल. pneumophila प्रोटोजोआ कोशिकाओं में खेती की जाती पहले मानव रोगजनक लाभ हासिल monocytes के संक्रमण के लिए सुझाव है कि जीवाणु एक प्रोटोजोआ सेल से बाहर निकलने के वैश्विक जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल में खेती की जाती है इन विट्रो जीव 6-8 की तुलना में अलग हैं. प्रकृति में, मीठे पानी में अमीबा एक हमलावर जीवाणु के तेजी से प्रवर्धन के लिए पोषक तत्व अमीर सीमीत प्रदान करते हैं. एल मानव अधिग्रहण pneumophइला सबसे अक्सर दूषित पानी बूंदों कि जीवाणु होते की साँस लेना के लिए जिम्मेदार ठहराया है. यह संभावना है इन बूंदों बंदरगाह प्रोटोजोआ बैक्टीरिया सेल से जुड़े, जहां प्रोटोजोआ कोशिकाओं अधिक पारंपरिक जल उपचार 9,10 प्रथाओं के लिए प्रतिरोधी रहे हैं. एक लगभग प्रोटोजोआ मेजबान 11-13 कोशिकाओं में जीवाणु के intracellular जीवन चक्र के समान तरीके में फेफड़ों वायुकोशीय मैक्रोफेज आय के संक्रमण.

आदेश में जीवित रहने के लिए और कोशिकाओं में दोहराने, एल pneumophila एक विशेष प्रकार IVB स्राव डॉट / ICM मेजबान सेल 14-16 की cytosol में लगभग 300 'effector' प्रोटीन देने के लिए करार दिया प्रणाली का उपयोग करता है. ये effector प्रोटीन सामूहिक सेलुलर प्रक्रियाओं पलट देना क्रम में 17,18 जीवाणु के लिए एक प्रतिकृति अनुमोदक डिब्बे उत्पन्न कार्य करते हैं. 26 जीन है कि डॉट / ICM intracellular mult के लिए दोषपूर्ण उपभेदों में ट्रांसपोर्टर परिणाम शामिल किसी में विलोपन19-23 iplication. ऐतिहासिक, व्यक्तिगत effector एन्कोडिंग जीन का विलोपन intracellular विकास के लिए तनु उपभेदों में शायद ही कभी हुई. इस घटना को अनावश्यक समारोह और effectors के paralogous प्रतियां सहित कई hypotheses के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है.

कुछ विषैलापन कारकों केवल सेल जुड़े मेजबान intracellular 24 विकास के संदर्भ में व्यक्त कर रहे हैं. हम युक्तिसंगत बनाया है कि अगर एक विशेष effector केवल प्रोटोजोआ संक्रमण के संदर्भ में व्यक्त की गई थी, तो effector के योगदान जब सुसंस्कृत थे दोनों इन विट्रो में एक तनाव जंगली प्रकार के साथ तुलना नहीं की सकता. एक replicative से एक transmissive चरण एल pneumophila बदलाव के रूप में यह 25 संस्कृति में स्थिर चरण में प्रवेश करती है. चरण स्विचन phenotype पोषक तत्व रिक्तीकरण intracellular विकास के दौरान सामना करना पड़ा है और 26 गतिशीलता के लिए flagella के विधानसभा के माध्यम से उदाहरण का प्रतिनिधित्व करता है. क्योंकि एल pneumophila अधिक INVA हैनिर्णायक और विषमय जब प्रोटोजोआ कोशिकाओं से काटा, हम एक परख है कि अधिक ईमानदारी रोगजनक जीवाणु के राज्य का प्रतिनिधित्व किया है, जब यह मेजबान मैक्रोफेज का सामना करना पड़ा विकसित करने की मांग की.

यह अंत करने के लिए, हम एक बहुमुखी प्रोटोजोआ भड़काना परख कि दोनों (भड़काना सेल) 1 और 2 (लक्ष्य सेल) चरण संक्रमण के लिए कोई उपयुक्त मेजबान को समायोजित कर सकते हैं विकसित किया है. संक्रमण की प्रक्रिया stably हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त बैक्टीरिया के प्रयोग के माध्यम से विनयशील है. प्रोटोजोआ Acanthamoeba castellanii के लिए संक्रमण मॉडल एक 27 क्षेत्र में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया पद्धति का अनुसरण करता है. एल, भड़काना कदम के लिए pneumophila उपभेदों में इन विट्रो तरल मीडिया में स्थिर चरण की खेती लेबल 'transmissive' बैक्टीरिया (चित्रा 1 ए) का उत्पादन कर रहे हैं. जीवाणु अगले के monolayers को संक्रमित करने के लिए उपयोग किया जाता है castellanii intracellular जीवन चक्र के 18 घंटे के लिए एक देर मंच को प्राप्त करने के लिए. बड़े vacuoles होते हैंआईएनजी बैक्टीरिया इस समय प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1 ए) का उपयोग बिंदु पर देखे जा सकते हैं. प्रोटोजोआ कोशिकाओं तो और lysed lysate से बरामद बैक्टीरिया 512 एनएम का उपयोग कर एक प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर में उत्सर्जन के लिए मापा जाता है. प्रतिदीप्ति बहुलता लक्ष्य कोशिकाओं के संक्रमण (1 चित्र, * सहसंबंध वक्र) संक्रमण (MOI) की गणना करने के लिए ऑप्टिकल घनत्व के साथ सहसंबद्ध है. आक्रमण (0 टी) और 18 घंटे के बाद आक्रमण (18 टी) के बाद, लक्ष्य कोशिकाओं प्रतिदीप्ति के लिए मात्रा निर्धारित कर रहे हैं, intracellular बैक्टीरिया का प्रतिनिधित्व. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry द्वारा नजर रखी जा सकता है, और व्यवहार्य मायने कॉलोनी चढ़ाना के माध्यम से मापा जा सकता है. भड़काना परख हमेशा जंगली प्रकार एल के साथ संक्रमण के साथ है pneumophila और एक / डॉट ICM प्रकार चतुर्थ स्राव (Δ DotA) प्रणाली (चित्रा 1 ए) में दोषपूर्ण तनाव. यह महत्वपूर्ण बात यह है कि जंगली प्रकार के बीच प्रत्यक्ष तुलना के लिए आंतरिक नियंत्रण प्रदान करता हैएन डी किसी भी isogenic उत्परिवर्ती उपभेदों संक्रमण की प्रक्रिया में इस्तेमाल. असंक्रामक Δ DotA भड़काना चरण के दौरान तनाव का समावेश तनु है कि इन विट्रो में संवर्धित कर रहे हैं isogenic उत्परिवर्ती उपभेदों के साथ जुड़े विकास phenotypes की निगरानी के लिए एक सीमा सेट.

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Protocol

1. लीजोनेला pneumophila संस्कृति की भड़काना स्टेज संक्रमण के लिए तैयार

  1. सभी एल रूपांतरण pneumophila प्लाज्मिड pAM239 साथ परख में इस्तेमाल किया उपभेदों, एक isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) एन्कोडिंग हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) 28 inducible. स्ट्रीक लोहा और सिस्टीन पर जीवाणु उपभेदों N (2 Acetamido) 2 aminoethanesulfonic एसिड (ACES) पूरक buffered कोयला खमीर निकालने अगर (CYEA) 6.25 ग्राम / एमएल (मुख्यमंत्री) chloramphenicol (प्लास्मिड रखरखाव के लिए) और 72 के लिए सेते हैं युक्त घंटा ° सी. 37 पर
  2. स्थानांतरण पूरक इक्के में बैक्टीरियल तनाव का एक inoculum 6.25 छ / मिलीलीटर मुख्यमंत्री और 1 मिमी IPTG साथ खमीर निकालने शोरबा buffered (ऐ) और 37 में एक कक्षीय हिलनेवाला पर स्थिर चरण (/ ओ एन) खेती ° सी.
  3. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए इन विट्रो संस्कृतियों में GFP अभिव्यक्ति की पुष्टि करें. एक गिलास स्लाइड पर एक कवर के तहत स्थानांतरण संस्कृति की 10 μlपर्ची और GFP उत्तेजना / उत्सर्जन घन (AMG EVOS fl) के साथ एक 60x उद्देश्य का उपयोग कर छवि.
  4. 1:10 इन विट्रो संस्कृति में प्रत्येक के लिए एक 100 μl अशेष भाजक पतला बाँझ एच 2 ओ का उपयोग 1 मिमी IPTG और 6.25 ग्राम / मिलीलीटर सेमी और पानी के साथ एक रिक्त 100 μl ऐ का उपयोग कर मीडिया बनाओ. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग dilutions OD600 माप (जैव रेड स्मार्ट कल्पना प्लस) ले लो. मात्रा एक MOI = 20 में इन विट्रो संस्कृति में प्रत्येक के लिए एक अच्छी तरह से संक्रमित करने के लिए आवश्यक गणना: वी = [(अमीबा वरीय) x MOI] / [आयुध डिपो x 600 (कमजोर पड़ने कारक) x (निरंतर)] = [(1 10 एक्स 6 x) (20)] / [आयुध डिपो x 600 (10) x (1 6 x 10)] = 600 2/OD. जीवाणुओं की एकाग्रता 600 आयुध डिपो के रूप में निर्धारित किया जाता है 1,0 = 1 = 10 x 9 CFU / एमएल.

2. भड़काना स्टेज Acanthamoeba castellanii संक्रमण

  1. बनाए रखने और ATCC 712 PYG मध्यम आरटी पर 175 2 बोतल सेमी में अमीबा खेती.
  2. Amoebae संस्कृति में मीडिया की जगहबैक्टीरियल तरल संस्कृतियों को शुरू करने से पहले 24 घंटे tures. उसी दिन तरल बैक्टीरियल संस्कृतियों शुरू कर रहे हैं, जमा है, और एक प्रकाश एक hemocytometer का उपयोग माइक्रोस्कोप कोशिकाओं गिनती.
  3. ताजा मीडिया के साथ 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता amoebae पतला. बीज अमीबा के 1 मिलीलीटर aliquots के साथ 12-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटें एक दोहराने और आर टी ओ / एन pipettor सेते का उपयोग
  4. ऊष्मायन के बाद, 12-1 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक विंदुक और एक पुस्तिका विंदुक सहायता का उपयोग के साथ अच्छी तरह से सेल संस्कृति 3x प्लेटों के कुओं धो लो.
  5. पीबीएस की आकांक्षा के बाद, 1 मिमी IPTG और 6.25 प्रत्येक अच्छी तरह से छ / मिलीलीटर सेमी के साथ संक्रमण मीडिया (ATCC PYG 712 मीडिया ऋण ग्लूकोज, peptone, और खमीर निकालने) 1ml जोड़ने. 1 घंटा के लिए आरटी पर प्लेटें सेते हैं.
  6. एक MOI = 20 कुओं संक्रमित. 400 XG पर 5 मिनट (5810R Eppendorf) के लिए प्लेट और अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में तैरने लगते हैं. एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% 18 घंटा के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर प्लेट हस्तांतरण.
  7. एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर जीना सेल इमेजिंग से पहले का उपयोग करने के लिए सेल और बैक्टीरिया के lysis फसल की मेजबानी संक्रमण की पुष्टि.

3. लक्ष्य कोशिका चरण संक्रमण के लिए THP एक प्रकोष्ठों सीडिंग

  1. (तरल बैक्टीरियल संस्कृतियों की स्थापना करने के लिए इस प्रक्रिया में 24 घंटे पहले शुरू). एक 75 सेमी 2 RPMI 1640 मीडिया में संस्कृति के पास 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ confluency बोतल में खेती THP 1-कोशिकाओं.
  2. निलंबन कोशिकाओं की गणना एक hemocytometer का उपयोग, RPMI 1640 मीडिया में 10% FBS और 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता 100 एनजी / एमएल phorbol-12-myristate-13 एसीटेट (PMA) के साथ THP 1-कोशिकाओं को कमजोर , और 12 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों पर 1 मिलीलीटर aliquots में थाली. 37 में 48 घंटे के लिए प्लेटें सेते ° सी, 5% सीओ 2.

4. जीवाणुओं का लक्ष्य कोशिका चरण संक्रमण के लिए भड़काना स्टेज संक्रमण के बाद प्रसंस्करण

  1. Primed अमीबा से मीडिया Aspirate.
  2. एक lysemoebae 10 मिनट के लिए ठंडा बर्फ, बाँझ अति फ़िल्टर्ड (UF) एच 2 ओ और आरटी पर सेते के 500 μl का उपयोग.
  3. पूल प्रकार का तनाव और एक ई एक प्रतिदीप्ति प्लेट पाठक (आणविक उपकरणों Spectramax मिथुन EM) का उपयोग कर जमा lysates में से प्रत्येक के लिए 512 एनएम माप लेने के अनुसार lysates है.
  4. - 0,0019 + 600 0,0008 = (lysate पृष्ठभूमि ई 512) calcOD: जमा lysates के लिए एक आयुध डिपो 600 माप की गणना. सूत्र पहले 600 आयुध डिपो और ई एल dilutions के 512 एनएम माप दोनों का एक सीधा तुलना रेखांकन द्वारा निर्धारित किया गया था pneumophila जंगली प्रकार इन विट्रो संस्कृति में स्थिर चरण (1 चित्र *) से व्यक्त GFP. असंक्रमित अमीबा की lysates, संक्रमित अमीबा के रूप में एक ही प्रयोगात्मक शर्तों के अधीन, एक खाली के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं और एक सुधार (जैसे lysate पृष्ठभूमि) मूल्य है, जो समीकरण में शामिल किया गया था प्रदान की. मात्रा आवश्यक टीओ पर एक अच्छी तरह को संक्रमित एक MOI = 20 प्रत्येक lysate पूल के लिए गणना की है: वी = [(THP-1 वरीय) x MOI] / [calcOD x 600 (स्थिर)] = [(1 6 एक्स 10) (20)] / [600 calcOD x 10 (1 x 6)] = / 20 calcOD 600.
  5. धो THP एक पीबीएस के साथ 3x कोशिकाओं और एक अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर ताजा 1640 RPMI (10% FBS). 37 पर सेते हैं THP 1 1 घंटा के लिए कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2.
  6. MOI जमा lysates का उपयोग कर की गणना में 1-THP कोशिकाओं को संक्रमित. असंक्रमित रहने के लिए कुओं का एक सेट, प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवारत दें. भड़काना चरण के प्रसंस्करण में कम से कम 30 मिनट में पूरा किया जाना चाहिए. जीवाणु जीन अभिव्यक्ति में संक्रमण से पहले किसी भी परिवर्तन की सीमा lysates बर्फ पर रखा जाता है.
  7. थाली अपकेंद्रित्र, तापमान बढ़ा नाव, और भड़काना मंच के रूप में सेते हैं.
  8. एक घंटे के बाद संक्रमण, आकांक्षा से मीडिया को हटाने और पीबीएस के साथ 3x कोशिकी बैक्टीरिया को दूर कुओं धो लो.
  9. Fre 1 मिलीलीटर जोड़ेंश RPMI कुओं के लिए (FBS 10%) 1640 और इनक्यूबेटर करने के लिए थाली वापस. तुरंत मीडिया बदलने के बाद समय समय शून्य (0 टी) के रूप में कार्य करता है. 37 में 14-16 घंटे के लिए THP 1 कोशिकाओं सेते ° सी, 5% सीओ 2.

5. प्रयोगात्मक विश्लेषण

5.1 लाइव सेल इमेजिंग

छवि संक्रमित 10X पर एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (AMG EVOS fl) का उपयोग कुओं या 20X बढ़ाई (1 ए - डी आंकड़े). छवियों या तो गुणात्मक या मात्रात्मक तुलना में किया जा सकता है संक्रमण के दोनों भड़काना मंच और लक्ष्य सेल चरण संक्रमण के स्तर का पता लगाने के.

5.2 प्रवाह cytometry

  1. अलग संक्रमण के उत्सर्जन चोटियों प्रवाह cytometry (बी FACS Calibur) से तुलना की जा सकती है. संक्रमित THP 1 कोशिकाओं Trypsinize और धीरे पीबीएस में एक विंदुक के साथ मिश्रण से कुओं से उन्हें धोने.
  2. 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब और 1,800 XG पर गोली में 2 के लिए तनाव प्रकार द्वारा कोशिकाओं पूलतालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र में न्यूनतम.
  3. 1 मिलीलीटर पीबीएस में छर्रों सस्पेंड और 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों को हस्तांतरण.
  4. 1800 x g (5424 Eppendorf) में निलंबन अपकेंद्रित्र और फिर से 1 मिलीलीटर पीबीएस में छर्रों को निलंबित. यदि परिणामस्वरूप निलंबन अत्यधिक turbid (600 आयुध डिपो 1.0 ≥) वे अतिरिक्त पीबीएस (01:03) में पतला किया जाना चाहिए प्रवाह cytometer में लाइनों के clogging रोकने.
  5. प्रवाह cytometer के संतुलन के लिए और नमूना इंजेक्शन के बीच धोने कदम के लिए बाँझ फ़िल्टर्ड पीबीएस का प्रयोग करें. असंक्रमित कोशिकाओं के लक्ष्य तितर बितर / आगे की ओर लक्ष्य सेल संक्रमण के नमूनों के इंजेक्शन से पहले प्लॉट.
  6. प्रत्येक 488 एनएम लेजर उत्तेजना और FL1 चैनल का उपयोग करने की स्थिति के लिए 20,000 कुल घटनाओं ले लीजिए.
  7. Uninfected कोशिकाओं और साजिश हिस्टोग्राम में प्रतिदीप्ति तीव्रता (FlowJo) (चित्रा 1E) को बाहर करने के लिए गेट के बाद कब्जा सेल आबादी है.

5.3 CFU चढ़ाना

  1. दक्षता ओ की जांच करनाच प्रवाह cytometry के लिए काटा कोशिकाओं के CFU चढ़ाना द्वारा संक्रमण. अति फ़िल्टर्ड -1 10 एच 2 हे, -2 10, और 10 -3 में नमूनों की धारावाहिक dilutions तैयार.
  2. प्लेट 6.25 ग्राम / मिलीलीटर मुख्यमंत्री के साथ प्रत्येक एक CYEA की थाली के कमजोर पड़ने पर 1/3 की 20 μl.
  3. 37 डिग्री सेल्सियस से कम 72 घंटे के लिए प्लेटें सेते हैं.
  4. दन्तखुदनी और सेल काउंटर का उपयोग कालोनियों की गणना.

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Representative Results

पूरे संक्रमण की प्रक्रिया के लिए एक विशिष्ट परिणाम चित्रा 1 में उल्लिखित है. लाइव सेल प्रतिदीप्ति micrographs A.castellanii monolayers जंगली प्रकार एल के साथ संक्रमित चित्रण भड़काना चरण के दौरान pneumophila चित्रा 1A में दिखाया गया है. भड़काना कदम के एक सफल उपाय मेजबान बड़े इस MOI में GFP लेबल बैक्टीरिया के साथ आबादी vacuoles युक्त कोशिकाओं का लगभग 90% की आबादी के लिए नेतृत्व करेंगे. 18 घंटे के बाद संक्रमण, सबसे ए castellanii कोशिकाओं अधिकतम बैक्टीरियल भार हासिल किया है अभी तक जनसंख्या का lysis न्यूनतम है. प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत, एक सफल भड़काना संक्रमण गोल और अलग amoebae प्रकट होगा. Gentamycin [25 / छ एमएल] संस्कृति 30 मिनट से 1 घंटे के बाद संक्रमण माध्यम कोशिकी बैक्टीरिया के योगदान को समाप्त करने के लिए जोड़ा जा सकता है. Δ DotA उत्परिवर्ती तनाव, जो effectors के स्थानान्तरण / डॉट ICM की मध्यस्थता का समर्थन नहीं कर सकते में नहीं जाना चाहिएए castellanii और हालांकि इन विट्रो संस्कृति में जंगली प्रकार के तनाव के रूप में अच्छी तरह से प्रतिदीप्ति होना चाहिए, कम से कम प्रतिदीप्ति 18 घंटा पोस्ट संक्रमण में इस तनाव के साथ पता लगाया जा चाहिए. Amoebae फ्लैट दिखाई देगा और monolayer बरकरार होना चाहिए.

कुल एल को शरण देने lysates pneumophila और मेजबान सेल मलबे तुरंत spectrophotometric विश्लेषण करने के लिए अधीन हैं क्रम में नमूने में बैक्टीरिया की एकाग्रता की गणना करने के लिए. MOI सहसंबंध वक्र (1 चित्र *) का उपयोग कर की गणना की जा सकती है. लक्ष्य कोशिकाओं को इस तरह के संक्रमण के लिए तैयार किया जाना चाहिए कि primed बैक्टीरिया कम से कम 30 मिनट का उपयोग किया जाता है lysis के बाद जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल की अखंडता की रक्षा के लिए. एक बार संक्रमित, लक्ष्य कोशिकाओं 14-18 घंटे के लिए incubated रहे हैं और इससे पहले कि वे संसाधित कर रहे हैं. चित्रा 1 बी में प्रतिदीप्ति micrographs रोगजनक प्रोटोजोआ - primed जंगली प्रकार एल द्वारा अधिग्रहीत लाभ प्रदर्शित के लक्ष्य कोशिका चरण संक्रमण में pneumophila सीastellanii जब समान तनाव है कि संक्रमण के लिए पहले इन विट्रो खेती में सीमित किया गया था की तुलना में. लक्ष्य कोशिका चरण संक्रमण कम भड़काना एक धोने कदम 1-2 घंटा संक्रमण पोस्ट (लक्ष्य कक्ष पर निर्भर) के शामिल किए जाने के कारण चरण की तुलना में मजबूत कर रहे हैं. यह मीडिया प्रतिस्थापन कदम गैर इनवेसिव बैक्टीरिया को हटा, संक्रमण synchronizing और बाद के अनुप्रयोगों में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम आंकड़े 1C - डी एक विशिष्ट प्रकार के जंगली एल प्रतिदीप्ति micrographs का प्रदर्शन pneumophila संक्रमण दो चरण परिदृश्य, जहां बैक्टीरिया 1 के संक्रमण के माध्यम से primed हैं lysed प्रोटोजोआ कोशिकाओं से काटा castellanii,, सहसंबंध वक्र का उपयोग quantified और 14 घंटे के लिए THP एक मैक्रोफेज को संक्रमित करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

माइक्रोस्कोपी के बाद, कोशिकाओं प्रवाह cytometry (बी FACS Calibur) के लिए trypsinized कर रहे हैं. असंक्रमित कोशिकाओं आगे और पक्ष तितर बितर के लिए मशीन को जांचना के लिए किया जाता है. प्रत्येक तनाव से संक्रमण की प्रक्रिया कर रहे हैं20,000 घटनाओं के साथ एड दर्ज की गई. FlowJo 7.6.1 सॉफ्टवेयर कच्चे डेटा का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. आमतौर पर, प्रतिदीप्ति (488 एनएम उत्तेजना) 1 पक्ष तितर बितर के खिलाफ साजिश रची है असंक्रमित सेल की आबादी का पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की पहचान. भूखंड इस आबादी और प्रतिदीप्ति तीव्रता बनाम कुल गिनती के एक हिस्टोग्राम के रूप में फिर से प्लॉट किए जाते हैं बाहर gated हैं. क्योंकि प्रत्येक बैक्टीरियल सेल प्रतिदीप्ति, संकेत की तीव्रता के एक इकाई का प्रतिनिधित्व करता है प्रत्येक संक्रमित कोशिका में vacuolar लोड का एक प्रतिनिधित्व देता है. एक जंगली प्रकार के संक्रमण का एक विशिष्ट साजिश चित्रा 1E में दिखाया गया है. कुल मिलाकर, संक्रमित प्रवाह cytometer द्वारा पाया कोशिकाओं के रिश्तेदार की संख्या कम से प्रत्याशित जब माइक्रोस्कोपी डेटा के साथ तुलना की है. लाइव सेल प्रवाह cytometry काफी संवेदनशील लेकिन तनाव प्रसरण का पता लगाने के लिए है.

नमूनों में कुल CFU की मात्रा कोशिकाओं के धारावाहिक dilutions प्रवाह cytometry और बाद में चढ़ाना के लिए तैयार पैदा करने के द्वारा किया जाता हैCYEA मीडिया पर. 37 में 72 घंटे के बाद डिग्री सेल्सियस, एकल कालोनियों स्पष्ट और गिनती के लिए काफी विरल होना चाहिए.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रोटोजोआ भड़काना और लक्ष्य कोशिका चरण संक्रमण लीजोनेला pneumophila का उपयोग. ए जंगली प्रकार या प्रकार चतुर्थ स्राव की कमी एलDotA) pneumophila उपभेदों के माध्यम से इन विट्रो संस्कृति (छोटे फ्रेम) में GFP व्यक्त करने के लिए प्रेरित किया गया और को संक्रमित करने के लिए प्रयोग किया जाता है MOI = 20 पर 18 घंटे के लिए castellanii monolayers. प्रत्येक एल के साथ संक्रमण प्रतिदीप्ति micrographs pneumophila तनाव (बड़े फ्रेम) चरण विपरीत और एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (AMG EVOS fl) पर एक 20X उद्देश्य के साथ 512 एनएम प्रतिदीप्ति छवियों ई के विलय के रूप में दिखाया जाता है. ग्रीन crescents intracellular vacuolesharbori के प्रतिनिधिएनजी एल pneumophila 18 घंटा के लक्ष्य कोशिका चरण संक्रमण के बी GFP प्रतिदीप्ति micrographs एल के साथ जंगली प्रकार castellanii pneumophila प्रोटोजोआ भड़काना चरण संक्रमण (शीर्ष) से या सुसंस्कृत इन विट्रो (नीचे), जहां MOI = 10 के लिए प्रत्येक सहसंबंध दिखाया अवस्था (* नीला) से व्युत्पन्न समीकरण का उपयोग कर की गणना की थी. में काटा वक्र जंगली प्रकार एल धारावाहिक dilutions का उपयोग कर उत्पादन किया गया था pneumophila इन विट्रो संस्कृति में एक घंटा 18 से GFP व्यक्त सी. के एक भड़काना चरण संक्रमण के प्रतिदीप्ति माइक्रोग्राफ. एल के साथ जंगली प्रकार castellanii pneumophila (ए) डी. PMA के एक 14 घंटा लक्ष्य कोशिका चरण संक्रमण जंगली प्रकार एल के साथ THP एक मैक्रोफेज विभेदित प्रतिदीप्ति माइक्रोग्राफ में pneumophila (सी) में प्रोटोजोआ भड़काना चरण संक्रमण से काटा जाता है. MOI = 20 भ्रष्टाचार से व्युत्पन्न समीकरण का उपयोग कर की गणना की थीसंबंध वक्र दिखाया गया है (नीला *). दिखाया फ्रेम चरण विपरीत और E512 प्रतिदीप्ति छवियों एनएम के (ए) प्रवाह cytometry असंक्रमित THP 1 (लाल) मैक्रोफेज और प्रोटोजोआ primed जंगली प्रकार एल के साथ संक्रमित कोशिकाओं की तुलना डेटा के ई. हिस्टोग्राम साजिश में एक मर्ज pneumophila (हरा). पैमाने बार = 100 सुक्ष्ममापी बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

बैक्टीरियल जीन की अभिव्यक्ति कसकर जीवन चक्र प्रगति और आसपास के microenvironment में संकेतों की प्रतिक्रिया का एक संयोजन के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है. एल के रूप में इस तरह के Vacuolar रोगज़नक़ों pneumophila मेजबान सेल व्युत्पन्न cues की एक भीड़ के लिए जवाब जब एक फेगोसोम में बंटे. मेजबान सेल में पोषक तत्वों की थकावट का सामूहिक परिणाम के रूप में, जीवाणु एक बाद मेजबान सेल 25 के सफल प्रचार - प्रसार के लिए आवश्यक कारक व्यक्त compensates एल. pneumophila कुशलतापूर्वक प्रोटोजोआ कोशिकाओं की एक विस्तृत विविधता पराश्रयी होकर लेगना अनुकूलित और इसलिए effector प्रोटीन की एक व्यापक सूची के लिए इस प्रक्रिया को ड्राइव harbors. इन effector प्रोटीन सीधे मेजबान cytoplasm में translocated / डॉट ICM प्रकार IVB स्राव 16 प्रणाली के द्वारा संक्रमण के दौरान. Effector प्रोटीन स्थानान्तरण, म्यूटेशनों कि एक दोषपूर्ण ट्रांसपोर्टर में परिणाम पूरी तरह से किसी भी मेजबान सेल प्रकार में intracellular विकास रद्द करने के रूप में आवश्यक है. अनोखी कलात्मक वस्तुएँusly, विशेष effector प्रोटीन में व्यक्तिगत विलोपन शायद ही कभी intracellular विकास क्षीणन में हुई. लगभग 300 effector प्रोटीन, या प्रोटीन एन्कोडिंग जीनोम के लगभग 10% / डॉट ICM 14,15 substrates के रूप में मान्य किया गया है. कई hypotheses effector हटाना, paralogous प्रतियों की उपस्थिति या orthologous एंजाइमों की क्षैतिज अधिग्रहण एल के विस्तृत मेजबान रेंज से उत्पन्न सहित लिए नमूदार phenotypes की कमी की व्याख्या करने के लिए उभरा है pneumophila.

क्योंकि एल pneumophila एक रोगजनक लाभ लाभ जब प्रोटोजोआ कोशिकाओं (आंकड़े 1A-B) में पूर्व सुसंस्कृत, हम तर्क है कि इन विट्रो सुसंस्कृत बैक्टीरिया में एक ही जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल स्पष्ट निकल प्रोटोजोआ मेजबान बैक्टीरिया में प्रदर्शित नहीं होगा. इसलिए, केवल विशेष effector प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रोटोजोआ कोशिकाओं में intracellular विकास के संदर्भ में प्रेरित किया जा सकता है. यदि किसी विशेष effector ई के लिए प्रेरित किया गया थाइन विट्रो संस्कृति में के दौरान नष्ट कर दिया effector के योगदान से xpression, प्रभावी ढंग से एक पारंपरिक संक्रमण परिदृश्य में मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है. डाह संक्रमण या प्रसार की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण कारकों के लिए phenotypes केवल लंबे समय तक संक्रमण है कि सेल प्रसार के लिए सेल के लिए अनुमति में पता लगाया जाएगा. इसलिए हम एक परख है कि एक क्रमिक संक्रमण के संदर्भ में संभावित विषैलापन कारकों का योगदान उपाय कर सकता है विकसित करने की मांग की. प्राकृतिक एल के मामले में pneumophila अधिग्रहण, यह संभावना है कि एक मानव मेजबान एक जीवाणु कि एक प्रोटोजोआ सेल में किया गया था संक्रमण के लिए primed मुठभेड़ होगा, जहां protozoans अधिक पारंपरिक नगर निगम के जल उपचार 10 प्रथाओं के लिए प्रतिरोधी हो सकता है.

आदेश में primed जीवाणुओं की पर्याप्त मात्रा के आंशिक शुद्धिकरण का अनुकूलन के लिए, हम पहले एल के एक नेत्रहीन विनयशील तनाव की स्थापना IPTG inducible GFP यू का उपयोग pneumophilaGFP बिन्दुपथ के प्लाज्मिड वहन प्रतिलिपियाँ गाना. हम भी प्रकार के जंगली जीनोम पर inducible GFP IPTG गुणसूत्र की एक प्रति प्रविष्टि उत्पन्न. हालांकि दोनों उपभेदों में इन विट्रो और संक्रमण के दौरान प्रतिदीप्ति, उच्च प्लाज्मिड जनित GFP की प्रतिलिपि संख्या परख में बहाव के अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त संकेत का उत्पादन किया. हम की स्थापना की है कि शोरबा सुसंस्कृत एल का उपयोग एक MOI = 20 pneumophila भारी को संक्रमित करने के लिए पर्याप्त था castellanii monolayers. ऊष्मायन अठारह घंटे मेजबान सेल (चित्रा 1 ए) के एक स्तर तक पहुँचने के बिना बड़े फ्लोरोसेंट vacuoles कल्पना इष्टतम के रूप में निर्धारित किया गया था. प्रोटोजोआ monolayers सेल संस्कृति प्लास्टिक का पालन नहीं कर रहे हैं, और इसलिए आसानी से वाशिंग कदम के साथ परेशान. 12 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों सबसे स्थिर monolayers उत्पादित जब अन्य जहाजों (6 या अच्छी तरह से 24, 10 सेमी पकवान) के साथ तुलना में. क्योंकि एल pneumophila मध्यम संक्रमण वीं में इस्तेमाल में विकसित नहीं कर सकताई भड़काना कदम है, हम करने के लिए किसी भी धोने कोशिकी बैक्टीरिया को दूर करने के लिए कदम का परित्याग करने के लिए चुना है. यह बहुत monolayer में संक्रमित अमीबा की उपज में सुधार. Gentamycin भी अक्सर कोशिकी जीवाणुओं को मारने के लिए इस्तेमाल किया. हम 25 ग्राम / मिलीलीटर से ऊपर सांद्रता में प्रोटोजोआ विषाक्तता प्रभाव पाया गया, और 18 घंटा भड़काना चरण संक्रमण से बरामद बैक्टीरिया की कुल संख्या में कोई अंतर पाया गया. प्रोटोजोआ सेल monolayer की lysis एल को नुकसान पहुँचाने के बिना बर्फ के ठंडे अति फ़िल्टर्ड एच 2 हे, एक विलायक कि osmotically मेजबान सेल समझौता के साथ प्रदर्शन किया गया था pneumophila. यदि रोगज़नक़ों कि एच 2 हे में स्थिर नहीं कर रहे हैं के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित 0.1% ट्राइटन पीबीएस में X-100 के लिए इसी तरह के परिणाम के साथ amoebae lyse करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

आदेश में सीधे बाद लक्ष्य सेल संक्रमण में मतभेद तनाव तनाव की तुलना करने के लिए एक समीकरण GFP प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के साथ 600 एनएम पर 512 एनएम (Figur पर जीवाणुओं की ऑप्टिकल घनत्व सहसंबंधी उत्पन्न किया गयाई 1 *). हम आयुध डिपो यूकेरियोटिक सेल lysates से 600 माप में मेजबान सेल मलबे के बड़े योगदान के कारण मात्रा का ठहराव के लिए एक साधन के रूप में प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का उपयोग करने के लिए चुना. इस उच्च पृष्ठभूमि नगण्य ही lysates से 512 एनएम पर उत्सर्जन के लिए मनाया मूल्यों के साथ विषम. आयुध डिपो के 600 मान 1.0 = 1x10 9 CFU / एमएल एल के लिए पूर्व निर्धारित किया गया है pneumophila, प्रतिदीप्ति मूल्यों की एक विस्तृत श्रृंखला पर बैक्टीरियल एकाग्रता की गणना के लिए अनुमति देता है. कई जीवों CFU 600 आयुध डिपो के लिए मूल्यों की स्थापना की है = 1.0 है, जो किसी भी अन्य रोगज़नक़ एक सहसंबंध प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के आधार पर वक्र की पीढ़ी के माध्यम से इस तकनीक को लागू करने के लिए अनुमति होगी. हम प्रोटोजोआ कोशिकाओं के lysis दौरान एक जीवाणु शुद्धि कदम से बचने के क्रम में 1) primed बैक्टीरिया की लक्ष्य सेल संक्रमण के लिए उपलब्ध उपज को अधिकतम करने के लिए और 2) वैश्विक जीन अभिव्यक्ति पी की रक्षा फसल और बाद के संक्रमण के बीच समय कम से कम करने के लिए चुनाatterns.

इन विट्रो सुसंस्कृत जंगली प्रकार एल में pneumophila 1 मिमी IPTG के साथ 18 घंटे के लिए GFP व्यक्त करने के लिए प्रेरित किया गया था. इस संस्कृति के सीरियल dilutions spectrophotometric माप के लिए इस्तेमाल किया गया. व्युत्पन्न समीकरण का प्रयोग, लक्ष्य कक्ष संक्रमण नियमित रूप से लगातार उत्पादन के साथ चर MOI में प्रदर्शन किया. एक 10 के MOI लगभग 1/2 कुल संक्रमित कोशिकाओं की संख्या जब संक्रमण है कि एक 20 (आंकड़े 1A-B) MOI प्राप्त की तुलना में उत्पादन किया. हम इस परख के साथ तीन लक्ष्य सेल मेजबान का परीक्षण किया है, ए castellanii, murine J774 मैक्रोफेज और मानव PMA-विभेदित THP 1 मैक्रोफेज. प्रत्येक उदाहरण में, जिसके परिणामस्वरूप संक्रमण के रूप में MOI वही (आंकड़े 1C - डी) भड़काना संक्रमण के रूप में मजबूत नहीं था. हमने निर्धारित किया है कि कि लक्ष्य कोशिका चरण संक्रमण के दौरान एक अतिरिक्त धोने कदम, जो दोनों लक्ष्य सेल संक्रमण सिंक्रनाइज़ और कोशिकी बैक्टीरिया को कम करने के लिए किया जाता है resp हैइस अवलोकन के लिए onsible. फिर भी, यह महत्वपूर्ण है कि प्रयोग आंतरिक दोनों भड़काना और लक्ष्य कोशिका चरण में संक्रमण के लिए एक जंगली प्रकार के तनाव के साथ नियंत्रित किया जाता है. बैक्टीरियल भड़काना चरण में बरामद मात्रा के बजाय बाद में संक्रमण के लिए सीमित है, इसलिए केवल एक ही लक्ष्य सेल प्रकार के प्रयोग के प्रति इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

लक्ष्य सेल की संक्रमण की मात्रा इस परख में तीन तरीकों का उपयोग कर हासिल की थी. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एक 20X उद्देश्य के साथ इस्तेमाल किया गया था. एल को शरण देने vacuoles की छवियाँ pneumophila स्वयं प्रत्येक परीक्षण तनाव के लिए कई क्षेत्रों से गिना रहे थे. फ्लो cytometric विश्लेषण कुल कोशिकाओं में मतभेद संक्रमित vacuolar लोड के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक सन्निकटन के लिए एक संवेदनशील उपाय प्रदान की है, जहां एक उच्च प्रतिदीप्ति संकेत GFP संकेत के योगदान के साथ एल की बढ़ती संख्या से सहसंबद्ध था pneumophila कोशिकाओं. सीरियल कमजोर पड़ने चढ़ाना कुल संख्या के लिए मात्रात्मक मान प्रदानCFU सेल प्रवाह cytometry के लिए एकत्र नमूनों में मात्रा के अनुसार. सामूहिक रूप से, इन तरीकों में एक अनुक्रमिक संक्रमण परिदृश्य में पूरी तरह से विनयशील और quantifiable परिणामों के लिए अनुमति देते हैं.

भड़काना परख काफी बहुमुखी है और अनुकूलन के लिए किसी भी जीवाणु रोगज़नक़ है कि एक पर्यावरण 29,3 मध्यवर्ती के रूप में मीठे पानी protozoans का उपयोग करता है के लिए अनुकूल है. लक्ष्य सेल का चुनाव करने के लिए विशेष रूप से रोगज़नक़ के लिए प्राकृतिक संक्रमण मार्ग फिट catered किया जा सकता. महत्वपूर्ण बात है, एक अनुक्रमिक संक्रमण मॉडल उत्परिवर्ती उपभेदों है कि एक पारंपरिक संक्रमण इन विट्रो सुसंस्कृत बैक्टीरिया में प्रयोग मॉडल में एक विकास phenotype के साथ नहीं मौजूद था की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रकल्पित विषैलापन कारकों लिए इन विट्रो सुसंस्कृत बैक्टीरिया में transcriptional रूपरेखा संक्रमित मध्यवर्ती मेजबान में अभिव्यक्ति की प्रोफाइल में महत्वपूर्ण अंतर बता सकता. यह uncharacterized प्रोटीन और उनके योगदान के समारोह के लिए प्राकृतिक जांच की एक नई लाइन खोल सकता हैसंक्रमण मार्गों.

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Disclosures

लेखक का घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.

Acknowledgements

हम प्रोटोजोआ सेल संक्रमण के लिए एक खाका उपलब्ध कराने के लिए डॉ. क्रेग रॉय और डॉ. Dario Zamboni धन्यवाद. पांडुलिपि के महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए डॉ. Lulu Cambronne, हम डा. जगदीप Obhrai, डॉ. Georgiana Purdy, डा. फ्रेड Heffron और उपकरणों और अभिकर्मकों के लिए टोड Wisner धन्यवाद. प्रवाह cytometry OHSU फ्लो साझा संसाधन सुविधा पर प्रदर्शन किया था. इस काम के हिस्से में ओरेगन और एक NIH अनुदान R21 AI088275 (EDC) के मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
chloramphenicol Fisher Scientific BP904-100 antibiotic
IPTG Fisher Scientific BP1755-10
ACES Sigma A9758-1KG media component
ATCC medium: 712 PYG ATCC growth media for protozoans
1X PBS Fisher Scientific SH30256FS phosphate buffered saline
activated charcoal Fisher Scientific C272-212 media component
yeast extract Fisher Scientific BP1422-500 media component
peptone BD Diagnostics 211677 media component
agar Fisher Scientific BP1423-2 media component
L-cysteine, 99%+ Acros organics 173601000 media supplement
Ferric nitrate nonahydrate Fisher Scientific I110-100 media supplement
Equipment
EVOS fl AMG EVOS fl fluorescence microscope
Smart Spec Plus Bio-Rad 170-2525 spectrophotometer
5810 R centrifuge Eppendorf 22627023 bench top centrifuge
Repeater plus Eppendorf 22230201 repeating pipette
SpectraMax Gemini EM Molecular Devices microplate reader
Softmax Pro 5.3 Molecular Devices 0200-310 microplate reader software
5424 microfuge Eppendorf 22620401 table top microcentrifuge
Fast-release pipette pump II Scienceware 379111010 pipette aid
FACS Calibur BD Bioscience flow cytometer
FlowJo 7.6.1 FlowJo license flow cytometery software
15 ml tube BD Falcon 352096 polypropylene conical tube
1.6 ml microfuge tube Neptune 3745.X microcentrifuge tubes

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References

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