GST-Hans rensing: en to-trinns Affinitetsrensing Protocol Givende Full-lengde Purified Proteiner

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

I den foreliggende protokoll, vi demonstrere en svært effektiv og kostnadseffektiv småskala protein rensing metoden, som gjør det mulig for rensing av rekombinante proteiner ved unikt å kombinere en cleavable GST-tag og en liten Hans-tag.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Maity, R., Pauty, J., Krietsch, J., Buisson, R., Genois, M. M., Masson, J. Y. GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins. J. Vis. Exp. (80), e50320, doi:10.3791/50320 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nøkkel assays in Enzymology for biokjemisk karakterisering av proteiner in vitro nødvendiggjør høye konsentrasjoner av det rensede protein av interesse. Protein rensing protokoller bør kombinere effektivitet, enkelhet og kostnadseffektivitet en. Her beskriver vi GST-Hans metode som en ny småskala affinitetsrensing system for rekombinante proteiner, basert på en N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST) 2,3 og en C-terminal 10xHis tag 4, som begge er smeltet til proteinet av interesse. Den sistnevnte konstruksjon blir brukt til å generere baculovirus, for infeksjon i Sf9-infiserte celler for proteinekspresjon 5. GST er en ganske lang-tagg (29 kDa) som tjener til å sikre at renseeffekt. Imidlertid kan det påvirke fysiologiske egenskaper av proteinet. Derfor er det deretter spaltes av proteinet ved hjelp av PreScission enzymet 6.. For å sikre maksimal renhet og for å fjerne det avspaltede GST, vilagt til en andre affinitetsrensing trinn basert på den forholdsvis lille His-Tag. Viktigere er vårt teknikk basert på to forskjellige koder som flankerer de to endene av protein, som er et effektivt verktøy for å fjerne nedbrutte proteiner og derfor beriker full-lengde proteiner. Metoden som presenteres her ikke krever en kostbar instrumental oppsett, for eksempel FPLC. I tillegg er innarbeidet vi MgCl2 og ATP vaskinger for å fjerne varme-sjokk protein urenheter og nuklease-behandling for å oppheve forurensende nukleinsyrer. I sammendrag, er kombinasjonen av to forskjellige koder som flankerer den N-og C-terminale, og evnen til å holde seg ved en av de kodene, garanterer utvinning av et høyt renset, og full-lengde proteinet av interesse.

Introduction

Rensing av rekombinante proteiner er avgjørende for å løse grunnleggende spørsmål i biokjemi. Konvensjonelle måter for proteinrensing som ionebytterkromatografi og gelfiltrerings-kromatografi er avhengige av de fysiske egenskapene til målproteinet som sitt isoelektriske punkt og lade eller størrelse, henholdsvis. De sistnevnte protein karakteristika deles av en rekke proteiner, noe som øker betydelig sjansen for kontaminerende proteiner i konvensjonelle proteinrensestrategier. Dette problem kan omgås ved bruk av flere rensekolonner, noe som er tidkrevende. På samme tid, de sistnevnte kromatografiske metoder krever kost eksperimentelle oppsettet. Affinitet-tag rensing kraftig øker mål-spesifisiteten, som i de fleste tilfellene merkelappen vil være unik for proteinet av interesse. I nyere studier har Flagg-eller HA-affinitetsrensing blitt mye brukt.

I motsetning til eksisterende recombinant protein rensing protokoller hvor enkle koder brukes, etablerte vi en unik kombinasjon av to koder. Vår metode involverer fusjon av en GST-tag ved N-terminus og en His-tag ved C-terminus av proteinet av interesse, for et optimalt forhold mellom mengde og renhet av det ønskede protein. GST er en lang kode (29 kDa), noe som er svært effektiv for rensing på glutation Sepharose-kuler. Videre bruker GST garanterer kostnadseffektivitet av vår metode en. Muligheten for å spalte av GST med PreScission enzymet (med gjenkjennelsessekvens LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, noe som resulterer i at tilsetningen av bare to aminosyrer) har mange fordeler, for eksempel, unngår denne strategien endringer i de fysiologiske proteinfunksjoner på grunn av allosterisk hindring. Den lille His-tag kondensert til den andre protein ekstremiteten tjener i et andre rensetrinn for å øke protein renhet ved vask av den avspaltede GST, samt degradert proteiner og annet forurensninger. I tillegg gjør protokollen krever ikke en dialyse skritt når du bytter fra GST til Hans-rensingen kolonne (Talon harpiks). Vanlige forurensninger i slike renseprosessene er Heat Shock Proteins (HSP). Tilsetningen av et inkubasjonstrinn med MgCl2 og ATP tillater fjerning av disse forurensninger (fig. 1).

Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC), og High Performance Liquid Chromatography (HPLC) er vanlige teknikker som er avhengig av kostbar instrumentering for å gi høyt utbytte av det rensede protein av interesse. Den batch rensing protokollen vi presenterer her, i kontrast, er manuell og krever ikke en dyr instrumental oppsett. En høy avkastning av protein kan nås ved å skalere opp protokollen. På samme tid, og den satsvise rensing protokollen, elueringsvolumet kan justeres for å øke proteinkonsentrasjonen, som ikke er gitt med FPLC eller HPLC.

ntent "> Også med batch GST-His rensing protokollen, proteiner med et størrelsesområde fra ~ 10 til 300 kDa kan renses. Ett av de største fordelene er gitt ved det faktum at man kan rense flere proteiner samtidig For eksempel, både et villtype og dets mutant protein. Suksessen til den fremlagte protokoll utelukkende avhenger av uttrykket nivå, og løseligheten av proteinet av interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Produksjon av rekombinant Baculovirus

Baculovirus er generert ved hjelp av Bac-til-Bac Baculovirus Expression System of Invitrogen hovedsak i samsvar med produsentens protokoll med kun små endringer:

  1. En modifisert pFastBac1 vektor (Gibco, liv) ble opprettet som inneholder GST og Hans-tags (figur 2). Den MultiCloning Side (MCS) av en PET-52b (+) vektor (Novagen), som inneholder en 10xHis-tag, ble satt inn i MCS av en pFastBac1 vektor for å generere pFastBac1-streptokokk-10xHis. PET-52b (+) MCS sekvens var PCR forsterket mellom Xbal og BlpI restriksjonsseter, og legger en BglII restriksjonssete på 5 'ytterpunkt og en Hindlll restriksjonssete på 3' ytterpunkt. PCR-produktet ble deretter klonet mellom BamHI-og Hindlll-restriksjonssete i pFastBac1, ved hjelp av kompatibiliteten til BamHI-og Bglll-restriksjonssekvenser. Siden målet var å generere en pFastBac1 tillater ekspresjon avrekombinant protein med streptavidin-og 10xHis-tags, BamHI restriksjonssete av PET-52b (+) MCS sekvensen ble ikke brukt. Også XbaI restriksjonssete ble ikke brukt for å unngå redundans av restriksjonsseter oppstår mellom områder som allerede er i MCS av pFastBac1 og disse er satt inn med MCS PET-52b (+). GST-kodende sekvens med PreScission protease-gjenkjenningssete (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) ble deretter satt inn i pFastBac1-Strep-10xHis. GST cDNA-sekvensen fra pGEX-6P-2 (GE Healthcare) ble PCR amplifisert med primere inneholdende Ncol og Kpnl-restriksjonsseter i 5 'og 3' ekstremiteter, respektivt. Den NcoI området tillater tilsetning av et startkodon, men også en Alanin til GST. PCR-produktet ble deretter klonet inn pFastBac1-streptokokk-10xHis mellom NcoI og KpnI restriksjonssetene, noe som resulterer i sletting av Streptavidin-tag. Den nye onsvektor således oppnådd ble kåret pFastBac1-GST-10xHis.
  2. Klone cDNA som koder for den protein av interesse inn i pFastBac-GST-10xHis vektor mellom GST (N-terminal) og Hans-tag (C-terminal). Vær nøye med å fjerne cDNA-stopp-kodonet for å tillate sammensmelting med den C-terminale His-tag.
  3. Transform E. coli DH10Bac med det rekombinante pFastBac (oppnådd i trinn 1.2) for å generere bacmid. Tillat kolonier å vokse over natten ved 37 ° C og flere timer ved 30 ° C på plater inneholdende valg Bluo-gal og IPTG (10 pg / ml tetracyklin og 50 ug / ml kanamycin, 7 pg / ml gentamycin, 100 pg / ml Bluo- Gal, 40 ug / ml IPTG).
  4. Plukk og restreak to hvite kolonier (fra trinn 1,3) på valg plater for å bekrefte den hvite fenotype.
  5. Inokulere 2 ml LB inneholdende 10 pg / ml tetracyklin og 50 ug / ml kanamycin, 10 ug / ml gentamycin med de to hvite kolonier fra trinn 1.4 og la dem vokse over natten under omrøring (250 rpm) ved 37 ° C.
  6. For å rense bacmid DNA, pelletere bakteriene fra trinn 1.5,resuspender cellene i 300 mL av løsningen jeg og legge 300 mL av løsning II (Maxiprep kit fra Qiagen). Inkuber i 5 min ved romtemperatur, tilsett 300 ul av 3 M KOAc pH 5,5 og inkuberes i 10 min på is. Sentrifuger prøvene ved 4 ° C, maksimal hastighet i 10 min. Legg 800 mL isopropanol i supernatantene og inkuberes i 10 min på is. Sentrifuger prøvene i 15 min ved 4 ° C og vaskes pelleten med 500 pl av 70% etanol. La det tørke og resuspender pelleten det under sterile betingelser i 40 pl Tris-EDTA pH 8,0. Den bacmid DNA bør lagres ved 4 ° C.
  7. Generere baculovirus som beskrevet i produsentens protokoll. Baculovirus kan lagres ved 4 ° C beskyttet mot lys.

2. Rekombinant Protein Expression

  1. For å velge den mest effektive baculovirus for rensing og for å overvåke hva tid toppen av protein uttrykk er nådd, utføre en mini-infeksjon analysen ens følger: infisere 2 x 10 7 av Sf9 infiserte celler dyrket ved 27 ° C i Grace medier (supplert med 10% FBS og 1% P / S) med 133 mL (1/150) av baculovirus. Samle aliquoter av 1,5 ml ved 0, 24, 48 og 72 timer etter infeksjon. Pellet celler og analysere ekspresjonen nivå av proteinet av interesse ved western blotting ved å bruke anti-tag antistoff.
  2. Bruk den mest effektive baculovirus fra trinn 2.1 til å infisere en spinner inneholdende 1,0 x 10 6. Sf9-celler per ml i 500 ml medium med et forhold på 1/150 mellom virus-og media. La de infiserte cellene vokser i suspensjonen ved 27 ° C og høste cellene når den maksimale protein ekspresjon (som bestemt i trinn 2.1 over) blir oppnådd. Pelleterte celler kan lagres ved -80 ° C inntil videre bruk.

Tre. Utarbeidelse av Løselig cellelysat

Alle de følgende trinnene inkubering blir utført ved 4 ° C under mild rotasjon.

  1. Lyse SF9-celler som uttrykker proteinet av interesse i ~ 20 ml GST bindingsbuffer (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% Triton-X-100, 1 mM DTT i PBS1X for en endelig konsentrasjon av NaCl på 250 mM, og protease-inhibitor cocktail (Roche). På et isvannbad, Douce-løsningen 20 ganger med en Douce-homogenisator, sonicate 3 x 30 sekunder hver (70%) utgang, og Douce-igjen 20x.
  2. (Valgfritt). Inkuber det totale cellelysat med 1 mM MgCl 2, og benzonase 7 nuklease (2,5 U / ml) i 30 min ved 4 ° C for å fjerne DNA-eller RNA-forurensning.
  3. Sentrifuger ved 18.000 rpm i 30 min ved 4 ° C. Hold supernatanten.
  4. (Valgfritt). Sentrifuger den overliggende væske igjen i 30 minutter ved 18000 rpm ved 4 ° C for å få et klart oppløselig lysat. Før supernatanten gjennom en 0,2 eller 0,45 um filter for å unngå tilstopping.

4. Binding av Protein på GST Perler

  1. Inkuber oppløselig cellelysat med 1 ml av GST-perler (forvasket to ganger med10 ml GST bindingsbuffer) i 1 time ved 4 ° C under forsiktig rotasjon.

Kommentar: Inkubasjonstiden må være optimalisert i henhold til stabiliteten av proteinet og bindingseffektivitet.

  1. Rask runde på 700 rpm og fjern supernatanten inneholder ubundne proteiner (dette kan holdes for videre analyse). Vask de GST-bundne proteiner (figur 3B, felt 1) med GST vaskebuffer (GST bindende buffer med 350 mM NaCl final).
  2. Gjenta trinn 4.2 2x. I siste vask, fjerne så mye supernatant som mulig.
  3. Inkuber perler med 5 mM ATP og 15 mM MgCl2 (i 10 ml GST bindingsbuffer) i 1 time ved 4 ° C for å unngå ikke-spesifikk binding av varmesjokkproteiner 8. Vask kulene tre ganger med GST vaskebuffer.

5. PreScission Spalting av GST

  1. Sentrifuger GST perler, fjern supernatanten og vask GST perler med P5 buffer (50 mM NaHPO 4 pH 7.0, 500 mM NaCl, 10% glyserol, 0,05% Triton-X-100, 5 mM imidazol).
  2. Inkuber GST-perler med PreScission enzym i buffer P5 fra 3 timer til over natten ved 4 ° C. (Del de GST-perler i fraksjoner på 100 pl og tilsett 4-8 enheter (2-4 ul) av enzym fortynnet i 100 pl av P5-buffer).

Kommentar: Inkubasjonstiden for PreScission trinnet må være optimalisert i henhold til molekylvekt, så vel som stabiliteten av proteinet. Ved nedbrytning er observert, kan denne inkubasjonstid bli redusert til et minimum på 2 timer istedenfor over natten.

  1. Rask spinn og samle supernatanten. Gjenta dette trinnet to ganger etter å ha lagt 100 mL av P5 buffer til perlene og basseng alle fraksjoner (Figur 3B, felt 2).

Kommentar: De gjenværende perler kan anvendes for analyse av spalting effektivitet (figur 3B

6. Protein-binding til Talon Metal Affinity Resin

  1. Del eluering fra ovenfor i 3 fraksjoner på 1 ml og inkuberes hver med 100 ul Talon metall affinitet harpiks tørre perler (forvasket to ganger med P5 buffer) i 1 timer under rotering.

Kommentar: Splitte elueringen i flere fraksjoner øker bindende / vasker effektivitet.

  1. Vask harpiksen 5 min med P30 buffer (P5 buffer med en endelig konsentrasjon på 30 mM imidazol).
  2. Gjenta trinn 6,2 2x og basseng perlene i et enkelt rør. Før den siste vaskingen, fjerne så mye supernatant som mulig.

Kommentar: Dette tilsvarer Talon bundet prøven (Figur 3B, lane 4).

7. Eluering av den rensede protein

  1. Inkuber proteinbundet Talon harpiks for 5 min etter rotasjon med P500 buffer (P5 buffer med en endelig konsentrasjon på 500 mM imidazol). Bruke et forhold mellom buffer og perler av 01:01 v / v. (For eksempel, hvis du hadde tatt 200 mL av tørre perler, må du legge til 200 mL av P500). Gjenta dette trinnet to ganger og holde hver elueres brøkdel separat (oppkalt eluering 1 (E1), eluering 2 (E2) og eluering 3 (E3), Figur 3B, baner 5-7).

Kommentar: De gjenværende perler kan anvendes for analyse av eluering effektivitet (figur 3B, felt 8). Vanligvis blir 60-80% av proteinet eluert totalt.

  1. Analyser kvantiteten og kvaliteten på renset protein ved å laste ca 20-40 mL av hver fraksjon med en standard BSA konsentrasjon på en SDS-PAGE og beis med Coomassie blå (Figur 3B) eller SYPRO protein flekken for visualisering.

Kommentar: Den protein av interesse kan også påvises throughout rensing prosedyren ved hjelp av anti-GST og anti-Hans antistoffer (Figur 3C).

8. Lagring av den rensede protein

  1. Dialyser det rensede protein mot en passende lagringsbuffer (for eksempel 20 mM Tris-acetat pH 8,0, 200 mM KAc, 10% glyserol, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT) ved 4 ° C. Det er viktig å kontrollere utfelling av det rensede protein i løpet av dialysen. Vi vanligvis dialyser 2x i 1 time ved 4 ° C under omrøring rotasjon.
  2. Lag små alikvoter av det rensede protein (10-20 pl) og fryses på tørris i 30 min. Oppbevar alikvoter ved -80 ° C, og unngår mange tine / frysesykluser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å illustrere effektiviteten av GST-His rensing protokollen, renset vi Rec14, en S. pombe protein av 32,9 kDa. Den Rec14 cDNA ble klonet i vår endret pFastBac1 vektor slik at tilleggene av GST-og Hans-tags på N-og C-termini, henholdsvis (figur 1A). Rekombinante baculovirus ble deretter fremstilt og brukt til å infisere Sf9-infiserte celler for proteinekspresjon. De oppløselige cellelysater ble inkubert med GST-perler og bundet-proteiner ble eluert ved å spalte den med GST PreScission protease. Den resulterende Rec14-His proteinet ble affinitetsrenset på TALON harpiks og felte proteiner ble eluert med Talon-buffer inneholdende 500 mM imidazol. Renset Rec14-His ble dialysert i lagringsbuffer og lagret ved -80 ° C (figur 1B).

De løselige og totale cellelysater fra Sf9 celler infisert med Rec14 rekombinant baculovirus, eller mock-smittet som kontroll, ble analysert ved Coomassie blå flekker, slik at vi kan bekrefte uttrykk for GST-Rec14-Hans protein (figur 3A). Under renseprosessen ble mange prøver analysert for å følge effektiviteten av fremgangsmåten. Analyse av disse prøver med Coomassie blå farging (figur 3B) viser at i løpet av det første trinn av rensing, ble GST-Rec14 fullstendig bundet til GST-perler, med en tilsynelatende molekylvekt på ~ 60 kDa på grunn av sammensmelting av Rec14 (32.9 kDa) med GST (29 kDa) (felt 1). Etter PreScission spaltning av GST, GST-fri Rec14-His vandrer rundt 37 kDa (felt 2), mens den avspaltede GST kan visualiseres på GST-perler (søyle 3, rundt 25 kDa). Til tross for en del av GST-fri Rec14 som fortsatt forble bundet til GST perler (kolonne 3), bemerkelsesverdig berikelse i Rec14-Hans ble oppnådd (felt 2, uten forurensning synlig på Coomassie blå flekker). Dette trinnet kan forbedres ved å øke inkubasjonstid av proteinet med PreScission. Analyse av Rec14-Hans bundet til Talonperler (etter trinn 7.1, felt 4) i forhold til de eluerte proteiner etter GST rensetrinn (felt 2), viser at en stor andel av Rec14-His er bundet i Talon-perler. Etter flere gangers vask, ble Rec14-Hans elueres og samlet. Tre elueringer hadde blitt utført. Analysen viste en høy renhet av Rec14-His (ingen forurensning er synlig ved Coomassie farging, kolonnene 5 til 7), og den største konsentrasjonen av Rec14-His i den første eluering. Sammenligning av eluerte fraksjoner (kolonnene 5-7) til Talon-perler etter eluering (søyle 8) illustrerer effektiviteten av eluering, siden bare noen få Rec14-His kan oppdages så bundet til kulene.

Prøver som er brukt i figur 3B ble utsatt for western blot analyse med anti-GST-og anti-His-antistoffer for å følge Rec14 gjennom hele fremgangsmåten (figur 3C). Den anti-GST blot viser at en del GST-Rec14 og GST alene, var til stede i de eluerte proteiner fra GST-rensetrinn (felt 2), og that forurensninger ble fjernet ved His-tag affinitetsrensing trinn. Dette blot tillater oss også å overvåke at GST hadde blitt effektivt fjernet fra Rec14 av PreScission behandling og Hans-tag rensingen (baner 4 til 8). Den anti-His blot tar sikte på å detektere Rec14. Vi kan dermed bekrefte at GST-Rec14-Hans og Rec14-Hans var ikke helt spaltet og fjernet fra GST perler (kolonne 11). Dessuten, ved en høy konsentrasjon, virker Rec14 å aggregere (søyle 13). I sammendrag, er resultatene presentert demonstrere effektiviteten av GST-His rensing for rensing av S. pombe Rec14.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk skisse av GST-Hans to-trinns affinitetsrensing metode. A. GST-Rec14-Hans konstruere klonet inn pFastBac (Baculovir. oss ekspressjonsvektor) B. To-trinns affinitetsrensing av GST-Rec14-Hans fra Sf9 løselig cellelysat:. GST-binding, etterfulgt av PreScission spalting av GST, Talon-bindende og eluering med imidazol Klikk her for å se større figur .

Fig. 2
Figur 2. Skjematisk fremstilling av pFastBac1-GST-10xHis. GST (grønn), PreScission protease hotellet (lys blå), er den multicloning hotellet (rød), og den 10-His tag (mørk blå) vist. I små bokstaver er de Nukleotidsekvensene stammer fra Pet-52b (+). Klikk her for å se større figur .

together.within-page = "always"> Figur 3
Figur 3. Eksemplarisk resultat av GST-Hans rensing av Rec14. A. Coomassie farging av total proteinfraksjon (søyle 2 og 3), og oppløselige cellelysat (felt 4 og 5) fra uekte behandlet med Sf9-celler (søyle 2 og 4), eller infisert med GST-Rec14-His baculovirus (felt 3 og 5). Rec14-His-og GST har en molekylvekt på omtrent 32,9 kDa og 29 kDa, henholdsvis, og det GST-Rec14-His fusjonsproteinet har en molekylvekt på omtrent 61,9 kD. B. Coomassie farging som viser hvert trinn i proteinrensemetode (for detaljert forklaring I prosedyre) C. Western blot av fraksjonene etter rensing fremgangsmåte med anti-GST (søyle 1-8) og anti-His (søyle 9-16) antistoffer.upload/50320/50320fig3large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den GST-Hans rensing protokoll som presenteres her er egnet for rensing av et bredt spekter av størrelser av rekombinante proteiner: Vi vellykket renset Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), og en ustabil høy molekylvekt protein av Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Videre er proteiner renset med denne protokollen var biokjemisk aktive 6. Suksessen med denne fremgangsmåten bare er avhengig av uttrykk, løselighet og stabilitet av det ønskede protein.

Molecular biology vektorer for ekspresjon i andre verter, slik som E. coli eller gjær, kan enkelt endres ved hjelp av allment tilgjengelig GST og hans koder. Dette understreker anvendelighet og kostnadseffektivitet av dagens teknikk for de fleste molekylærbiologiske laboratorier. En rekke fordeler påvirket vår beslutning om å velge infiserte celler over bakterie-eller pattedyrceller for recombinant protein uttrykk og rensing. For eksempel kan posttranslational modifikasjoner som metylering, fosforylering og ubiquitinylation sterkt påvirke den enzymatiske funksjon av et protein 10. Derfor, for å studere de fysiologiske egenskapene til et protein, er det fordelaktig å bruke et system som gjør det mulig for posttranslational modifikasjon, slik som Sf9-infiserte celler. En annen fordel med å bruke Sf9 løpet av pattedyrceller, for eksempel, er av økonomisk art, da den infiserte cellesystem krever betydelig færre celler og ingen kostbar metode for transfeksjon i forhold til pattedyrsystemet.

Enkelheten av den presenterte fremgangsmåten vil hjelpe forskere for å oppnå en protein-eller protein-komplekset i en høyt renset form med standard laboratorieutstyr, noe som er fordelaktig for en lab med minimalt utstyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Vi takker Anne-Marie Dion-Cote for diskusjoner som fører til utvikling av metoden. JK og RB er FQNRT stipendiater, er M.-MG en Vanier CIHR lærd, og J.-YM er et FRSQ seniorforsker. Dette arbeidet ble støttet av midler fra de naturvitenskapelige forskningsråd til JY. M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
E.Coli DH10Bac (competent) Invitrogen
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen
Maxi Prep Kit Qiagen 12163 Solution I and II
Ultra Pure Bluo-Gal Gibco (Life) 15519028
IPTG Gibco (Life) 15529019
Sf9 infected cells ATCC CRL-1711
PreScission enzyme GE Healthcare 27084301
Grace's infected medium supplemented Gibco (Life) 11605-094
Fetal Bovine Serum characterized Hyclone SH30396.03
P/S (Penicillin-Streptomycin) Gibco (Life) 15070-063
Glutathione Sepharose resin GE bioscience 17075605
Protease inhibitor cocktail Roche 11873580001
Talon resin Clontech 635504
Imidazole BioShop 288324
Gentamicin Gibco (Life) 15710064
Polyclonal GST-antibody Production in house
Monoclonal 6X-His-antibody Clontech 631212
EQUIPMENT
Dounce homogenizer (tight) Wheaton 357546
Sonicator (Fisher dismembrator) Fisher Model 150
Dialysis bag (50 mm) Fisher Scientific 2115217

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
  2. Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL. Trends Genet. 12, 209-210 (1996).
  3. Carr, S., et al. Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems. Vaccine. 18, 153-159 (1999).
  4. Armisen, P., et al. Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports. J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).
  5. Kuhn, S., Zipfel, P. F. The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins. Gene. 162, 225-229 (1995).
  6. Buisson, R., et al. Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).
  7. Filimonova, M. N., et al. Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism. Biochemistry. 62, 983-988 (1997).
  8. Thorslund, T., et al. The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).
  9. Genois, M. M., et al. Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum. Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).
  10. Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression. Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics