जीएसटी उनकी शुद्धि: पूर्ण लंबाई शुद्ध प्रोटीन उपज वाली एक दो कदम आत्मीयता शुद्धि प्रोटोकॉल

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Biology

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Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम विशिष्ट एक cleavable जीएसटी टैग और एक छोटे से उनकी टैग संयोजन से पुनः संयोजक प्रोटीन की शुद्धि की अनुमति देता है जो एक अत्यधिक कुशल और लागत प्रभावी छोटे पैमाने प्रोटीन शोधन विधि, प्रदर्शित करता है.

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Maity, R., Pauty, J., Krietsch, J., Buisson, R., Genois, M. M., Masson, J. Y. GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins. J. Vis. Exp. (80), e50320, doi:10.3791/50320 (2013).

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Abstract

इन विट्रो में प्रोटीन की जैव रासायनिक लक्षण वर्णन के लिए एंजाइमिकी में प्रमुख assays के हित का शुद्ध प्रोटीन की उच्च सांद्रता की जरूरत. प्रोटीन शुद्धि प्रोटोकॉल दक्षता, सादगी और लागत प्रभावशीलता 1 गठबंधन करना चाहिए. यहाँ, हम एक एन टर्मिनल Glutathione Sepharose टैग (जीएसटी) 2,3 और दोनों जुड़े हुए हैं जो एक सी टर्मिनल 10xHis टैग 4, के आधार पर पुनः संयोजक प्रोटीन के लिए एक नए छोटे पैमाने पर आत्मीयता शोधन प्रणाली, के रूप में जीएसटी उनकी विधि का वर्णन ब्याज की प्रोटीन के लिए. बाद के निर्माण प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए 5 Sf9 संक्रमित कोशिकाओं के संक्रमण के लिए, baculoviruses उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है. जीएसटी शोधन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए कार्य करता है, जो एक नहीं बल्कि लंबे टैग (29 केडीए) है. हालांकि, यह प्रोटीन के शारीरिक गुणों प्रभावित हो सकता है. इसलिए, यह बाद में PreScission एंजाइम 6 का उपयोग प्रोटीन बंद cleaved है. , अधिकतम शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए और cleaved जीएसटी को दूर करने के लिए हमेंअपेक्षाकृत छोटे उनकी टैग के आधार पर एक दूसरे के संबंध शुद्धीकरण कदम गयी. महत्वपूर्ण बात है, हमारी तकनीक इसलिए, अपमानित प्रोटीन को हटाने और करने के लिए एक कुशल उपकरण है जो प्रोटीन, के दोनों सिरों flanking दो अलग टैग पर आधारित है, पूर्ण लंबाई प्रोटीन समृद्ध करती है. यहाँ प्रस्तुत पद्धति ऐसी FPLC के रूप में एक महंगी वाद्य सेटअप, की आवश्यकता नहीं है. इसके अतिरिक्त, हम गर्मी झटका प्रोटीन दोष और न्यूक्लिक एसिड contaminating खत्म करने का nuclease उपचार दूर करने के लिए 2 MgCl और एटीपी washes शामिल किया. संक्षेप में, flanking दो अलग टैग का संयोजन एन और सी टर्मिनल और टैग में से एक बंद फोड़ना करने की क्षमता, ब्याज की एक उच्च शुद्ध और पूर्ण लंबाई प्रोटीन की वसूली guaranties.

Introduction

पुनः संयोजक प्रोटीन की शुद्धि जैव रसायन में मौलिक सवालों का पता करने के लिए महत्वपूर्ण है. आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी जैसे प्रोटीन शुद्धि का पारंपरिक तरीके क्रमशः ऐसा अपने isoelectric बिंदु और प्रभारी या आकार के रूप में लक्ष्य प्रोटीन के भौतिक गुणों पर निर्भर हैं. उत्तरार्द्ध प्रोटीन विशेषताओं काफी पारंपरिक प्रोटीन शुद्धि रणनीतियों में प्रोटीन contaminating की संभावना बढ़ जाती है, जो प्रोटीन की एक किस्म के द्वारा साझा कर रहे हैं. यह समस्या काफ़ी समय है, जो कई शुद्धि स्तंभों का उपयोग करते हैं, के साथ उन्हें धोखा दिया जा सकता है. इसी समय, बाद क्रोमैटोग्राफी तरीकों महंगा प्रयोगात्मक स्थापना की मांग. अधिकांश मामलों में टैग ब्याज की प्रोटीन के लिए अद्वितीय हो जाएगा के रूप में आत्मीयता टैग शुद्धि दृढ़ता, लक्ष्य विशिष्टता बढ़ जाती है. हाल ही के अध्ययन में, झंडा या हा आत्मीयता शुद्धि व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है.

मौजूदा आरईसी के विपरीतएक टैग का उपयोग किया जाता है जिसमें ombinant प्रोटीन शुद्धि प्रोटोकॉल, हम दो टैग के अद्वितीय संयोजन की स्थापना की. हमारे विधि मात्रा और वांछित प्रोटीन की शुद्धता के बीच एक इष्टतम अनुपात के लिए ब्याज की प्रोटीन की सी टर्मिनस पर एन टर्मिनस और एक उनकी टैग पर एक जीएसटी टैग की फ्यूजन, शामिल है. जीएसटी glutathione Sepharose मोती पर शुद्धि के लिए अत्यधिक कुशल है, जो एक लंबे टैग (29 केडीए), है. इसके अलावा, जीएसटी का उपयोग हमारी विधि 1 की लागत प्रभावशीलता की गारंटी देता है. (केवल दो एमिनो एसिड के अलावा मान्यता अनुक्रम LeuGluValLeuPheGln / GlyPro साथ,) PreScission एंजाइम के साथ जीएसटी बंद फोड़ना संभावना, कई फायदे हैं, उदाहरण के लिए, इस रणनीति allosteric बाधा की वजह से शारीरिक प्रोटीन कार्यों के परिवर्तन से बचा जाता है. अन्य प्रोटीन छोर से जुड़े हुए छोटे उनकी टैग cleaved जीएसटी बंद धोने, साथ ही अपमानित प्रोटीन और अन्य द्वारा प्रोटीन शुद्धता को बढ़ाने के लिए एक दूसरे शोधन चरण में कार्य करता है contaminants. उनकी शुद्धि कदम स्तंभ (टिकट राल) को जीएसटी से जाने के दौरान इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल एक डायलिसिस कदम की आवश्यकता नहीं है. ऐसे शोधन प्रक्रियाओं में आम contaminants गर्मी झटका प्रोटीन (HSP) कर रहे हैं. 2 MgCl और एटीपी के साथ एक ऊष्मायन कदम के अलावा इन प्रदूषणों से हटाने चित्रा (1) की अनुमति देता है.

फास्ट प्रोटीन लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (FPLC) और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) ब्याज का शुद्ध प्रोटीन की उच्च उपज उत्पन्न करने के लिए महंगा उपकरण पर निर्भर है कि आम तकनीकों हैं. हम यहां पेश बैच शुद्धि प्रोटोकॉल, इसके विपरीत, मार्गदर्शन है और एक महंगी वाद्य सेटअप की आवश्यकता नहीं है. प्रोटीन का एक उच्च उपज प्रोटोकॉल को स्केलिंग द्वारा पहुंचा जा सकता है. इसी समय, बैच शुद्धि प्रोटोकॉल के साथ, क्षालन मात्रा FPLC या HPLC साथ नहीं दिया जाता है, जो प्रोटीन एकाग्रता बढ़ाने के क्रम में समायोजित किया जा सकता है.

ntent "> इसके अलावा, बैच जीएसटी उनकी शुद्धि प्रोटोकॉल के साथ, ~ 10-300 केडीए के एक आकार सीमा के साथ प्रोटीन शुद्ध किया जा सकता है. सबसे बड़ा लाभ एक ही समय में कई प्रोटीन शुद्ध कर सकते हैं कि इस तथ्य से दिया जाता है उदाहरण के लिए, एक जंगली प्रकार और उसके उत्परिवर्ती प्रोटीन दोनों. प्रस्तुत प्रोटोकॉल की सफलता केवल ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर और घुलनशीलता पर निर्भर करता है.

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Protocol

1. संयोजक baculovirus का उत्पादन

Baculoviruses मुख्य रूप से केवल मामूली संशोधनों के साथ निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार Invitrogen की बीएसी करने वाली बीएसी baculovirus अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करते हुए उत्पन्न कर रहे हैं:

  1. एक संशोधित pFastBac1 वेक्टर (Gibco, जीवन) जीएसटी और उनके टैग (चित्रा 2) युक्त बनाया गया था. एक पालतू 52B (+) सदिश (Novagen) की MultiCloning साइट (एमसीएस), एक 10xHis टैग युक्त, pFastBac1-Strep-10xHis उत्पन्न करने के लिए एक pFastBac1 वेक्टर के एमसीएस में डाला गया था. पालतू 52B (+) एमसीएस अनुक्रम 5 पर एक BglII प्रतिबंध साइट 'सिरा और 3 पर एक HindIII प्रतिबंध साइट' सिरा जोड़ने, XbaI और BlpI प्रतिबंध साइटों के बीच प्रवर्धित पीसीआर था. पीसीआर उत्पाद तो BamHI और BglII प्रतिबंध दृश्यों की अनुकूलता का उपयोग कर, BamHI और pFastBac1 की HindIII प्रतिबंध साइट के बीच क्लोन किया गया था. लक्ष्य अभिव्यक्ति की अनुमति pFastBac1 उत्पन्न करने के लिए किया गया था के बाद सेstreptavidin और 10xHis टैग के साथ पुनः संयोजक प्रोटीन, पालतू 52B (+) की BamHI प्रतिबंध साइट एमसीएस अनुक्रम का प्रयोग नहीं किया गया था. इसके अलावा, XbaI प्रतिबंध साइट पहले से ही pFastBac1 की एमसीएस और पीईटी 52B के एमसीएस के साथ डाला इन (+) में साइटों के बीच होने वाली प्रतिबंध साइटों के अतिरेक से बचने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया. PreScission Protease मान्यता साइट (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) के साथ जीएसटी कोडन अनुक्रम तो pFastBac1-Strep-10xHis में डाला गया था. PGEX-6P -2 (जीई हेल्थकेयर) से जीएसटी सीडीएनए अनुक्रम पीसीआर क्रमश: 5 में NcoI और KpnI प्रतिबंध साइटों युक्त प्राइमरों और 3 'हाथ - पांव से परिलक्षित किया गया था. NcoI साइट एक शुरुआत कोडोन के अलावा, लेकिन यह भी जीएसटी को एक Alanine की अनुमति देता है. पीसीआर उत्पाद तो streptavidin-टैग का विलोपन, जिसके परिणामस्वरूप NcoI और KpnI प्रतिबंध साइटों के बीच pFastBac1-Strep-10xHis में क्लोन किया गया था. इस प्रकार प्राप्त की नई फ्यूजन वेक्टर pFastBac1-जीएसटी 10xHis नामित किया गया था.
  2. जनसंपर्क के लिए सीडीएनए कोडिंग क्लोनजीएसटी (एन टर्मिनल) और उनके टैग (सी टर्मिनल) के बीच pFastBac-जीएसटी 10xHis वेक्टर में ब्याज की otein. सी टर्मिनल उनकी टैग के साथ फ्यूजन अनुमति देने के लिए सीडीएनए बंद codon हटाने में सावधान रहें.
  3. ई. रूपांतरण (1.2 चरण में प्राप्त) पुनः संयोजक pFastBac साथ कोलाई DH10Bac bacmid उत्पन्न करने के लिए. कालोनियों Bluo लड़की और IPTG (10 माइक्रोग्राम / एमएल tetracyclin, 50 माइक्रोग्राम / एमएल kanamycin, 7 माइक्रोग्राम / एमएल gentamycin, 100 माइक्रोग्राम / एमएल Bluo युक्त चयन प्लेटों पर 30 डिग्री सेल्सियस पर 37 डिग्री सेल्सियस और कई घंटे पर रातोंरात विकसित करने की अनुमति लड़की, 40 माइक्रोग्राम / एमएल IPTG).
  4. उठाओ और सफेद फेनोटाइप पुष्टि करने के लिए चयन प्लेटों पर (कदम 1.3 से) 2 सफेद कालोनियों restreak.
  5. 10 माइक्रोग्राम / एमएल tetracyclin, 50 माइक्रोग्राम / एमएल kanamycin, 10 माइक्रोग्राम / एमएल gentamycin 1.4 कदम से दो सफेद कालोनियों के साथ है और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन के तहत रात भर (250 आरपीएम) बढ़ने युक्त लेग के 2 मिलीलीटर टीका लगाना
  6. Bacmid डीएनए को शुद्ध करने के लिए,, 1.5 कदम से बैक्टीरिया गोलीसमाधान के 300 μl मैं में कोशिकाओं resuspend और समाधान द्वितीय के 300 μl (Qiagen से Maxiprep किट) जोड़ें. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते 3 एम KOAc 5.5 पीएच के 300 μl जोड़ने और बर्फ पर 10 मिनट के लिए सेते हैं. 4 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए अधिकतम गति पर नमूने अपकेंद्रित्र. Supernatants को isopropanol के 800 μl जोड़ें और बर्फ पर 10 मिनट के लिए सेते हैं. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए नमूने अपकेंद्रित्र और 70% इथेनॉल के 500 μl के साथ गोली धोने. गोली सूखा और Tris-EDTA पीएच 8.0 के 40 μl में बाँझ शर्तों के तहत यह resuspend. bacmid डीएनए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए
  7. निर्माता प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में baculoviruses उत्पन्न करें. Baculoviruses प्रकाश से रक्षा 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.

2. पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति

  1. शुद्धि के लिए सबसे कारगर baculovirus चुनने के लिए और प्रोटीन अभिव्यक्ति की चोटी पर पहुंच गया है, क्या यह समय की निगरानी करने के लिए, एक मिनी संक्रमण परख एक प्रदर्शनएस प्रकार है: 2 Sf9 की 10 x 7 baculovirus के 133 μl (1/150) के साथ (10% FBS और 1% पी / एस के साथ पूरक) अनुग्रह मीडिया में 27 डिग्री सेल्सियस पर संवर्धित कोशिकाओं संक्रमित संक्रमित. 0, 24, 48 में 1.5 मिलीलीटर की aliquots लीजिए, और 72 घंटे के बाद संक्रमण. गोली कोशिकाओं और विरोधी टैग एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी सोख्ता द्वारा ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर का विश्लेषण.
  2. वायरस और मीडिया के बीच 1/150 के अनुपात के साथ मीडिया की 500 मिलीलीटर में प्रति मिलीलीटर 1.0 x 10 6 Sf9 कोशिकाओं से युक्त एक स्पिनर को संक्रमित करने के लिए 2.1 कदम से सबसे कुशल baculovirus का प्रयोग करें. संक्रमित कोशिकाओं को 27 डिग्री सेल्सियस पर निलंबन में आगे बढ़ने और अधिकतम प्रोटीन अभिव्यक्ति (ऊपर 2.1 चरण में निर्धारित) तक पहुँच जाता है जब कोशिकाओं फसल करते हैं. Pelleted कोशिकाओं आगे उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.

3. घुलनशील सेल lysate की तैयारी

निम्नलिखित ऊष्मायन चरणों के सभी हल्के रोटेशन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर बाहर किया जाता है.

  1. Lyse एसजीएसटी बाध्यकारी बफर (150 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 0.05% ट्राइटन-X-100, 1 मिमी 250 मिमी की NaCl के अंतिम एकाग्रता के लिए PBS1X में डीटीटी, और protease अवरोध की ~ 20 मिलीलीटर में अपने हित के प्रोटीन व्यक्त F9 कोशिकाओं कॉकटेल (रॉश). एक बर्फ नहाने के पानी में एक Dounce homogenizer, sonicate 3x 30 सेकंड प्रत्येक (70% उत्पादन), के साथ समाधान 20x Dounce और फिर 20x Dounce.
  2. (वैकल्पिक). डीएनए या शाही सेना संदूषण दूर करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 1 मिमी 2 MgCl के साथ और 7 nuclease (2.5 यू / एमएल) Benzonase कुल सेल lysate सेते हैं.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 18,000 rpm पर अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला रखें.
  4. (वैकल्पिक). अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला फिर से 4 डिग्री सेल्सियस पर 18,000 rpm पर 30 मिनट के लिए एक स्पष्ट घुलनशील lysate पाने के लिए. Clogging से बचने के लिए एक 0.2 या 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला गुजरती हैं.

4. जीएसटी मोती पर प्रोटीन की बाइंडिंग

  1. जीएसटी मोतियों के 1 मिलीलीटर के साथ घुलनशील सेल lysate सेते हैं (साथ दो बार prewashedजीएसटी के 10 एमएल कोमल रोटेशन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए बफर) बंधन.

टिप्पणी: ऊष्मायन समय प्रोटीन की स्थिरता और बाध्यकारी दक्षता के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए.

  1. त्वरित 700 rpm पर स्पिन और अनबाउंड प्रोटीन युक्त सतह पर तैरनेवाला हटाने (यह आगे के विश्लेषण के लिए रखा जा सकता है). जीएसटी धोने बफर के साथ जीएसटी बाध्य प्रोटीन (चित्रा 3 बी, लेन 1) धोने (जीएसटी 350 मिमी NaCl अंतिम साथ बाध्यकारी बफर).
  2. दोहराएँ कदम 4.2 2x. पिछले धोने पर, जितना संभव सतह पर तैरनेवाला हटायें.
  3. गर्मी झटका प्रोटीन 8 की अविशिष्ट बंधन से बचने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए (10 मिलीलीटर जीएसटी बाध्यकारी बफर में) 5 मिमी एटीपी और 15 मिमी 2 MgCl के साथ मोती सेते हैं. जीएसटी धोने बफर के साथ मोती तीन बार धोएं.

5. जीएसटी की PreScission विखंडन

  1. जीएसटी मोती अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला हटाने और पी -5 buf साथ जीएसटी मोती धोनेfer (50 मिमी NaHPO 4 7.0 पीएच, 500 मिमी NaCl, 10% ग्लिसरॉल, 0.05% ट्राइटन-X-100, 5 मिमी imidazole).
  2. 3 घंटा करने के लिए रात में 4 डिग्री सेल्सियस से पी -5 बफर में PreScission एंजाइम के साथ जीएसटी मोती सेते (100 μl के भागों में जीएसटी मोती फूट डालो और पी -5 बफर के 100 μl में पतला एंजाइम की 4-8 इकाइयों (2-4 μl) जोड़).

टिप्पणी: PreScission कदम की ऊष्मायन समय आणविक वजन के साथ ही प्रोटीन की स्थिरता के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए. गिरावट मनाया जाता है, इस ऊष्मायन समय रातोंरात एक 2 घंटे का न्यूनतम बजाय तक की कमी की जा सकती है.

  1. त्वरित स्पिन और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा. पी -5 के 100 μl जोड़ने के बाद यह कदम दो बार दोहराएँ मोतियों के लिए बफर और सभी भिन्न (चित्रा 3 बी 2 लेन) पूल.

टिप्पणी: शेष मोती दरार दक्षता के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्रा 3 बी

6. प्रोटीन बाध्यकारी कूपन धातु आत्मीयता राल

  1. 1 मिलीलीटर की 3 भागों में ऊपर से क्षालन फूट डालो और रोटेशन के तहत 1 घंटे के लिए (पी -5 बफर के साथ दो बार prewashed) 100 μl नाखून धातु आत्मीयता राल सूखी मोती के साथ प्रत्येक सेते हैं.

टिप्पणी: कई भागों में क्षालन डिवाइडिंग बंधन / washes क्षमता बढ़ जाती है.

  1. P30 बफर (30 मिमी imidazole के अंतिम एकाग्रता के साथ पी 5 बफर) के साथ राल 5 मिनट धो लें.
  2. 6.2 कदम 2x दोहराएँ और एक ट्यूब में मोती पूल. पिछले धोने से पहले, जितना संभव सतह पर तैरनेवाला हटायें.

टिप्पणी: इस कूपन बाध्य नमूना (चित्रा 3 बी, 4 लेन) से मेल खाती है.

7. शुद्ध प्रोटीन की क्षालन

  1. पी -5 के साथ रोटेशन के तहत 5 मिनट के लिए प्रोटीन के लिए बाध्य कूपन राल सेते00 बफर (500 मिमी imidazole के अंतिम एकाग्रता के साथ पी 5 बफर). बफर और 1:1 वी / वी के मोती के बीच एक अनुपात का उपयोग (आप सूखी मोतियों की 200 μl लिया था अगर उदाहरण के लिए, आप P500 के 200 μl जोड़ने के लिए होगा). इस चरण में दो बार दोहराएँ और अलग से एक eluted अंश रखने के (चित्रा 3 बी, 5-7 गलियों), क्षालन 1 (E1) नाम क्षालन 2 (E2 और क्षालन 3 (E3)).

टिप्पणी: शेष मोती क्षालन दक्षता (चित्रा 3 बी, 8 लेन) के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. आमतौर पर, प्रोटीन की 60-80% में कुल eluted है.

  1. Coomassie ब्लू (3B चित्रा) या दृश्य के लिए SYPRO प्रोटीन दाग के साथ एक एसडीएस पृष्ठ और दाग पर एक मानक बीएसए एकाग्रता के साथ प्रत्येक अंश की लगभग 20-40 μl लोड करके अपने शुद्ध प्रोटीन की मात्रा और गुणवत्ता का विश्लेषण.

टिप्पणी: ब्याज की प्रोटीन भी अपरोक्ष पता लगाया जा सकता हैविरोधी जीएसटी और विरोधी उनकी एंटीबॉडी (चित्रा -3 सी) का उपयोग शोधन प्रक्रिया ughout.

8. शुद्ध प्रोटीन का भंडारण

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक उपयुक्त भंडारण बफर के खिलाफ शुद्ध प्रोटीन (जैसे 20 मिमी Tris एसीटेट 8.0 पीएच, 200 मिमी KAC, 10% ग्लिसरॉल, 1 मिमी EDTA, 0.5 मिमी डीटीटी) dialyze यह डायलिसिस के दौरान शुद्ध प्रोटीन की वर्षा के लिए जांच जरूरी है. हम आम तौर पर आंदोलन रोटेशन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 2x dialyze.
  2. शुद्ध प्रोटीन (10-20 μl) के छोटे aliquots बनाओ और 30 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर रोक. -80 डिग्री सेल्सियस पर aliquots स्टोर और कई पिघलना / ठंड चक्र से बचें.

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Representative Results

जीएसटी उनकी शुद्धि प्रोटोकॉल की दक्षता को वर्णन करने के लिए, हम Rec14, एक एस शुद्ध किया 32.9 केडीए की pombe प्रोटीन. Rec14 सीडीएनए क्रमशः एन और सी Termini, (चित्रा 1 ए) में जीएसटी और उनकी टैग की फाईल की अनुमति हमारे संशोधित pFastBac1 वेक्टर में क्लोन किया गया था. संयोजक baculovirus तो तैयार है और प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए SF9 संक्रमित कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया. घुलनशील सेल lysates जीएसटी मोतियों के साथ incubated रहे थे और बाध्य प्रोटीन PreScission प्रोटीज साथ जीएसटी cleaving द्वारा eluted थे. परिणामस्वरूप Rec14 उनकी प्रोटीन कूपन राल और बाध्य प्रोटीन पर शुद्ध आत्मीयता 500 मिमी imidazole युक्त नाखून बफर के साथ eluted गया था. शुद्ध Rec14 उनकी भंडारण बफर में dialyzed और -80 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 1 बी) में जमा हो गया था.

Rec14 पुनः संयोजक baculovirus, या नियंत्रण के रूप में नकली संक्रमित से संक्रमित SF9 कोशिकाओं से घुलनशील और कुल सेल lysates, Coom द्वारा विश्लेषण किया गयाहमें जीएसटी Rec14 उनकी प्रोटीन की अभिव्यक्ति (चित्रा 3) की पुष्टि करने के लिए अनुमति assie नीले रंग धुंधला,. शुद्धिकरण की प्रक्रिया के दौरान, कई नमूने विधि की दक्षता का पालन करने के लिए विश्लेषण किया गया. Coomassie नीले रंग धुंधला हो जाना (3B चित्रा) से इन नमूनों के विश्लेषण से शुद्धि के पहले चरण के दौरान, जीएसटी Rec14 सही ढंग कारण Rec14 के संलयन (32.9 केडीए) के लिए ~ 60 केडीए की एक स्पष्ट आणविक वजन के साथ, जीएसटी मोतियों के लिए बाध्य किया गया था कि पता चलता है जीएसटी (29 केडीए) के साथ (1 लेन). जीएसटी की PreScission दरार के बाद, 37 केडीए (2 लेन) के आसपास जीएसटी मुक्त Rec14 उनकी migrates cleaved जीएसटी जीएसटी मोती (25 केडीए के आसपास 3 लेन,) पर देखे जा सकते हैं. अभी जीएसटी मोती (3 लेन), में उल्लेखनीय संवर्धन के लिए बाध्य बनी कि जीएसटी से मुक्त Rec14 के एक हिस्से के बावजूद Rec14 उनकी (Coomassie नीले रंग धुंधला पर दिखाई नहीं contaminant के साथ 2 लेन,) हासिल की थी. यह कदम PreScission साथ प्रोटीन की ऊष्मायन समय में वृद्धि से सुधार किया जा सकता है. कूपन को Rec14 उनकी बाध्य का विश्लेषणमोती (कदम 7.1 के बाद, 4 लेन) जीएसटी शुद्धि कदम (2 लेन) के बाद eluted प्रोटीन की तुलना में, Rec14 उनकी के एक बड़े अंश कूपन मोती के लिए बाध्य है कि पता चलता है. कई washes के बाद, Rec14 उनकी eluted और एकत्र किया गया था. तीन elutions प्रदर्शन किया गया था. विश्लेषण के एक उच्च शुद्धता का पता चला Rec14 उनकी (Coomassie धुंधला दिखाई नहीं संदूषक, 5-7 गलियों), और पहली क्षालन में Rec14 उनकी की सबसे बड़ी एकाग्रता. मोती पर बाध्य कर के रूप में केवल कुछ Rec14-उनका पता लगाया जा सकता है के बाद से कूपन मोती eluted भिन्न (गलियों 5-7) की तुलना क्षालन के बाद (8 लेन), क्षालन की दक्षता को दिखाता है.

चित्रा 3 बी में इस्तेमाल नमूने प्रक्रिया (चित्रा -3 सी) भर Rec14 का पालन करने के क्रम में विरोधी जीएसटी और विरोधी उनकी एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के अधीन थे. विरोधी जीएसटी धब्बा कुछ जीएसटी Rec14 और अकेले जीएसटी, जीएसटी शुद्धि कदम (2 लेन) से eluted प्रोटीन में मौजूद थे कि पता चलता है, और वेंcontaminants पर उनकी टैग आत्मीयता शुद्धि कदम से हटा दिया गया. यह धब्बा हमें भी जीएसटी कुशलतापूर्वक PreScission उपचार और उनकी टैग शुद्धि कदम (गलियों 4-8) से Rec14 से हटा दिया गया था कि निगरानी करने के लिए अनुमति देता है. विरोधी उनकी धब्बा Rec14 का पता लगाने के लिए करना है. हम इस प्रकार जीएसटी Rec14 उनकी और Rec14 उनकी पूरी तरह से cleaved और जीएसटी मोती (लेन 11) से हटाया नहीं गया है कि इस बात की पुष्टि कर सकते हैं. इसके अलावा, एक उच्च एकाग्रता में, Rec14 (लेन 13) कुल करने लगता है. संक्षेप में, प्रस्तुत परिणामों एस की शुद्धि के लिए जीएसटी उनका शुद्धिकरण की दक्षता का प्रदर्शन pombe Rec14.

चित्रा 1
चित्रा 1. PFastBac (Baculovir में क्लोन जीएसटी अपने दो कदम आत्मीयता शोधन विधि के योजनाबद्ध रूपरेखा. ए जीएसटी Rec14 उनकी निर्माण. जीएसटी Rec14 उनकी की हमें अभिव्यक्ति वेक्टर) बी दो कदम आत्मीयता शुद्धि Sf9 घुलनशील सेल lysate से:. जीएसटी बाध्यकारी जीएसटी की PreScission दरार, उसके बाद, नाखून बाध्यकारी और imidazole साथ क्षालन बड़ा आंकड़ा देखने के लिए क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. PFastBac1-जीएसटी 10xHis के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. जीएसटी (हरा), PreScission प्रोटीज साइट (हल्का नीला), multicloning साइट (लाल), और 10 उनके टैग (गहरे नीले) दिखाए जाते हैं. कम मामले में पीईटी-52B से होने वाले nucleotide दृश्यों हैं (+). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 3. Rec14. एक की जीएसटी उनका शुद्धिकरण की अनुकरणीय परिणाम. कुल प्रोटीन अंश नकली इलाज Sf9 कोशिकाओं से (लेन 2 और 3) और घुलनशील सेल lysate (लेन 4 और 5) के Coomassie धुंधला (लेन 2 & 4) या जीएसटी Rec14 उनकी baculovirus (3 लेन व 5) से संक्रमित. Rec14 उनकी और जीएसटी क्रमश: लगभग 32.9 केडीए और 29 केडीए के एक आणविक वजन के अधिकारी, और जीएसटी Rec14 उनकी संलयन प्रोटीन लगभग 61.9 केडीए के एक आणविक भार है. बी Coomassie के लिए (प्रोटीन शोधन विधि के हर कदम का प्रदर्शन धुंधला 8 को विरोधी जीएसटी (लेन 1) और विरोधी उनकी (लेन 9-16) एंटीबॉडी के साथ शोधन प्रक्रिया के बाद अंशों का विस्तृत विवरण देखने प्रक्रिया) सी. पश्चिमी धब्बा.upload/50320/50320fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत जीएसटी उनकी शुद्धि प्रोटोकॉल पुनः संयोजक प्रोटीन के आकार के एक विस्तृत रेंज की शुद्धि के लिए उपयुक्त है: हम सफलतापूर्वक ली RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), और एक अस्थिर उच्च आणविक भार प्रोटीन की शुद्ध किया लीशमैनिया infantum: ली बीआरसीए 2 (125kDa) 6,9. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल के साथ शुद्ध प्रोटीन 6 biochemically सक्रिय थे. इस विधि की सफलता केवल वांछित प्रोटीन की अभिव्यक्ति, घुलनशीलता और स्थिरता पर निर्भर करता है.

ऐसे ई. के रूप में अन्य मेजबान में अभिव्यक्ति के लिए आणविक जीव विज्ञान वैक्टर, कोली या खमीर, आसानी से व्यापक रूप से उपलब्ध जीएसटी और उनकी टैग का उपयोग कर संशोधित किया जा सकता है. यह सबसे आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए मौजूद तकनीक के लागू और लागत प्रभावशीलता पर प्रकाश डाला गया. लाभ का एक किस्म recombinan के लिए बैक्टीरियल या स्तनधारी कोशिकाओं से अधिक संक्रमित कोशिकाओं को चुनने के लिए हमारे निर्णय को प्रभावितटी प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धि. उदाहरण के लिए, ऐसे मेथिलिकरण, phosphorylation और ubiquitinylation रूप posttranslational संशोधनों दृढ़ता से एक प्रोटीन 10 के enzymatic समारोह को प्रभावित कर सकते हैं. इसलिए, एक प्रोटीन के शारीरिक गुणों का अध्ययन करने के लिए, यह इस तरह के Sf9 संक्रमित कोशिकाओं के रूप में posttranslational संशोधन के लिए अनुमति देता है एक प्रणाली का उपयोग करने के लिए अनुकूल है. संक्रमित कोशिका प्रणाली स्तनधारी प्रणाली की तुलना में काफी कम कोशिकाओं और कोई महंगा अभिकर्मक विधि की आवश्यकता के रूप में स्तनधारी कोशिकाओं पर Sf9 उपयोग का एक और लाभ यह है कि, उदाहरण के लिए, किफायती, प्रकृति का है.

प्रस्तुत विधि की सादगी न्यूनतम उपकरणों के साथ एक प्रयोगशाला के लिए फायदेमंद है, जो मानक प्रयोगशाला उपकरण, के साथ एक उच्च शुद्ध रूप में एक प्रोटीन या प्रोटीन जटिल प्राप्त करने में मदद मिलेगी शोधकर्ताओं.

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Acknowledgements

हम पद्धति के विकास के लिए प्रमुख विचार विमर्श के लिए ऐनी-Marie डायोन-कोटे धन्यवाद. जे और आरबी FQNRT डॉक्टरेट विद्वानों हैं, एम. -एम.जी. एक Vanier CIHR विद्वान है, और जे-YM एक FRSQ वरिष्ठ शोधकर्ता है. इस काम के प्राकृतिक विज्ञान और जे के लिए इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद से धन के द्वारा समर्थित किया गया. एम.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
E.Coli DH10Bac (competent) Invitrogen
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen
Maxi Prep Kit Qiagen 12163 Solution I and II
Ultra Pure Bluo-Gal Gibco (Life) 15519028
IPTG Gibco (Life) 15529019
Sf9 infected cells ATCC CRL-1711
PreScission enzyme GE Healthcare 27084301
Grace's infected medium supplemented Gibco (Life) 11605-094
Fetal Bovine Serum characterized Hyclone SH30396.03
P/S (Penicillin-Streptomycin) Gibco (Life) 15070-063
Glutathione Sepharose resin GE bioscience 17075605
Protease inhibitor cocktail Roche 11873580001
Talon resin Clontech 635504
Imidazole BioShop 288324
Gentamicin Gibco (Life) 15710064
Polyclonal GST-antibody Production in house
Monoclonal 6X-His-antibody Clontech 631212
EQUIPMENT
Dounce homogenizer (tight) Wheaton 357546
Sonicator (Fisher dismembrator) Fisher Model 150
Dialysis bag (50 mm) Fisher Scientific 2115217

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References

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