GST-Hans rening: En två-stegs Affinity Purification protokoll Flytfullängds renade proteiner

1Genome Stability Laboratory, Oncology Axis, Hôtel-Dieu de Québec
* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

I det nuvarande protokollet, visar vi en mycket effektiv och kostnadseffektiv småskalig proteinreningsmetod, som möjliggör rening av rekombinanta proteiner genom en unik kombination en klyvningsbar GST-tagg och en liten His-tag.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Maity, R., Pauty, J., Krietsch, J., Buisson, R., Genois, M. M., Masson, J. Y. GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins. J. Vis. Exp. (80), e50320, doi:10.3791/50320 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Viktiga analyser in Enzymology för biokemisk karakterisering av proteiner in vitro kräver höga koncentrationer av det renade proteinet av intresse. Proteinreningsprotokoll bör kombinera effektivitet, enkelhet och kostnadseffektivitet 1. Här beskriver vi GST-His-metoden som en ny småskalig affinitets reningssystem för rekombinanta proteiner, som bygger på en N-terminal glutation Sepharose-Tag (GST) 2,3 och en C-terminal 10xHis etiketten 4, som båda är sammansmält till proteinet av intresse. Den senare konstruktionen används för att generera baculovirus, för infektion av Sf9-infekterade celler för proteinexpression 5. GST är ett ganska långt tag (29 kDa) som tjänar till att säkerställa effektivitet rening. Däremot kan det påverka fysiologiska egenskaperna hos proteinet. Följaktligen är det därefter avspjälkas proteinet med användning av PreScission enzymet 6. För att säkerställa maximal renhet och för att avlägsna den kluvna GST, visattes ett andra affinitetsreningssteg baserat på den jämförelsevis lilla His-Tag. Viktigt är vår teknik baserad på två olika taggar som flankerar de två ändarna av det protein, vilket är ett effektivt verktyg för att ta bort nedbrutna proteiner och därmed berikar fullängdsproteiner. Den metod som presenteras här inte kräver en dyr instrumentella inställning, t.ex. FPLC. Dessutom införlivade vi MgCl2 och ATP-tvättar för att avlägsna värmechockprotein föroreningar och nukleasbehandling att avskaffa förorenande nukleinsyror. I sammanfattning, en kombination av två olika taggar flankerande N-och den C-terminala och förmåga att klyva bort en av taggarna, garantier återvinning av en högrenad och fullängds-proteinet av intresse.

Introduction

Reningen av rekombinanta proteiner är avgörande för att ta itu med grundläggande frågor i biokemi. Konventionella metoder för proteinrening såsom jonbyteskromatografi och gelkromatografi förlita sig på fysikaliska egenskaper hos målproteinet såsom dess isoelektriska punkt och laddning eller storlek, respektive. De senare proteinsärdrag delas av en mängd proteiner, vilket avsevärt ökar risken för kontaminerande proteiner i konventionella strategier för proteinrening. Detta problem kan kringgås med användning av flera reningskolonner, vilket är tidskrävande. Samtidigt, de senare kromatografiska metoder kräver dyra experimentuppställning. Affinity-tag rening ökar starkt mål-specificitet, som i de flesta fall taggen kommer att vara unik för proteinet av intresse. I senare studier har Flag-eller HA-affinitetsrening i stor utsträckning.

I motsats till existerande recombinant proteinreningsprotokoll där enstaka taggar används, har vi etablerat en unik kombination av två taggar. Vår metod innebär fusion av en GST-markör vid N-terminalen och en His-tag vid C-änden av proteinet av intresse, för ett optimalt förhållande mellan kvantitet och renhet av det önskade proteinet. GST är en lång tagg (29 kDa), som är mycket effektiv för rening på glutation-Sepharose-pärlor. Dessutom, med hjälp av GST garanterar kostnadseffektivitet för vår metod 1. Möjligheten att klyva bort GST med PreScission enzym (med igenkänningssekvensen LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, vilket resulterar i tillsatsen av endast två aminosyror) har många fördelar, till exempel, undviker denna strategi förändringar av de fysiologiska proteinet fungerar på grund av allosterisk hinder. Den lilla His-tag fuserat till det andra proteinet extremitet tjänar i ett andra reningssteg för att öka proteinrenhet genom att tvätta bort det kluvna GST, samt nedbryts proteiner och andra föroreningar. Dessutom ger protokollet inte kräver dialyssteg vid byte från GST till His-reningssteget kolonn (TALON harts). Vanliga föroreningar i sådana reningsprocesser är värmechockproteiner (HSP). Tillsatsen av ett inkubationssteg med MgCl2 och ATP tillåter avlägsnandet av dessa kontaminanter (figur 1).

Snabb Protein Liquid Chromatography (FPLC) och högupplösande vätskekromatografi (HPLC) är vanliga tekniker som är beroende av dyra instrument för att generera högt utbyte av det renade proteinet av intresse. Satsreningsprotokoll som vi presenterar här, däremot, är manuell och inte kräver en dyr instrument-setup. Ett högt utbyte av protein kan uppnås genom ökning av protokollet. Samtidigt, med satsreningsprotokollet, elueringsvolymen kan justeras för att öka proteinkoncentrationen, som inte ges med FPLC eller HPLC.

ntent "> Även med den sats GST-His reningsprotokoll, proteiner med ett storleksintervall av ca 10 till 300 kDa kan renas. En av de största fördelarna fås genom det faktum att en kan rena flera proteiner samtidigt , till exempel, både en vild typ och dess mutant protein. Framgången för den presenterade protokollet beror enbart på expressionsnivån och löslighet av proteinet av intresse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Produktion av rekombinant baculovirus

Baculoviruses genereras med hjälp av Bac-to-Bac baculovirusexpressionssystem av Invitrogen huvudsakligen i enlighet med tillverkarens protokoll med endast smärre ändringar:

  1. En modifierad pFastBac1 vektor (Gibco, liv) skapades innehållande GST-och His-taggar (Figur 2). Multikloningsstället (MCS) i en pET-52b (+)-vektorn (Novagen) innehållande en 10xHis tagg, sattes in i MCS i en pFastBac1 vektor för att generera pFastBac1-Strep-10xHis. PET-52b (+) MCS-sekvensen var PCR amplifieras mellan Xbal och BlpI restriktionsställen, lägga till en Bglll restriktionsställe vid 5'-änden och ett Hindlll restriktionsställe vid 3'-änden. PCR-produkten klonades därefter mellan BamHI och Hindlll-restriktionsstället i pFastBac1, användning av kompatibiliteten i BamHI-och Bglll-restriktionssekvenser. Eftersom syftet var att generera ett pFastBac1 tillåter uttrycket avrekombinant protein med streptavidin-och 10xHis-taggar, restriktionsstället i pET-52b (+) BamHI MCS sekvensen användes inte. Dessutom var Xbal restriktionsstället inte för att undvika redundans av restriktionsställen som förekommer mellan de platser som redan i MCS i pFastBac1 och dessa sitter med MCS i pET-52b (+). GST kodande sekvensen med PreScission proteasigenkänningsställe (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) det sattes sedan in i pFastBac1-Strep-10xHis. GST-cDNA-sekvens från pGEX-6P-2 (GE Healthcare) PCR-amplifierades med primrar innehållande Ncol-och Kpnl-restriktionsställen vid 5'-och 3'-ändar, respektive. Ncol-stället möjliggör tillsats av ett startkoden, utan också en alanin till GST. PCR-produkten klonades sedan in pFastBac1-Strep-10xHis mellan Ncol-och Kpnl-restriktionsställen, vilket resulterar i deletion av Streptavidin-taggen. Så erhållna nya fusionsvektor hette pFastBac1-GST-10xHis.
  2. Klona cDNA som kodar för protein av intresse in i pFastBac-GST-10xHis vektorn mellan GST (N-terminala) och His-tag (C-terminal). Var försiktig för att avlägsna cDNA-stoppkodon för att tillåta fusion med den C-terminala His-tag.
  3. Transformera E. coli DH10Bac med den rekombinanta pFastBac (erhållen i steg 1,2) för att generera bacmid. Låt kolonierna växa över natten vid 37 ° C och flera timmar vid 30 ° C på selektionsplattor innehållande Bluo-gal och IPTG (10 ^ g / ml tetracyklin, 50 | ig / ml kanamycin, 7 pg / ml gentamycin, 100 | ig / ml Bluo- Gal, 40 | ig / ml IPTG).
  4. Plocka och restreak 2 vita kolonier (från steg 1,3) på selektionsplattorna för att bekräfta den vita fenotypen.
  5. Inokulera 2 ml LB innehållande 10 | ig / ml tetracyklin, 50 | ig / ml kanamycin, 10 | ig / ml gentamycin med två vita kolonier från steg 1,4 och låta dem växa över natten under omröring (250 rpm) vid 37 ° C.
  6. För att rena den bacmid DNA pelletera bakterierna från steg 1,5,suspendera cellerna i 300 l av lösning I och tillsätt 300 l av lösning II (Maxiprep kit från Qiagen). Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur, tillsätt 300 | il 3 M KOAc pH 5,5 och inkubera i 10 minuter på is. Centrifugera proverna vid 4 ° C, maximal hastighet under 10 min. Addera 800 pl av isopropanol för supematantema och inkubera i 10 minuter på is. Centrifugera prover för 15 min vid 4 ° C och tvätta pelleten med 500 | il av 70% etanol. Låt pelleten torka och återsuspendera det under sterila betingelser i 40 | il Tris-EDTA pH 8,0. Den bacmid DNA ska förvaras vid 4 ° C.
  7. Generera baculovirus såsom beskrivs i tillverkarens protokoll. Baculoviruses kan lagras vid 4 ° C, skyddat från ljus.

2. Recombinant Protein Expression

  1. För att välja den mest effektiva bakuloviruset för rening och för att övervaka vilken tid toppen av proteinuttryck uppnås, utför en mini-infektion analys as följande: Infect 2 x 10 7 av Sf9-infekterade celler odlades vid 27 ° C i Graces medium (kompletterat med 10% FBS och 1% P / S) med 133 | il (1/150) av bakulovirus. Samla alikvoter av 1,5 ml vid 0, 24, 48 och 72 h efter infektion. Pelletera cellerna och analysera expressionsnivån av proteinet av intresse med Western blotting med användning av anti-tag-antikroppar.
  2. Använd den mest effektiva bakuloviruset från steg 2.1 att infektera en spinnare innehållande 1,0 x 10 6 Sf9 celler per ml i 500 ml media med ett förhållande på 1/150 mellan virus och media. Låt de infekterade cellerna växa i suspension vid 27 ° C och skörda cellerna när maximal proteinexpression (bestämd i steg 2.1 ovan) har uppnåtts. Pelleterade celler kan förvaras vid -80 ° C tills vidare användning.

3. Beredning av lösliga Cell Lysate

Alla följande inkubationssteg genomförs vid 4 ° C under försiktig rotation.

  1. Lyse SF9-celler som uttrycker en protein av intresse i ~ 20 ml av GST-bindningsbuffert (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% Triton-X-100, 1 mM DTT i PBS1X för en slutkoncentration av NaCl av 250 mM och proteasinhibitor cocktail (Roche). I ett isvattenbad, dounce lösningen 20x med en Dounce homogenisator, sonikat 3x 30 sekunder vardera (70% output), och dounce igen 20x.
  2. (Tillval). Inkubera det totala cellysatet med 1 mM MgCl2 och bensonas 7 nukleas (2,5 U / ml) under 30 min vid 4 ° C för att avlägsna DNA eller kontamination RNA.
  3. Centrifugera vid 18000 rpm under 30 minuter vid 4 ° C. Håll supematanten.
  4. (Tillval). Centrifugera supernatanten igen under 30 min vid 18000 rpm vid 4 ° C för att få en klar lösligt lysat. Passera supernatanten genom ett 0,2 eller 0,45 | im filter för att undvika igensättning.

4. Bindning av protein på GST Pärlor

  1. Inkubera det lösliga cellysatet med 1 ml av GST-kulor (förtvättad två gånger med10 ml av GST-bindningsbuffert) under 1 h vid 4 ° C under försiktig rotation.

Kommentar: Inkubationstiden måste optimeras beroende på stabiliteten hos proteinet och bindningseffektiviteten.

  1. Snabb dragning vid 700 varv per minut och avlägsna supernatanten innehållande obundna proteiner (detta kan hållas för vidare analys). Tvätta GST bundna proteiner (Figur 3B, band 1) med GST tvättbuffert (GST bindningsbuffert med 350 mM NaCl slutlig).
  2. Upprepa steg 4.2 2x. Vid den sista tvättningen, avlägsna så mycket supernatant som möjligt.
  3. Inkubera pärlorna med 5 mM ATP och 15 mM MgCl2 (i 10 ml GST bindningsbuffert) under 1 h vid 4 ° C för att undvika icke-specifik bindning av värmechockproteiner 8. Tvätta pärlorna tre gånger med GST tvättbuffert.

5. PreScission Klyvning av GST

  1. Centrifugera GST pärlor, avlägsna supernatanten och tvätta GST pärlor med P5 buffer (50 mM NaHPO 4 pH 7,0, 500 mM NaCl, 10% glycerol, 0,05% Triton-X-100, 5 mM imidazol).
  2. Inkubera GST-pärlor med PreScission enzym i P5 buffert från 3 timmar till över natten vid 4 ° C. (Dela GST pärlor i fraktioner om 100 | il och tillsätt 4-8 enheter (2-4 | il) av enzymet utspätt i 100 ul av P5-buffert).

Kommentar: Inkubationstiden av PreScission steg måste optimeras beroende på molekylvikten liksom stabiliteten av proteinet. Om nedbrytning kan iakttas kan detta inkubationstiden minskas till ett minimum av 2 h i stället för över natten.

  1. Snabb dragning och samla in supernatanten. Upprepa detta steg två gånger efter tillsats av 100 ^ P5 buffert till kulorna och samla alla fraktioner (Figur 3B, spår 2).

Kommentar: De återstående pärlor kan användas för analys av klyvningseffektiviteten (Fig. 3B

6. Protein-bindning till TALON Metal Affinity Resin

  1. Dela in eluering från ovan i 3 fraktioner om 1 ml och inkubera vardera med 100 pl Talon metall affinitetsharts torra kulor (förtvättad två gånger med P5 buffert) i 1 timme under rotation.

Kommentar: Att dela eluering i flera fraktioner ökar bindande / tvättar effektivitet.

  1. Tvätta hartset 5 min med P30-buffert (P5-buffert med en slutkoncentration av 30 mM imidazol).
  2. Upprepa steg 6,2 2x och samla pärlor i ett enda rör. Innan den sista tvättningen, avlägsna så mycket supernatant som möjligt.

Kommentar: Detta motsvarar den TALON bundna provet (figur 3B, spår 4).

7. Eluering av det renade proteinet

  1. Inkubera proteinbundet TALON harts för 5 min under rotation med P500 buffert (P5-buffert med en slutlig koncentration av 500 mM imidazol). Använd ett förhållande mellan buffert och pärlor av 01:01 volym / volym (Till exempel, om du hade tagit 200 pl torra pärlor, måste du lägga till 200 l av P500). Upprepa detta steg två gånger och hålla varandra eluerad fraktion för sig (som heter eluering 1 (E1), eluering 2 (E2) och eluering 3 (E3), Figur 3B, raderna 5-7).

Kommentar: De återstående pärlor kan användas för analys av eluering effektivitet (figur 3B, spår 8). Typiskt är 60-80% av proteinet eluerades i totalt.

  1. Analysera kvantiteten och kvaliteten på renat protein genom att ladda ca 20-40 l av varje fraktion med en standard BSA koncentration på en SDS-PAGE och fläck med Coomassie blue (Figur 3B) eller SYPRO protein fläcken för visualisering.

Kommentar: protein av intresse kan också detekteras throughout reningsproceduren med användning av anti-GST-och anti-His-antikroppar (Figur 3C).

8. Lagring av det renade proteinet

  1. Dialysera renade proteinet mot en lämplig buffert lagring (t.ex. 20 mM Tris-acetat pH 8,0, 200 mM KAc, 10% glycerol, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT) vid 4 ° C. Det är viktigt att kontrollera för utfällning av det renade proteinet under dialysen. Vi dialysera vanligen 2x under 1 timme vid 4 ° C under omröring för rotation.
  2. Gör små alikvoter av det renade proteinet (från 10 till 20 | il) och frysa på torris under 30 min. Förvara alikvoter vid -80 ° C och undvika många tö / fryscykler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I syfte att illustrera effektiviteten av GST-His reningsprotokoll, renades vi Rec14, en S. pombe protein på 32,9 kDa. Den Rec14 cDNA klonades i vår modifierade pFastBac1 vektor tillåter tillägg av GST-och His-taggar på N-och C-terminalerna, respektive (Figur 1A). Rekombinanta baculovirus ställdes sedan och användes för att infektera SF9 infekterade celler för proteinuttryck. De lösliga cellysat inkuberades med GST pärlor och bundna proteiner eluerades genom klyvning av GST med PreScission proteas. Den erhållna Rec14-His-proteinet var affinitetsrenades på TALON-harts och bundna proteiner eluerades med TALON-buffert innehållande 500 mM imidazol. Renat Rec14-His dialyserades i lagringsbuffert och lagras vid -80 ° C (Figur 1B).

De lösliga och totala cellysat från SF9-celler infekterade med det Rec14 rekombinant baculovirus, eller falsk-infekterades som kontroll, analyserades genom CoomAssie blå färgning, vilket tillåter oss att bekräfta uttrycket av GST-Rec14-His protein (Figur 3A). Under reningsprocessen, var många prover analyseras för att följa effektiviteten av metoden. Analys av dessa prov genom Coomassie blue-färgning (figur 3B) visar att under det första steget av rening, GST-Rec14 fullständigt bunden till GST-pärlor, med en skenbar molekylvikt av ~ 60 kDa på grund av fusion av Rec14 (32,9 kDa) med GST (29 kDa) (spår 1). Efter PreScission klyvning av GST, GST-free Rec14-His migrerar runt 37 kDa (spår 2), medan den kluvna GST kan visualiseras på GST-kulor (spår 3, omkring 25 kDa). Trots att en del av GST-fri Rec14 som fortfarande förblev bunden till GST-kulor (spår 3), noter anrikning i Rec14-His uppnåddes (spår 2, utan någon förorening synlig på Coomassie-blått-färgning). Detta steg skulle kunna förbättras genom ökning av inkubationstiden för proteinet med PreScission. Analys av Rec14-His bundet till TALONpärlor (efter steg 7.1, rad 4) jämfört med de proteiner elueras efter GST reningssteg (spår 2), visar att en stor andel av Rec14-His är bunden till TALON pärlor. Efter flera tvättningar, var Rec14-His eluerades och uppsamlas. Tre elueringar utförts. Analysen visade en hög renhet av Rec14-His (inget kontaminant synliga genom Coomassie-färgning, spår 5 till 7), och den största koncentrationen av Rec14-His i den första elueringen. Jämförelse av eluerade fraktionerna (spår 5-7) till Talon kulorna efter eluering (spår 8) illustrerar effektiviteten för eluering, eftersom endast ett fåtal Rec14-His kan detekteras som bundet på pärlor.

Prov som användes i figur 3B utsattes för Western blot-analys med anti-GST-och anti-His-antikroppar för att följa Rec14 under hela förfarandet (Figur 3C). Den anti-GST-blot visar att vissa GST-Rec14 och GST ensam, var närvarande i de eluerade proteinerna från GST reningssteget (rad 2), och thvid föroreningar avlägsnades genom den His-tag-affinitetsreningssteg. Detta blot tillåter oss också att övervaka att GST hade effektivt bort från Rec14 av PreScission behandling och His-tag reningssteg (banorna 4-8). Den anti-His-blot syftar till att detektera Rec14. Vi kan alltså bekräfta att GST-Rec14-His och Rec14-His inte fullständigt spaltas och avlägsnas från GST-kulor (spår 11). Dessutom är vid en hög koncentration tycks Rec14 att aggregera (bana 13). Sammanfattningsvis är de resultat som presenteras demonstrera effektiviteten av GST-His-rening för reningen av S. pombe Rec14.

Figur 1
Figur 1. Schematisk skiss av GST-His två-stegs affinitetsreningsmetod. A. GST-Rec14-His-konstruktionen klonades in i pFastBac (Baculovir. oss expressionsvektor) B. Tvåstegs affinitetsrening av GST-Rec14-His från Sf9 lösliga cellysat:. GST-bindande, följt av PreScission klyvning av GST, TALON-bindning och eluering med imidazol Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2
Figur 2. Schematisk representation av pFastBac1-GST-10xHis. GST (grön), PreScission proteasställe (ljusblå), är multikloningsstället (röd), och den 10-His tag (mörkblå) visas. I gemener är nukleotidsekvensema ursprung från pET-52b (+). Klicka här för att visa en större bild .

together.within-page = "alltid"> Figur 3
Figur 3. Föredömligt resultat av GST-Hans rening av Rec14. A. Coomassie-färgning av det totala proteinfraktionen (spår 2 och 3) och lösligt cell-lysat (spår 4 och 5) från skenbehandlade Sf9-celler (bana 2 och 4) eller infekterades med GST-Rec14-His bakulovirus (spår 3 och 5). Rec14-His och GST besitter en molekylvikt av ungefär 32,9 kDa och 29 kDa, respektive, och GST-Rec14-His-fusionsprotein som har en molekylvikt av ca 61,9 kDa. B. Coomassie-färgning som visar varje steg i proteinreningsmetod (till detaljerad förklaring se Arbetsgång) C. Western blöt av fraktionerna efter reningsförfarandet med anti-GST (spår 1-8) och anti-His-(spår 9 till 16)-antikroppar.upload/50320/50320fig3large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

GST-His reningsprotokoll som presenteras här är lämplig för rening av ett brett urval av storlekar av rekombinanta proteiner: Vi renade framgångsrikt Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa) PALB2 (130kDa) och en instabil högmolekylärt protein av Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Dessutom är de proteiner som renats med detta protokoll var biokemiskt aktiv 6. Framgången med denna metod beror enbart på uttryck, stabilitet och löslighet av det önskade proteinet.

Molekylärbiologiska vektorer för expression i andra värdar, såsom E. coli eller jäst, kan enkelt ändras med hjälp av allmänt tillgänglig GST och hans taggar. Detta belyser användbarhet och kostnadseffektivitet för denna teknik för de flesta molekylärbiologiska labb. En rad fördelar påverkat vårt beslut att välja infekterade celler över bakterie-eller däggdjursceller för recombinant-proteinexpression och rening. Till exempel kan post-translationella modifieringar, såsom metylering, fosforylering och ubiquitinylation starkt påverkar den enzymatiska funktionen av ett protein 10. Därför, för att studera de fysiologiska egenskaperna hos ett protein, är det fördelaktigt att använda ett system som gör det möjligt för posttranslationell modifiering, t.ex. Sf9 infekterade celler. En annan fördel med att använda Sf9 över däggdjursceller, till exempel, är av ekonomisk art, eftersom den infekterade cellen systemet kräver betydligt färre celler och inga dyra transfektion metod jämfört med däggdjurssystem.

Enkelheten hos den presenterade metoden kommer att hjälpa forskare att erhålla ett protein eller proteinkomplex i en starkt renad form med standard laboratorieutrustning, vilket är fördelaktigt för ett labb med minimal utrustning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Vi tackar Anne-Marie Dion-Cote för överläggningar som leder till utvecklingen av metoden. JK och RB är FQNRT doktors forskare, är M.-MG en Vanier CIHR lärd, och J.-YM är en FRSQ senior forskare. Detta arbete stöddes av medel från naturvetenskap och teknik Forskningsrådet till JY. M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
E.Coli DH10Bac (competent) Invitrogen
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen
Maxi Prep Kit Qiagen 12163 Solution I and II
Ultra Pure Bluo-Gal Gibco (Life) 15519028
IPTG Gibco (Life) 15529019
Sf9 infected cells ATCC CRL-1711
PreScission enzyme GE Healthcare 27084301
Grace's infected medium supplemented Gibco (Life) 11605-094
Fetal Bovine Serum characterized Hyclone SH30396.03
P/S (Penicillin-Streptomycin) Gibco (Life) 15070-063
Glutathione Sepharose resin GE bioscience 17075605
Protease inhibitor cocktail Roche 11873580001
Talon resin Clontech 635504
Imidazole BioShop 288324
Gentamicin Gibco (Life) 15710064
Polyclonal GST-antibody Production in house
Monoclonal 6X-His-antibody Clontech 631212
EQUIPMENT
Dounce homogenizer (tight) Wheaton 357546
Sonicator (Fisher dismembrator) Fisher Model 150
Dialysis bag (50 mm) Fisher Scientific 2115217

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
  2. Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL. Trends Genet. 12, 209-210 (1996).
  3. Carr, S., et al. Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems. Vaccine. 18, 153-159 (1999).
  4. Armisen, P., et al. Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports. J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).
  5. Kuhn, S., Zipfel, P. F. The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins. Gene. 162, 225-229 (1995).
  6. Buisson, R., et al. Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).
  7. Filimonova, M. N., et al. Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism. Biochemistry. 62, 983-988 (1997).
  8. Thorslund, T., et al. The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).
  9. Genois, M. M., et al. Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum. Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).
  10. Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression. Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics