Protozoan - 중이오 박테리아와 취급하기 쉬운 포유류의 세포 감염

Published 4/02/2013
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Immunology and Infection

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Summary

이 기술은 이전 포유류의 세포의 감염에 대한 자연 protozoan 호스트 세포에 미리 재배되고 세균 병원균의 세포 성장을, 수확 정상화하고 계량화 할 수있는 방법을 제공합니다. 이 메소드는 프라이밍 단계뿐만 아니라 대상 셀 유형에 대한 호스트 세포의 다양한 수용하기 위해 수정할 수 있습니다.

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Drennan, S. L., Lama, A., Doron, B., Cambronne, E. D. Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria. J. Vis. Exp. (74), e50300, doi:10.3791/50300 (2013).

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Abstract

대부분의 세포 내 세균 병원균이 있습니다. 환경에서 확산을위한 자연 저수지로 민물 protozoans를 사용하여 Legionella pneumophila, 부대 '폐렴의 원인이되는 에이전트는 먼저 이전 포유류의 대 식세포의 감염 protozoan 세포에서 수확 체외 배양 균에 비해 병원성 이점을 얻게되었습니다. 이 중요한 독성 요소가 제대로 체외로 표현되지 않을 수 있습니다 제안합니다. 우리는 프라이밍 L.위한 다루기 쉬운 시스템을 개발 포유류의 세포 감염에 대한 자연 protozoan 호스트 Acanthamoeba castellanii을 통해 pneumophila 사전. 모든 독성 요소의 기여는 protozoan의 프라이밍 후 야생 형 박테리아에 돌연변이 변종의 세포 성장을 비교하여 검사 할 수 있습니다. GFP-표현 야생 타입과 돌연변이 L. pneumophila의 긴장은 프라이밍 단계에서 protozoan monolayers를 감염하는 데 사용과 세포 성장의 후반 단계에 도달 할 수 있습니다. 형광 박테리아는 다음이 감염된 세포를 채취와 포유류의 대 식세포에 후속 감염 박테리아의 비교 숫자를 생성하는 분광 광도법에 의해 표준화되어 있습니다. 정량화를 들어, 라이브 박테리아는 형광 현미경, 유동 세포 계측법, 그리고 식민지 도금하여 사용 감염 후 모니터링됩니다. 이 기술은 강조하고 자연 수집 경로에 발생 될 환경을 모방하여 호스트 세포에 의존 유전자 발현의 기여에 의존하고 있습니다. 이 방법은 병원성 우위를 확보하기위한 수단으로 중간 호스트를 사용하는 세균을 수용하기 위해 수정할 수 있습니다.

Introduction

수많은 세균 병원체는 세포 내 구획의 생존과 복제 호스트 세포를 이용하기 위해 일반화 된 전략을 적응하고 있습니다. 많은 경우, 병원성 메커니즘은 protozoan과 metazoan 세포 사이의 비슷합니다. 그러나,이 두 microenvironments은 매우 다른과 독성 요인 1-4의 미분 표현 될 수 있습니다. 이 부대 '병 박테리아 Legionella pneumophila는 ubiquitously 5 전 세계적으로 담수 환경과 연결되어 있습니다. 중요한 것은, L. pneumophila는 유전자 6-8을 재배에서 체외보다 다른 protozoan 셀을 종료 세균의 글로벌 유전자 발현 프로파일을 제안, 인간 단핵 세포 병원성 이득의 감염 이전에 protozoan 세포에서 재배. 자연에서 민물 amoebae는 침입 세균의 급속한 확대를 위해 영양이 풍부한 굴레를 제공합니다. L. 인간의 취득 pneumophila는 대개 세균을 포함 오염 된 물방울의 흡입에 따라 결정됩니다. 그것은 가능성이 이러한 방울 항구 protozoan 세포 관련 세균이, protozoan 전지는 기존의 수처리 관행 9,10에 더 강한 위치. 11-13 protozoan 호스트 세포에서 세균의 세포 수명주기와 거의 동일한 방식으로 폐 폐포 대 식세포 진행의 감염.

생존과 진핵 세포에서 복제하기 위해, L. pneumophila 다트 / ICM은 숙주 세포 14-16의 세포 기질에 거의 300 '이펙터'단백질을 제공하는 칭했다 전문 유형 IVb 분비 시스템을 사용합니다. 이러한 효과기 단백질은 집합 적으로 세균 17,18의 복제 허용 구획을 생성하기 위해 셀룰러 프로세스를 파괴하는 기능을 수행합니다. 세포 복수에 결함이있는 변종의 점 / ICM 전송 결과를 구성하는 26 유전자의에서 삭제iplication 19-23. 역사적으로, 개별 이펙터 인코딩 유전자의 삭제는 거의 세포 성장을위한 감쇠 변종이 발생하지 않습니다. 이러한 현상은 중복 기능과 effectors의 paralogous 사본 등 여러 가지 가설에 기인되었습니다.

일부 독성 요소는 호스트 세포 관련 세포 성장 (24)의 맥락에서 표현됩니다. 우리는 특정 이펙터 만 protozoan 감염의 맥락에서 표현 된 경우, 이펙터의 노력이 모두 체외에서 배양 된 야생 타입의 변형과 비교되지 않을 수 rationalized. replicative에서 투과성 단계로 L. pneumophila는 전환이 문화 25 고정 단계에 들어가면서. 위상 전환 표현형은 세포 성장을하는 동안 발생 및 운동성 26 flagella의 조립을 통해 예시되어있는 영양소를 고갈를 나타냅니다. 때문에 L. pneumophila 더 inva입니다protozoan 세포에서 수확 때 sive 및 악성, 우리는 호스트 대 식세포가 발생 될 때 더욱 충실 세균의 병원성 상태를 표현하는 검정을 개발을 모색하고 있습니다.

이를 위해, 우리는 첫 번째 (프라이밍 세포)와 두 번째 (대상 셀) 무대 감염 모두에 대한 적절한 호스트를 수용 할 수있는 다목적 protozoan의 프라이밍 분석을 개발했습니다. 감염 과정은 안정적으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 박테리아의 사용을 통해 다루기 쉬운 것입니다. protozoan Acanthamoeba castellanii의 감염 모델은 널리 필드에 27에서 사용되는 방법론을 따른다. 프라이밍 단계 L.에게 들어 pneumophila의 긴장이 표시 '투과성'박테리아를 (그림 1A) 생산 액체 미디어에 고정 단계로 체외에서 재배되고있다. 박테리아는 다음 A.의 monolayers를 감염하는 데 사용됩니다 castellanii 18 시간 동안 세포 생활주기의 후반 단계를 달성합니다. 대형 액포가 포함되어ING 박테리아는 형광 현미경 (그림 1A)를 사용하여이 시점에서 시각화 할 수 있습니다. Protozoan 전지는 다음 lysed되고 lysate에서 발견 한 박테리아는 형광 플레이트 리더를 사용하여 512 nm의에서 방출 측정합니다. 형광은 타겟 세포의 감염 (그림 1, * 상관 관계 곡선)에 대한 다중성 수준의 감염 (나 역시)를 계산하는 광학 밀도와 상관 있습니다. 침공 (T 0) 18 시간 후 침공 (T 18) 후, 대상 세포는 세포 내 박테리아를 대표하는 형광에 대한 평가합니다. 형광은 현미경과 유동 세포 계측법에 의해 모니터링 할 수 있으며, 가능한 카운트는 식민지 도금을 통해 측정 할 수 있습니다. 프라이밍 분석은 항상 야생 형 L.과 감염에 의해 동반 pneumophila 및 도트 / ICM 유형 IV 분비 시스템 (Δ dotA) (그림 1A)에 결함이 부담. 이 중요한 야생 형 사이의 직접 비교에 대한 내부 통제를 제공합니다감염 과정에 사용되는 차있는 isogenic 돌연변이 변종. 프라이밍 단계 동안 avirulent Δ dotA 변형의 포함은 체외에서 배양 아르 isogenic 돌연변이 변종과 관련된 감쇠 성장 phenotypes의 관찰에 대한 임계 값을 설정합니다.

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Protocol

1. 프라이밍 단계 감염에 대한 Legionella pneumophila의 문화의 작성

  1. 모든 L. 변환 이소 프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 인코딩 플라스미드 pAM239과 분석에 사용 pneumophila의 변종은 녹색 형광 단백질 (GFP) 28 inducible. 연속은 철과 시스테인로 박테리아 변종은 숯불 효모 추출물 한천 (CYEA)는 6.25 μg / ML chloramphenicol (CM) (플라스미드 유지 보수 용)과 72에 품다를 포함하는 버퍼 N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic 산을 (ACES) 보충 37 번 시간 ° C.
  2. 보충 ACES에 박테리아 스트레인의 inoculum는 6.25 μg / ML의 CM과 1 밀리미터 IPTG로 (예) 효모 추출물의 국물을 버퍼 전송 37에 궤도 셰이커에 고정 단계 (O / N)으로 육성 ° C.
  3. 형광 현미경을 사용하여 체외 문화에서의 GFP 발현을 확인합니다. 덮개를 유리 슬라이드에 문화의 10 μl를 전송슬립와 GFP의 여기 / 방출 큐브 (AMG EVOS 층)와 60X 목적을 사용하여 이미지입니다.
  4. 멸균 H 2 O를 사용 1시 10분에 체외 문화의 각 100 μl 나누어지는을 희석 1 ㎜의 IPTG, 6.25 μg / ML의 cm 물과 빈 네 100 μl를 사용하여 미디어를 확인합니다. 분광 광도계를 사용하여 dilutions의 OD600 측정 (바이오 RAD 스마트 사양 플러스)를보십시오. 체외 문화에 각각에 대해 나 역시 = 20에서 잘 감염에 볼륨이 필요한 계산 : V = [(아메바 시드) × - 나] / [OD 600 X (희석 계수) × (상수)] = [(1 X 10 6 ) × (20)] / [OD 600 X (10) X (1 × 10 6)] = 2/OD 600. 박테리아의 농도는 OD 600에 따라 결정된다 = 1.0 = 1 × 10 9 CFU / ML.

2. Acanthamoeba castellanii를 사용하여 프라이밍 단계 감염

  1. 유지 RT에서 175cm 플라스크에 ATCC 712 PYG 매체에 amoebae을 배양.
  2. amoebae 막에서 미디어를 교체tures 박테리아 액체 문화를 시작하기 전에 24 시간. 같은 날 액체 박테리아 문화가 시작되며, 수집하고 hemocytometer를 사용하여 가벼운 현미경에 셀을 계산합니다.
  3. 1 개 10 6 세포 / ML의 최종 농도에 새로운 미디어 amoebae을 희석. amoebae 1 ML의 aliquots로 씨는 12도 세포 배양 접시 RT O / N.에서 반복 pipettor과 품다를 사용하여
  4. 부화 후, 1 ML 멸균 PBS는 10 ML 혈청 학적의 피펫과 피펫 수동 보조를 이용한 3 배 12도 세포 배양 플레이트의 우물을 씻는다.
  5. PBS의 흡인 후, 1 ㎜의 IPTG와 각도에 6.25 μg / ML cm로 감염 미디어 (ATCC 712 PYG 미디어 마이너스 포도당, 펩톤, 그리고 효모 추출물)의 1ml를 추가합니다. 1 시간에 RT에있는 접시를 품다.
  6. 나 역시 = 20에서 우물을 감염. 5 분 (Eppendorf 5810R) 400 XG에서 판을 원심 분리기 5 분에 37 ° C의 물을 욕조에 떠. 37 ° C, 18 시간에 대한 5퍼센트 CO 2 인큐베이터로 판을 전송합니다.
  7. 박테리아의 세포 용해와 수확을 호스트하기 전에 형광 현미경에서 라이브 셀 이미징을 사용하여 감염을 확인합니다.

3. 대상 셀 무대 감염에 대한 THP-1 세포을 퍼 뜨리고

  1. (사전 액체 박테리아 문화를 설정하고이 과정을 24 시간을 시작합니다). 10% 열 inactivated 태아 소 혈청 (FBS)와 RPMI 1640 미디어 가까운 confluency에 75cm 문화 플라스크에 THP-1 세포를 배양.
  2. hemocytometer를 사용하여 정지 세포 수를 계산, 1 × 10 6 세포 / ML의 농도 10 % FBS, 100 NG / ML phorbol-12-myristate-13-아세테이트 (PMA)를 RPMI 1640 미디어 THP-1 세포를 희석 , 및 12도 세포 배양 접시에 1 ML aliquots에서 판. 37 48 시간의 번호판을 길러 ° C, 5 % CO 2.

4. 프라이밍 단계 감염 후 대상 셀 무대 감염 박테리아의 처리

  1. 중이오 amoebae에서 미디어를 대기음.
  2. 를 Lysemoebae는 10 분 동안 RT에서 얼음 차가운, 멸균 초 필터링 (UF) H 2 O와 품다 500 μl을 사용합니다.
  3. 풀 유형을 변형하고 형광 플레이트 리더를 (분자 장치 Spectramax 쌍둥이 EM)을 사용하여 풀링 된 lysates 각각에 대해 E 512 nm의 측정을에 따라 lysates.
  4. - + 0.0019 calcOD 600 = 0.0008 (lysate 배경 E 1024) : 풀링 된 lysates에 대한 OD 600 측정을 계산합니다. 수식이 이전 OD 600 L.의 dilutions의 E 512 nm의 측정을 모두 직접 비교를 그래프화할 수에 의해 결정되었다 체외 문화에 고정 단계 (그림 1 *)에서 pneumophila는 야생 타입의 표현 GFP. 감염된 아메바와 같은 실험 조건에 따라 감염되지 않은 아메바의 lysates은, 빈로 사용 방정식에 포함 된 보정 값 (예를 들면 lysate 배경) 제공됩니다. 볼륨 필요한 t에서 잘 감염 O - 나 = 20 각 lysate 수영장에 대해 계산됩니다 V = [(THP-1 시드) × - 나] / [calcOD 600 X (상수)] = [(1 X 10 6) X (20)] / [calcOD 600 X (1 × 10 6)] = 20 / calcOD 600.
  5. PBS로 3 배 THP-1 세포를 씻어 각도에 1 ML 신선한 RPMI 1640을 (10 % FBS)를 추가합니다. 37 번 1 시간에 품다 THP-1 세포 ° C, 5 % CO 2.
  6. 풀링 된 lysates를 사용하여 - 나 계산에서 THP-1 세포를 감염. 우물 일련의 흐름 cytometric 분석을위한 대조군으로 제공 감염되지 않은 상태로 유지 할 수 있습니다. 프라이밍 단계의 처리는 이하의 30 분에 완료해야합니다. lysates는 감염되기 전에 박테리아 유전자 발현의 변화를 제한하는 얼음에 보관됩니다.
  7. 판을 원심 분리기, 온도를 높이 떠 있으며, 프라이밍 단계에서와 같이 품다.
  8. 한 시간 후 감염, 흡인하여 미디어를 제거하고 세포 박테리아를 제거 할 수 PBS로 3 배 우물을 씻는다.
  9. fre 1 ML을 추가쉬 RPMI 우물에 1,640 (10 % FBS)과 보육에 판을 반환합니다. 바로 미디어 교체 후 시간은 시간 제로 (T 0) 역할을합니다. 37 14-16 시간의 THP-1 세포를 배양 ° C, 5 % CO 2.

5. 실험 분석

5.1 라이브 셀 이미징

감염된 10X에서 형광 현미경 (AMG EVOS 층)를 사용하여 우물 또는 20X 배율 (그림 1A-D) 이미지. 이미지는 프라이밍 단계 및 대상 셀 무대 감염 모두에서 감염의 수준을 결정하는 중 질적 또는 양적 비교할 수 있습니다.

5.2 유동 세포 계측법

  1. 다른 감염의 방출 봉우리는 유동 세포 계측법 (BD FACS Calibur)로 비교할 수 있습니다. 감염된 THP-1 세포를 Trypsinize 부드럽게 피펫으로 PBS에 혼합하여 우물에서 그들을 씻어.
  2. 2 1800 XG 15 ML 팔콘 튜브 및 펠렛에 풀 변형 유형으로 세포를테이블 탑 원심 분리기에 분.
  3. 1 ML PBS에서 알약을 일시 중지하고 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 전송할 수 있습니다.
  4. 1800 X g (Eppendorf 5424)에서 중지를 원심 분리기 1 ML PBS에서 산탄에게 다시 일시 중지합니다. 결과 현탁액이 높은 흐린 경우 (OD 600 ≥ 1.0) 사람들은 흐름 cytometer의 라인 막힘을 방지하기 위해 추가 PBS (1시 3분)에 희석해야합니다.
  5. 흐름 cytometer의 평균에 대한 및 샘플 주사 사이의 세척 단계 살균 필터 PBS를 사용합니다. 이전 대상 셀 감염 샘플의 주입에 감염되지 않은 대상 세포의 전진 /면 분산시킵니다.
  6. 488 nm의 레이저 여기와 FL1 채널을 사용하여 각 조건에 대해 총 20,000 이벤트를 수집합니다.
  7. 게이트 포스트 캡처 전지 인구는 감염되지 않은 세포와 막대 그래프의 플롯 형광 강도 (FlowJo) (그림 1E)를 제외 할 수 있습니다.

5.3 CFU 도금

  1. 효율성 O를 검사유동 세포 계측법에 수확 세포의 CFU 도금에 의해 F 감염. 초 필터링 H 2 10 -1에서 O, 10 -2, 10 -3에서 샘플 시리얼 dilutions을 준비합니다.
  2. 6.25 μg / ML의 CM 각 희석 CYEA 판의 1 / 3로의 플레이트 20 μl.
  3. 72 시간에 37 ° C에서 접시를 품다.
  4. 이쑤시개와 셀 카운터를 사용하여 식민지를 계산합니다.

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Representative Results

전체 감염 프로세스에 대한 일반적인 결과는 그림 1에 설명되어 있습니다. 야생 형 L.에 감염된 A.castellanii의 monolayers을 그린 셀 형광의 micrographs 라이브 프라이밍 단계 동안 pneumophila는 그림 1A에 표시됩니다. 프라이밍 단계의 성공적인 측정이 전부다에서 GFP이라는 세균으로 채워 큰 액포를 포함하는 호스트 세포의 약 90 %의 인구로 이어질 것입니다. 18 인사 후 감염의 대부분의 A. castellanii 전지는 최대 세균 하중을 달성 한 아직 인구의 용해을 최소화합니다. 빛 현미경에서 성공적으로 프라이밍 감염 반올림과 분리 amoebae가 표시됩니다. Gentamycin는 [25 μg / ML] 세포 박테리아의 기여를 제거하기 30 분에서 1 시간 게시물 감염 문화 매체에 추가 할 수 있습니다. effectors의 도트 / ICM로 인한 translocation을 지원할 수 없습니다 Δ dotA 돌연변이 변형은에 성장하지 말아야체외 문화의이뿐만 아니라 야생 형 스트레인과 같은 형광해야하지만, A. castellanii하며, 최소한의 형광은 18 시간 게시물 감염에이 변종을 감지해야합니다. Amoebae은 평면 나타나며 monolayer은 그대로 있어야합니다.

L.를 숨겨 총 lysates pneumophila 및 숙주 세포 파편이 즉시 샘플에서 박테리아의 농도를 계산하기 위해 분광 분석의 대상이됩니다. 나 역시이 상관 관계 곡선 (그림 1 *)를 사용하여 계산 될 수있다. 대상 셀은 유전자 발현 프로파일의 무결성을 유지하기 위해 용해 후 중이오 박테리아가보다 30 분을 사용하는 등 감염을 준비해야합니다. 그들은이 처리되기 전에 한 번 감염, 대상 세포는 14-18 시간에 incubated 수 있습니다. 그림 1B에 형광 micrographs는 protozoan-중이오 야생 형 L.에 의해 인수 병원성 이점을 보여줍니다 A.의 대상 셀 단계 감염에 pneumophila Castellanii 감염 이전 체외 배양에 제한 된 동일한 변형에 비해. 대상 셀 무대 감염은 세척 단계 1-2 인사 후 감염 (타겟 세포 따라 다름)의 포함으로 인해 프라이밍 단계보다 강력합니다. 이 미디어 교체 단계는 감염을 동기화 및 그 이후의 응용 프로그램에서 배경 형광을 감소 비 침습적 세균을 제거합니다. 숫자는 1C-D는 일반적인 야생 형 L.의 형광 micrographs을 보여줍니다 박테리아가 처음 A.의 감염을 통해 중이오 아르 pneumophila 2 단계 감염 시나리오, lysed protozoan 세포에서 수확 castellanii는 상관 곡선을 사용하여 정량 및 14 시간에 THP-1 식세포를 감염하는 데 사용됩니다.

현미경 후, 세포 유동 세포 계측법 (BD FACS Calibur)에 trypsinized 있습니다. 감염되지 않은 세포는 순방향 및 측면 분산을 위해 시스템을 조정하는 데 사용됩니다. 각각의 변형과 감염을 처리하는 아르20000 이벤트와 에드 기록했다. FlowJo 7.6 소프트웨어는 원시 데이터를 분석하는 데 사용됩니다. 일반적으로 형광 (488 나노 미터 여기)이 먼저 감염되지 않은 세포 인구의 배경 형광을 식별 할 측면 분산에 대해 도시된다. 플롯이 인구와 형광 강도 대 총 카운트를 막대 그래프로 다시 - 역모를 제외 할 수 출입을 금지합니다. 각각의 세균 세포는 형광, 신호의 강도의 단위를 나타냅니다 때문에 각 감염된 세포에서 vacuolar 부하의 표현을 제공합니다. 야생 형 감염의 전형적인 플롯은 그림 1E에 표시됩니다. 전반적으로, 흐름 cytometer에 의해 감지 감염된 세포의 상대적인 수는 현미경 데이터를 비교할 때 예상보다 낮습니다. 라이브 셀 유동 세포 계측법 그러나 스트레인 차이를 감지 할 수있을만큼 민감하다.

총 CFU의 샘플에서의 정량화는 유동 세포 계측법 및 후속 도금을 준비하는 세포의 일련 dilutions을 생성하여 수행됩니다CYEA 미디어 있습니다. 37 72 시간 후에 ° C, 단일 식민지가 분명하고 계산에 충분한 희박한해야합니다.

그림 1
1 그림. Protozoan의 프라이밍 및 Legionella pneumophila를 사용하여 대상 셀 단계 감염. A. 야생 형 또는 형식 IV 분비 결함 ​​(Δ dotA) L. pneumophila의 종자는 체외 문화 (작은 프레임)에 통해 GFP를 표현하기 위해 유도와 A.를 감염하는 데 사용 된 나 역시 = 20 18 시간에 대한 castellanii의 monolayers. 각 L.과 감염의 형광 micrographs pneumophila 변형이 상 명암과 형광 현미경 (AMG EVOS 층)에서 20X 목적과 E 512 nm의 형광 이미지를의 병합으로 (대형 프레임) 표시됩니다. 그린 crescents는 세포 vacuolesharbori을 대표하는NG L. A. 18 시간 대상 셀 무대 감염 pneumophila. B. GFP 형광의 micrographs 야생 형 L.있는 castellanii pneumophila는 protozoan 프라이밍 단계 감염 (위)이나 배양 체외 (아래), - 나 = 10 각이 표시된 상관 관계 곡선 (파란색 *)에서 파생 된 방정식을 사용하여 계산되었습니다.에서 수확 곡선은 야생 형 L.의 시리얼 dilutions을 사용하여 제작되었습니다 pneumophila는 체외 문화에 18 시간에서 GFP를 표현. A.의 프라이밍 단계 감염 C. 형광 현미경 야생 형 L.있는 castellanii pneumophila 야생 형 L.와 THP-1 식세포를 차별화 PMA의 14 시간 대상 셀 무대 감염 (A). D. 형광의 현미경에서와 같이 pneumophila는 (C)에 protozoan 프라이밍 단계 감염에서 수확. 나 역시 = 20은 코르에서 파생 된 방정식을 사용하여 계산관계 곡선 (파란색 *) 표시. 표시된 프레임 위상 대비, protozoan 중이오 야생 타입 L.에 감염 감염되지 않은 THP-1 식세포 (빨간색)와 세포를 비교 유동 세포 계측법 데이터 (A). E. 히스토그램의 음모에서와 같이 E512 nm의 형광 이미지를의 병합입니다 pneumophila (녹색). 스케일 바 = 100 μm. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

박테리아 유전자 발현이 밀접하게 생활주기의 진행과 주변 microenvironment의 신호에 응답의 조합을 통해 제어됩니다. 이러한 L. 같은 Vacuolar 병원균 phagosome에 compartmentalized 때 pneumophila는 호스트 세포 유래 단서의 다양한 응답 할 수 있습니다. 숙주 세포에 영양소를 고갈의 집단 결과, 세균은 이후 숙주 세포 25 성공적인 배포에 필요한 요소를 표현하여 보상. L.는 pneumophila 효율적으로 protozoan 세포의 다양한 기생하도록 구성되므로이 과정을 유도 할 수 이펙터 단백질의 광범위한 카탈로그을 비호. 이러한 효과기 단백질은 도트 / ICM 유형 IVb 분비 시스템 (16)에 의해 감염되는 동안 호스트 세포질에 직접 translocated 있습니다. 효과기 단백질 translocation은 결함 전송의 결과는 완전히 다른 숙주 세포 유형의 세포 성장을 폐기하는 변이 등이 필요합니다. 진품usly, 특히 효과기 단백질의 개별 삭제가 거의 세포 성장 감쇠 결과 없습니다. 거의 300 효과기 단백질, 또는 단백질 인코딩 게놈의 거의 10 % 점 / ICM 기판 14,15으로 확인되었습니다. 여러 가설이 paralogous 사본의 존재 나 L.의 다양한 호스트 범위에서 발생하는 orthologous 효소의 수평 취득 등의 이펙터 삭제에 대한 관찰 phenotypes의 부족을 설명하기 위해 등장했습니다 pneumophila.

때문에 L. protozoan 세포 (그림 1A-B)의 사전 양식, 우리는 체외 배양 균에 protozoan 호스트를 종료 세균에 동일한 유전자 발현 프로필이 명백 표시되지 것이라고 판단하면 pneumophila는 병원성 이점을 얻게되었습니다. 따라서, 특정 이펙터 단백질의 표현은 protozoan 세포의 세포 성장의 맥락에서 유도 될 수 있습니다. 특정 이펙터는 전자에 유도되지 않은 경우삭제 된 이펙터의 기여보다 체외 문화에 동안 xpression는 효과적으로 전통적인 감염 시나리오에서 평가 할 수 없습니다. 감염이나 보급의 설립에 중요한 독성 요소에 대한 Phenotypes은 세포 확산에 셀 수 연장 감염에 감지됩니다. 따라서 순차적 감염의 맥락에서 잠재적 인 독성 요소의 기여를 측정 할 수 검정을 개발을 모색하고 있습니다. 자연 L.의 경우 pneumophila 인수, 그것은 인간의 호스트가 protozoan 셀에 감염 중이오 된 박테리아가 발생하는 것입니다 가능성이 높습니다, protozoans는 전통적인시 물 처리 관행 10보다 저항력이 할 수있는.

중이오 박테리아의 충분한 수량의 부분 정화를 최적화하기 위해, 우리는 먼저 L.의 시각적 다루기 쉬운 긴장을 설립 IPTG inducible GFP u를 사용 pneumophilaGFP의 궤적의 플라스미드 매개 사본을 노래. 우리는 또한 야생 형 게놈에 inducible에 GFP를 IPTG 중 하나의 사본 염색체 삽입을 생성. 모두 긴장은 체외과 감염 동안 형광 있지만, 플라스미드을 통한 GFP의 높은 사본 번호는 검정에서 하류 응용 프로그램에 대한 충분한 신호를 생산. 우리는 설립 그 국물 양식 L.를 사용하여 나 역시 = 20의 pneumophila는 많이 A.을 감염에 충분했다 castellanii의 monolayers. 부화 18 시간은 숙주 세포의 용해 (그림 1A)의 단계에 도달하지 않고 큰 형광 액포를 시각적으로 최적으로 결정했다. Protozoan의 monolayers는 세포 배양 플라스틱을 준수하지 않는, 따라서 쉽게 세척 단계를 방해하고 있습니다. 다른 선박 (6 잘 24, 10cm 요리)과 비교하면 12도 세포 배양 플레이트는 가장 안정적인 monolayers을 생산했다. 때문에 L. pneumophila는 일에 사용 된 감염 매체에 성장 할 수 없습니다전자 프라이밍 단계는, 우리는 세포 박테리아를 제거 할 빨래 단계를 포기하기로 결정했습니다. 이 크게 monolayer에 감염된 아메바의 수율을 향상시킵니다. Gentamycin도 종종 세포 박테리아를 죽이는 데 사용됩니다. 우리는 25 μg / ML 위의 농도에 protozoan의 독성 효과를 발견, 18 시간의 프라이밍 단계 감염으로부터 복구 세균의 총 수에 차이를 찾을 수 없습니다. protozoan 세포 monolayer의 용해는 L.를 해치지 않고 얼음 차가운 초 필터링 H 2 O, osmotically 숙주 세포를 손상 해당 용매를 수행 한 pneumophila. H 2 O에서 안정하지 않은 병원체와 함께 사용을위한 적응하면 0.1 %는 트라이 튼 PBS에서 X-100과 비슷한 결과를 amoebae을 lyse 할 수 있습니다.

바로 다음 대상 셀 감염의 차이를 변형하는 변형을 비교하기 위해, 방정식는 512 nm의 (Figur에서 GFP의 형광 방출과 600 nm의에서 박테리아의 광학 밀도를 상관 관계에 생성 된E 1 *). 우리는 진핵 세포 lysates에서 OD 600 측정에서 숙주 세포의 파편 큰 기여로 인해 정량화하기위한 수단으로 형광 방출을 사용하기로 결정했습니다. 이 높은 배경은 동일한 lysates에서 512 nm의에서 방출에 대한 관찰 무시할 값과 대조. OD 600 값은 = 1.0 = 1x10 9 CFU / ML은 L.에 대한 미리되었습니다 형광 값의 넓은 범위의 세균 농도의 계산을 허용하는 pneumophila. 대부분의 생물은 OD 600 CFU 값을 설립 = 형광 방출을 기반으로하는 상관 관계 곡선의 생성을 통해 다른 병원균에이 기술을 적용 할 수 있도록 것 1.0. 우리는) 대상 세포 감염에 사용할 수 중이오 박테리아의 수율을 극대화하고 2) 글로벌 유전자 발현의 P를 유지하기 위해 수확 및 그 이후의 감염 사이의 시간을 최소화 1 위해 protozoan 세포의 용해 동안 세균 정화 단계를 피하기 위해 선택atterns.

체외 배양 야생 형 L.에서 pneumophila는 1 밀리미터 IPTG로 18 시간에 GFP를 표현하도록 유도했다. 이 문화의 시리얼 dilutions은 분광 측정을 위해 사용되었습니다. 파생 방정식 사용하여 대상 셀 감염은 정기적으로 일관성있는 출력 변수 나 역시 집에서 수행되었다. 나 역시 10은 전부다 20 (그림 1A-B)의를받지 감염에 비해 총 감염된 세포의 약 1 / 2 번호를 제작했다. 우리는이 검정는 3 대상 셀 호스트를 테스트 한, A. castellanii, 손쥐 J774 대 식세포과 인간의 PMA 차별화 THP-1 식세포. 각 인스턴스에서 발생하는 감염 (그림 1C-D) - 나 같은에서 프라이밍 감염처럼 강력한 적이 없습니다. 우리는 모두 대상 셀 감염을 동기화하고 세포 박테리아를 줄이기 위해 수행되는 대상 셀 단계 감염시 추가 세척 단계는, resp입니다 것으로 판단이 관찰에 대한 onsible. 그럼에도 불구하고,이 실험이 내부적으로 프라이밍과 대상 셀 단계 감염 모두 야생 타입의 변형으로 제어되는 중요합니다. 프라이밍 단계에서 복구 세균 수량 오히려 이후의 감염에 대한 제한되며, 따라서 단일 대상 셀 유형은 실험에 따라 사용되어야합니다.

대상 셀 감염의 정량화이 분석에서 세 가지 방법을 사용하여 달성되었습니다. 형광 현미경은 20X 목적으로 사용되었습니다. L.을 품고 액포의 이미지 pneumophila는 수동으로 테스트를 각 변형에 대한 몇 가지 분야에서 인정되었다. 흐름 cytometric 분석은 감염 총 세포의 차이뿐만 아니라, vacuolar 부하의 추정을위한 중요한 수단을 제공, 높은 형광 신호는 L.의 증가 숫자에서 GFP 신호의 기여와 상관있는 곳 pneumophila 세포. 시리얼 희석 도금은 총 번호 양적 가치를 제공유동 세포 계측법에 수집 된 세포 샘플에 CFU의 당 볼륨. 이하,이 방법은 순차적 감염 시나리오에서 완전히 다루기 쉬운과 객관적 결과를 수 있습니다.

프라이밍 분석은 매우 다양한 있으며, 환경 중간 29,3로 민물 protozoans를 사용하는 세균 병원균에 적응에 적합합니다. 대상 셀의 선택은 특정 병원체에 대한 자연 감염 경로에 맞게 취사 할 수 있습니다. 중요한 것은, 연속 감염 모델은 체외 배양 균에서 사용하는 전통적인 감염 모델에서 성장 표현형을 표시하지 않은 돌연변이 변종을 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 추정 독성 요소에 대한 체외 배양 균의 전사 프로파일은 감염된 중간 호스트에서 표현의 프로필에 키 차이가 나타날 수 있습니다. 이 자연에 uncharacterized 단백질과 기여의 기능에 대한 조사의 새로운 라인을 열 수감염 경로.

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Disclosures

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

Acknowledgements

우리는 protozoan 세포 감염에 대한 템플릿을 제공하는 박사 크레이그 로이 박사 다리오 잠보니 감사드립니다. 원고의 중요한 검토 박사는 룰루 Cambronne, 우리는 박사 Jagdeep Obhrai 박사 Georgiana 퍼디 박사 프레드 Heffron 및 장비와 시약에 대한 토드 Wisner 감사드립니다. 유동 세포 계측법은 OHSU의 유동 세포 계측법 공유 자원 시설에서 수행되었다. 이 작품은 오리건 주와 NIH 보조금 R21 AI088275 (EDC)의 의학 연구 재단의 교부금으로 일부 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
chloramphenicol Fisher Scientific BP904-100 antibiotic
IPTG Fisher Scientific BP1755-10
ACES Sigma A9758-1KG media component
ATCC medium: 712 PYG ATCC growth media for protozoans
1X PBS Fisher Scientific SH30256FS phosphate buffered saline
activated charcoal Fisher Scientific C272-212 media component
yeast extract Fisher Scientific BP1422-500 media component
peptone BD Diagnostics 211677 media component
agar Fisher Scientific BP1423-2 media component
L-cysteine, 99%+ Acros organics 173601000 media supplement
Ferric nitrate nonahydrate Fisher Scientific I110-100 media supplement
Equipment
EVOS fl AMG EVOS fl fluorescence microscope
Smart Spec Plus Bio-Rad 170-2525 spectrophotometer
5810 R centrifuge Eppendorf 22627023 bench top centrifuge
Repeater plus Eppendorf 22230201 repeating pipette
SpectraMax Gemini EM Molecular Devices microplate reader
Softmax Pro 5.3 Molecular Devices 0200-310 microplate reader software
5424 microfuge Eppendorf 22620401 table top microcentrifuge
Fast-release pipette pump II Scienceware 379111010 pipette aid
FACS Calibur BD Bioscience flow cytometer
FlowJo 7.6.1 FlowJo license flow cytometery software
15 ml tube BD Falcon 352096 polypropylene conical tube
1.6 ml microfuge tube Neptune 3745.X microcentrifuge tubes

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