GST-Hans oprensning: En to-trins Affinitetsrensning protokollen Efterlevelse fuld længde oprensede proteiner

1Genome Stability Laboratory, Oncology Axis, Hôtel-Dieu de Québec
* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

I den foreliggende protokol, viser vi en yderst effektiv og omkostningseffektiv små proteinoprensning metode, som tillader oprensning af rekombinante proteiner ved entydigt at kombinere en spaltelig GST-tag og en lille His-mærke.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Maity, R., Pauty, J., Krietsch, J., Buisson, R., Genois, M. M., Masson, J. Y. GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins. J. Vis. Exp. (80), e50320, doi:10.3791/50320 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vigtige assays i enzymologi til biokemisk karakterisering af proteiner in vitro kræver høje koncentrationer af det rensede protein af interesse. Protein oprensningsprotokoller bør kombinere effektivitet, enkelhed og omkostningseffektivitet 1.. Her beskriver vi GST-Hans metode som ny mindre affinitetsoprensning for rekombinante proteiner, der er baseret på en N-terminal glutathion Sepharose Tag (GST) 2,3 og en C-terminale 10xHis tag 4, som begge er fusioneret til proteinet af interesse. Sidstnævnte konstruktion anvendes til at generere baculovira for infektion af Sf9-inficerede celler til proteinekspression 5. GST er en temmelig lang tag (29 kDa), som tjener til at sikre rensningseffektivitet. Det kan imidlertid påvirke fysiologiske egenskaber af proteinet. Derfor er det spaltes efterfølgende fra proteinet ved hjælp af PreScission enzymet 6. For at sikre maksimal renhed og fjerne det spaltede GST, vitilføjet en anden affinitetsoprensningstrin baseret på forholdsvis lille His-Tag. Vigtigere er vores teknik baseret på to forskellige mærker, der flankerer de to ender af proteinet, som er et effektivt værktøj til at fjerne nedbrudte proteiner, og derfor beriger proteiner i fuld længde. Den præsenteres her metode kræver ikke et dyrt instrumental opsætning, såsom FPLC. Desuden har vi indarbejdet MgCI2 og ATP vasker for at fjerne varmechokprotein urenheder og nucleasebehandling at afskaffe kontaminerende nukleinsyrer. Sammenfattende kombinationen af ​​to forskellige mærker, der flankerer den N-og den C-terminale og evnen til at fraspalte en af ​​de koder, garanterer tilbagebetaling af en højt oprenset og fuld-længde protein af interesse.

Introduction

Rensningen af ​​rekombinante proteiner er afgørende for at løse fundamentale spørgsmål i biokemi. Konventionelle måder til proteinoprensning såsom ionbytningskromatografi og gelpermeationskromatografi afhængige fysiske egenskaber af målproteinet såsom dens isoelektriske punkt og ladning eller størrelse, hhv. Sidstnævnte protein egenskaber deles af en række proteiner, som øger væsentligt chancen for kontaminerende proteiner i konventionelle proteinoprensningsfremgangsmåder strategier. Dette problem kan omgås ved anvendelse af flere oprensningssøjlerne, hvilket er tidskrævende. Samtidig, sidstnævnte kromatografifremgangsmåder kræver dyre forsøgsopstilling. Affinity-tag rensning kraftigt øger target-specificitet, som i de fleste tilfælde tag vil være unikke for proteinet af interesse. I de seneste undersøgelser har Flag-eller HA-affinitetsoprensning været meget anvendt.

I modsætning til eksisterende recombinant protein oprensningsprotokoller hvor enkelt tags bruges etablerede vi en unik kombination af to tags. Vores fremgangsmåde involverer fusionen af ​​et GST-tag i N-terminalen og en His-tag ved C-terminalen af ​​proteinet af interesse, til et optimalt forhold mellem mængden og renheden af ​​det ønskede protein. GST er en lang tag (29 kDa), som er meget effektiv til oprensning på glutathion Sepharose-perler. Desuden ved hjælp af GST garanterer omkostningseffektiviteten af vores metode 1. Muligheden for at fraspalte GST med PreScission enzym (med genkendelsessekvens LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, hvilket resulterer i tilføjelsen af ​​kun to aminosyrer) har mange fordele, for eksempel, denne strategi undgår ændringer i de fysiologiske proteinet fungerer på grund allosterisk hindring. Den lille His-mærke fusioneret til det andet protein ende tjener et andet oprensningstrin til at øge protein renhed ved afvaskning det spaltede GST samt nedbrydes proteiner og andre forurenende stoffer. Derudover betyder protokollen ikke kræver en dialyse skridt, når der skiftes fra GST til His-oprensningstrinnet kolonne (TALON harpiks). Fælles forurenende stoffer i sådanne rensningsprocesser er varmechokproteiner (HSP). Tilføjelsen af et inkubationstrin med MgCl2 og ATP giver fjernelsen af disse stoffer (Figur 1).

Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) og High Performance Liquid Chromatography (HPLC) er almindelige teknikker, der er afhængige af dyre instrumenter at generere højt udbytte af det rensede protein af interesse. Den batch oprensningsprotokol vi præsenterer her, derimod, er manuel og kræver ikke et dyrt instrumental setup. Et højt udbytte af protein kan nås ved at opskalere protokollen. Samtidig med batch oprensningsprotokollen, elueringsvolumenet kan justeres for at øge proteinkoncentration, der ikke er givet med FPLC eller HPLC.

ntent "> Også med batch GST-His oprensningsprotokol, proteiner med en størrelse-række ~ 10-300 kDa kan oprenses. En af de største fordele er givet ved det faktum, at man kan oprense adskillige proteiner på samme tid for eksempel både en vildtype-og mutant-protein. succes præsenterede protokol afhænger udelukkende af ekspressionsniveauet og opløseligheden af ​​proteinet af interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Produktion af rekombinant Baculovirus

Baculovira genereres ved hjælp af Bac-til-Bac baculovirusekspressionssystemet Invitrogen hovedsagelig i overensstemmelse med producentens protokol med kun små modifikationer:

  1. En modificeret pFastBac1 vektor (Gibco, livet) blev oprettet, der indeholder GST og His-tags (figur 2). Multikloningsstedet (MCS) af et pET-52b (+)-vektoren (Novagen), indeholder et 10xHis-tag, blev indsat i MCS af pFastBac1 vektor for at generere pFastBac1-Strep-10xHis. PET-52b (+) MCS-sekvens blev PCR-amplificeret mellem Xbal og BlpI restriktionssteder, tilføjer et BglII restriktionssted ved 5'-ende og et HindIII-restriktionssted ved 3'-ende. PCR-produktet blev derefter klonet mellem BamHI-og HindIII restriktionssite pFastBac1 anvendelse foreneligheden af ​​BamHI-og BglII-restriktions-sekvenser. Eftersom målet var at skabe en pFastBac1 tillader ekspression afrekombinant protein med streptavidin-og 10xHis-tags, restriktionsstedet af pET-52b (+) BamHI MCS-sekvensen blev ikke anvendt. Desuden blev XbaI restriktionssted ikke bruges til at undgå afskedigelse af restriktionssteder forekommer mellem de steder, som allerede i MCS af pFastBac1 og disse indsat med MCS af PET-52b (+). GST kodende sekvens med PreScission Protease genkendelsessted (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) blev derefter indsat i pFastBac1-Strep-10xHis. GST-cDNA-sekvensen fra pGEX-6P-2 (GE Healthcare) blev PCR-amplificeret med primere indeholdende NcoI og KpnI-restriktionssteder ved 5'-og 3'-ekstremiteter, hhv. Ncol-stedet tillader tilsætning af et startcodon, men også en alanin til GST. PCR-produktet blev derefter klonet ind pFastBac1-Strep-10xHis mellem NcoI-og KpnI-restriktionssteder, hvilket resulterer i deletion af Streptavidin-tag. Således opnåede den nye fusion vektor blev opkaldt pFastBac1-GST-10xHis.
  2. Clone cDNA, der koder for PRotein af interesse i pFastBac-GST-10xHis vektor mellem GST (N-terminal) og His-mærket (C-terminal). Være omhyggelig med at fjerne cDNA stopkodon for at tillade fusion med den C-terminale His-tag.
  3. Transformere E. coli DH10Bac med den rekombinante pFastBac (opnået i trin 1.2) til at generere bacmidet. Tillad kolonier at vokse natten over ved 37 ° C og flere timer ved 30 ° C på selektionsplader indeholdende Bluo-gal og IPTG (10 ug / ml tetracyclin, 50 ug / ml kanamycin, 7 pg / ml gentamycin, 100 ug / ml Bluo- Gal, 40 ug / ml IPTG).
  4. Pluk og restreak 2 hvide kolonier (fra trin 1.3) på selektionsplader at bekræfte hvide fænotype.
  5. Inokulere 2 ml LB indeholdende 10 ug / ml tetracyclin, 50 ug / ml kanamycin, 10 pg / ml gentamycin med de to hvide kolonier fra trin 1.4 og lade dem vokse natten over under omrøring (250 rpm) ved 37 ° C.
  6. For at oprense Bacmid DNA pelletere bakterierne fra trin 1.5,opblande cellerne i 300 pi opløsning I og tilsæt 300 pi opløsning II (Maxiprep kit fra Qiagen). Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur, tilsættes 300 pi 3 M KOAc pH 5,5 og inkuberes i 10 minutter på is. Centrifuger prøverne ved 4 ° C, maks. hastighed i 10 min. Tilføj 800 pi isopropanol til supernatanterne og inkuberes i 10 minutter på is. Centrifuger prøverne for 15 min ved 4 ° C og vask bundfaldet med 500 pi 70% ethanol. Lad pellet tørre og resuspender det under sterile betingelser i 40 pi Tris-EDTA, pH 8,0. Bacmid DNA bør opbevares ved 4 ° C.
  7. Generere baculovira som beskrevet i producentens protokol. Baculovira kan opbevares ved 4 ° C, beskyttet mod lys.

2. Rekombinant Protein Expression

  1. For at vælge det mest effektive baculovirus til rensning og til at overvåge, hvad tid toppen af ​​protein-ekspression er nået, udføre en mini-infektion assay ets følger: Infect 2 x 10 7 af Sf9-inficerede celler dyrket ved 27 ° C i Graces medium (suppleret med 10% FBS og 1% P / S) med 133 pi (1/150) af baculovirus. Saml alikvoter af 1,5 ml på 0, 24, 48 og 72 timer efter infektion. Pelletere cellerne og analysere ekspressionsniveauet af proteinet af interesse ved western blotting under anvendelse af anti-tag-antistoffer.
  2. Brug den mest effektive baculovirus fra trin 2.1 til at inficere en spinner indeholdende 1,0 x 10 6 Sf9-celler per ml i 500 ml medier med et forhold på 1/150 mellem virus og medier. Lad de inficerede celler vokser i suspension ved 27 ° C og høste cellerne når den maksimale protein-ekspression (som bestemt i trin 2.1) er nået. Pelleterede celler kan opbevares ved -80 ° C indtil yderligere brug.

3. Fremstilling af opløselige cellelysat

Alle de følgende inkubationstrin udføres ved 4 ° C under mild rotation.

  1. Lyse SF9-celler, der udtrykker et protein af interesse i ~ 20 ml GST bindingsbuffer (150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 0,05% Triton-X-100, 1 mM DTT i PBS1X til en slutkoncentration af NaCl på 250 mM og proteaseinhibitor cocktail (Roche). I et isvandbad, dounce opløsningen 20x med en Dounce homogenisator soniker 3x hver 30 sekunder (70% output) og Dounce igen 20x.
  2. (Ekstraudstyr). Inkubér samlede cellelysat med 1 mM MgCl2 og benzonase 7 nuklease (2,5 U / ml) i 30 minutter ved 4 ° C for at fjerne DNA-eller RNA forurening.
  3. Centrifuger ved 18.000 rpm i 30 min ved 4 ° C. Opbevar supernatanten.
  4. (Ekstraudstyr). Centrifugeres supernatanten igen i 30 minutter ved 18.000 rpm ved 4 ° C for at få et klart opløselige lysat. Pass supernatanten gennem et 0,2 eller 0,45 um filter for at undgå tilstopning.

4.. Binding af protein på GST Beads

  1. Inkubér opløselige cellelysat med 1 ml af GST-perler (forvasket to gange med10 ml GST bindingsbuffer) i 1 time ved 4 ° C under forsigtig rotation.

Kommentar: Inkubationstiden skal optimeres i henhold til stabiliteten af proteinet og bindende effektivitet.

  1. Hurtig centrifugering ved 700 rpm, og fjern supernatant indeholdende ubundne proteiner (dette kan holdes til yderligere analyse). Vask GST-bundne proteiner (figur 3B, bane 1) med GST vaskebuffer (GST bindende buffer med 350 mM NaCI endelig).
  2. Gentag trin 4.2 2x. Ved den sidste vask fjerne så meget supernatant som muligt.
  3. Inkuberes perlerne med 5 mM ATP og 15 mM MgCl2 (i 10 ml GST bindingspuffer) i 1 time ved 4 ° C for at undgå ikke-specifik binding af varmechokproteiner 8. Vask perlerne tre gange med GST vaskepuffer.

5.. PreScission Spaltning af GST

  1. Centrifuger GST perler, supernatanten fjernes, og vaske GST perler med P5 buffer (50 mM NaHPO 4 pH 7,0, 500 mM NaCl, 10% glycerol, 0,05% Triton-X-100, 5 mM imidazol).
  2. Inkubér GST-perler med PreScission enzym i P5 buffer fra 3 timer til natten over ved 4 ° C. (Opdel GST perler på brøkdele af 100 ul og tilsæt 4-8 enheder (2-4 ul) enzym fortyndet i 100 ul P5 buffer).

Kommentar: Inkubationstiden for PreScission trin skal optimeres i henhold til molekylvægten samt proteinets stabilitet. Hvis der observeres nedbrydning, kan det inkubationstiden faldt til et minimum på 2 timer i stedet for natten over.

  1. Quick spin og indsamle supernatanten. Gentag dette trin to gange efter tilsætning 100 ul P5 buffer til perlerne og samle alle fraktioner (figur 3B, bane 2).

Kommentar: De resterende perler kan anvendes til analyse af spaltningseffektivitet (figur 3B

6.. Protein-binding til TALON Metal Affinity Resin

  1. Opdel eluering fra oven i 3 fraktioner på 1 ml og inkuberes med hver 100 gl Talon metalaffinitetssøjle harpiks tørre perler (forvasket to gange med P5-puffer) i 1 time under rotation.

Kommentar: Opdeling af eluering i flere fraktioner stiger bindende / vasker effektivitet.

  1. Vask harpiksen 5 min med P30-puffer (P5-puffer med en endelig koncentration på 30 mM imidazol).
  2. Gentag trin 6.2 2x og samle perlerne i et enkelt rør. Før den sidste vask fjerne så meget supernatant som muligt.

Kommentar: Dette svarer til TALON bundet prøve (figur 3B, bane 4).

7.. Eluering af det oprensede protein

  1. Inkubér proteinbundet TALON harpiks til 5 minutter under rotation med P500 buffer (P5 buffer med en slutkoncentration på 500 mM imidazol). Brug et forhold mellem buffer og perler på 1:1 v / v. (For eksempel, hvis du havde taget 200 pi tørre perler, bliver du nødt til at tilføje 200 pi P500). Gentag dette trin to gange og holde hver elueret fraktion separat (opkaldt eluering 1 (E1), eluering 2 (E2) og eluering 3 (E3), 3B, bane 5-7).

Kommentar: De resterende perler kan anvendes til analyse af eluering effektivitet (figur 3B, bane 8). Typisk er 60-80% af proteinet elueret i alt.

  1. Analyser mængden og kvaliteten af din renset protein ved at indlæse ca 20-40 ul af hver fraktion med en standard BSA koncentration på en SDS-PAGE og pletten med Coomassie blå (figur 3B) eller SYPRO protein pletten til visualisering.

Kommentar: Den interessante protein kan også påvises Throughout oprensningsproceduren under anvendelse af anti-GST-og anti-His-antistoffer (figur 3C).

8.. Lagring af det oprensede protein

  1. Dialysere det rensede protein mod en egnet opbevaringspuffer (fx 20 mM Tris-acetat, pH 8,0, 200 mM KAc, 10% glycerol, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT) ved 4 ° C. Det er vigtigt at kontrollere præcipitation af det oprensede protein under dialysen. Vi normalt dialyse 2x i 1 time ved 4 ° C under omrøring rotation.
  2. Lav små portioner af det oprensede protein (10-20 ul) og fryse på tøris i 30 minutter. Opbevar de afmålte mængder ved -80 ° C og undgå mange tø / fryse cykler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at illustrere effektiviteten af GST-His oprensningsprotokol vi oprenset Rec14 en S. pombe protein på 32,9 kDa. Den Rec14 cDNA blev klonet i vores modificeret pFastBac1 vektor tillader tilføjelserne af GST-og His-tags ved N-og C-terminale ende (figur 1A). Rekombinante baculovirus blev derefter fremstillet og anvendt til at inficere SF9-inficerede celler til proteinekspression. De opløselige cellelysater blev inkuberet med GST-perler og bundet-proteiner blev elueret ved spaltning GST med PreScission protease. Den resulterende Rec14-His protein var affinitetsoprenset på TALON harpiks og bundne-proteiner blev elueret med TALON puffer indeholdende 500 mM imidazol. Oprenset Rec14-His blev dialyseret i opbevaringsbuffer og opbevaret ved -80 ° C (figur 1B).

De opløselige og totale cellelysater fra SF9 celler inficeret med Rec14 rekombinant baculovirus, eller mock-inficeret kontrol blev analyseret ved CoomAssie blåfarvning, giver os mulighed for at bekræfte ekspression af GST-Rec14-His protein (figur 3A). Under oprensningsprocessen blev mange prøver analyseret for at følge effektiviteten af ​​fremgangsmåden. Analyse af disse prøver ved Coomassie blue-farvning (figur 3B) viser, at i det første trin af oprensning blev GST-Rec14 korrekt bundet til GST beads, med en tilsyneladende molekylvægt på ~ 60 kDa på grund af sammensmeltning af Rec14 (32,9 kDa) med GST (29 kDa) (bane 1). Efter PreScission spaltning af GST, GST-fri Rec14-His migrerer ved 37 kDa (bane 2), mens det kløvede GST kan visualiseres på GST-perler (bane 3, omkring 25 kDa). På trods af en del af GST-fri Rec14 der stadig var bundet til GST beads (bane 3), bemærkelsesværdig berigelse Rec14-His blev opnået (bane 2, med ingen kontaminant synlig på Coomassie blåfarvning). Dette trin kan forbedres ved at øge inkubationstid af proteinet med PreScission. Analyse af Rec14-His bundet til TALONperler (efter trin 7.1, bane 4) i forhold til proteinerne eluerede efter GST oprensningsprocessen (bane 2) viser, at en stor del af Rec14-His er bundet til talon perler. Efter adskillige vaske blev Rec14-His elueres og opsamles. Tre elueringer var foretaget. Analysen viste en høj renhed af Rec14-His (ingen forurenende synligt ved Coomassie-farvning, bane 5 til 7) og den største koncentration af Rec14-His i første eluering. Sammenligning af eluerede fraktioner (bane 5 til 7) for at Hælen perlerne efter eluering (bane 8) illustrerer effektiviteten af ​​elueringen, da kun få Rec14-His kan påvises som er bundet på perler.

Prøver, der anvendes i figur 3B blev underkastet Western blot-analyse med anti-GST-og anti-His-antistoffer for at følge Rec14 hele proceduren (figur 3C). Den anti-GST-blot viser, at nogle GST-Rec14 og GST alene var til stede i de eluerede proteiner fra GST oprensningsprocessen (bane 2), og thved forureninger blev fjernet ved His-mærket affinitetsoprensningstrin. Dette blot giver os mulighed for også at overvåge, at GST var blevet effektivt fjernet fra Rec14 af PreScission behandling og His-mærket oprensningstrin (bane 4 til 8). Den anti-His blot har til formål at påvise Rec14. Vi kan således bekræfte, at GST-Rec14-His og Rec14-His blev ikke fuldstændigt spaltet og fjernet fra GST-perler (bane 11). Endvidere, i en høj koncentration, Rec14 synes at aggregere (bane 13). Sammenfattende resultaterne præsenteret demonstrere effektiviteten af GST-His oprensning til oprensning af S. pombe Rec14.

Figur 1
Figur 1. Skematisk oversigt af GST-His totrins affinitetsoprensning metode. A. GST-Rec14-His konstruktionen klonet i pFastBac (Baculovir. os ekspressionsvektor) B. To trin affinitetsrensning af GST-Rec14-His fra Sf9 opløselig cellelysat:. GST-bindende, efterfulgt af PreScission spaltning af GST, TALON-bindende og eluering med imidazol Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2. Skematisk fremstilling af pFastBac1-GST-10xHis. GST (grøn), PreScission protease stedet (lyseblå) er multikloningsstedet (rød), og den 10-His-tag (mørk blå) vist. I nederste tilfælde er nukleotidsekvenserne oprindelse fra pET-52b (+). Klik her for at se større figur .

together.within-side = "altid"> Figur 3
Figur 3. Eksempler resultat af GST-His oprensning af Rec14. A. Coomassie-farvning af totalt protein fraktion (bane 2 og 3) og opløselig cellelysat (bane 4 og 5) fra mock-behandlede Sf9-celler (bane 2 og 4) eller inficeret med GST-Rec14-His-baculovirus (bane 3 og 5). Rec14-His og GST har en molekylvægt på ca 32,9 kDa og 29 kDa, og GST-Rec14-His fusion protein har en molekylvægt på ca 61,9 kDa. B. Coomassie farvning viser hvert trin i proteinoprensning metode ( detaljeret forklaring se analyseprocedure) C. Western blot af fraktionerne efter rensning procedure med anti-GST (bane 1 til 8) og anti-His-(bane 9 til 16) antistoffer.upload/50320/50320fig3large.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

GST-Hans oprensningsprotokol præsenteres her, er egnet til rensning af en bred vifte af størrelser af rekombinante proteiner: Vi har med held renset Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa) PALB2 (130kDa), og en ustabil høj molekylvægt protein Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Desuden proteiner oprenset med denne protokol var biokemisk aktive 6. Succesen for denne metode afhænger udelukkende af udtrykket, opløselighed og stabilitet det ønskede protein.

Molekylærbiologiske vektorer til ekspression i andre værter, såsom E. coli eller gær, kan let ændres ved hjælp af den bredt tilgængelige GST og hans tags. Dette fremhæver anvendeligheden og omkostningseffektiviteten af ​​den nuværende teknik for de fleste molekylærbiologiske laboratorier. En række fordele påvirket vores beslutning om at vælge inficerede celler i løbet af bakterie-eller pattedyrceller til recombinant protein ekspression og oprensning. For eksempel kan posttranslationelle modifikationer, såsom methylering, phosphorylering og ubiquitinylation kraftigt påvirke den enzymatiske funktion af et protein 10. Derfor, for at studere de fysiologiske egenskaber af et protein, det er fordelagtigt at anvende et system, der giver mulighed for posttranslationel modifikation, såsom Sf9-inficerede celler. En anden fordel ved anvendelse af Sf9 i pattedyrceller, for eksempel, er af økonomisk art, som den inficerede celle system kræver væsentligt færre celler og ingen dyre transfektion sammenlignet med pattedyr system.

Enkeltheden af ​​denne procedure vil hjælpe forskerne til at opnå et protein eller protein-kompleks i en højt oprenset form, med standard laboratorieudstyr, hvilket er fordelagtigt for et laboratorium med minimalt udstyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Vi takker Anne-Marie Dion-Cote for diskussioner, der fører til udviklingen af ​​metoden. JK og RB er FQNRT ph.d. lærde, M.-MG er en Vanier CIHR lærd og J.-YM er et FRSQ seniorforsker. Dette arbejde blev støttet af midler fra naturvidenskab og teknik Forskningsråd til JY. M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
E.Coli DH10Bac (competent) Invitrogen
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen
Maxi Prep Kit Qiagen 12163 Solution I and II
Ultra Pure Bluo-Gal Gibco (Life) 15519028
IPTG Gibco (Life) 15529019
Sf9 infected cells ATCC CRL-1711
PreScission enzyme GE Healthcare 27084301
Grace's infected medium supplemented Gibco (Life) 11605-094
Fetal Bovine Serum characterized Hyclone SH30396.03
P/S (Penicillin-Streptomycin) Gibco (Life) 15070-063
Glutathione Sepharose resin GE bioscience 17075605
Protease inhibitor cocktail Roche 11873580001
Talon resin Clontech 635504
Imidazole BioShop 288324
Gentamicin Gibco (Life) 15710064
Polyclonal GST-antibody Production in house
Monoclonal 6X-His-antibody Clontech 631212
EQUIPMENT
Dounce homogenizer (tight) Wheaton 357546
Sonicator (Fisher dismembrator) Fisher Model 150
Dialysis bag (50 mm) Fisher Scientific 2115217

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
  2. Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL. Trends Genet. 12, 209-210 (1996).
  3. Carr, S., et al. Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems. Vaccine. 18, 153-159 (1999).
  4. Armisen, P., et al. Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports. J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).
  5. Kuhn, S., Zipfel, P. F. The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins. Gene. 162, 225-229 (1995).
  6. Buisson, R., et al. Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).
  7. Filimonova, M. N., et al. Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism. Biochemistry. 62, 983-988 (1997).
  8. Thorslund, T., et al. The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).
  9. Genois, M. M., et al. Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum. Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).
  10. Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression. Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics