GST-Zijn zuivering: een twee-staps Affiniteitszuivering Protocol Meegevende Full-length gezuiverde eiwitten

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

In het huidige protocol, demonstreren we een zeer efficiënte en kosteneffectieve kleinschalige eiwitreiniging methode, die de zuivering van recombinante eiwitten mogelijk maakt door de unieke combinatie van een splitsbaar GST-tag en een kleine His-tag.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Maity, R., Pauty, J., Krietsch, J., Buisson, R., Genois, M. M., Masson, J. Y. GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins. J. Vis. Exp. (80), e50320, doi:10.3791/50320 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Toets assays Enzymology de biochemische karakterisatie van eiwitten in vitro noodzakelijk hoge concentraties van het gezuiverde eiwit van belang. Eiwitzuivering protocollen te efficiency, eenvoud en kosteneffectiviteit 1 combineren. Hier beschrijven we de GST-His Werkwijze nieuw kleinschalig affiniteit zuiveringssysteem voor recombinante proteïnen, op basis van een N-terminale Glutathion Sepharose tag (GST) 2,3 en een C-terminaal tag 10xHis 4, die beide gefuseerd het eiwit van belang. De laatste construct wordt gebruikt om baculovirussen genereren voor infectie van Sf9-geïnfecteerde cellen voor eiwitexpressie 5. GST is een vrij lange tag (29 kDa) die dient om de zuivering efficiëntie te garanderen. Toch kan het fysiologische eigenschappen van het eiwit te beïnvloeden. Daarom is het vervolgens afgesplitst het eiwit met het enzym PreScission 6. Om maximale zuiverheid te verzekeren en de gesplitste GST te verwijderen, wevoegde een tweede affiniteitszuiveringsfase gebaseerd op de relatief kleine His-tag. Belangrijk is onze techniek waarbij twee verschillende labels aan weerszijden van de twee uiteinden van het eiwit, dat een efficiënt middel om gedegradeerde eiwitten te verwijderen en bijgevolg verrijkt full-length eiwitten. De hier gepresenteerde methode heeft een dure instrumentale setup, zoals FPLC niet nodig. Daarnaast hebben we opgenomen MgCl2 en ATP wast om heat shock protein onzuiverheden en nucleasebehandeling afschaffen verontreinigende nucleïnezuren te verwijderen. Samengevat, de combinatie van twee verschillende labels weerszijden van de N-en C-terminale en de mogelijkheid om splitsen van een van de labels, garandeert het herstel van een sterk gezuiverd en full-length eiwit van belang.

Introduction

De zuivering van recombinante eiwitten is cruciaal om fundamentele vragen in de biochemie aan te pakken. Gebruikelijke manieren eiwitzuivering zoals ionenuitwisselingschromatografie en gelfiltratie afhankelijk fysische eigenschappen van het doeleiwit zoals de iso-elektrische punt en heffingen of grootte, respectievelijk. Deze proteïne kenmerken gedeeld door een verscheidenheid van eiwitten, die aanzienlijk de kans verontreinigende proteïnen in gebruikelijke eiwitzuivering strategieën toe. Dit probleem kan worden omzeild door het gebruik van meerdere kolommen zuivering, hetgeen tijdrovend. Tegelijkertijd, deze chromatografie methoden vereisen dure experimentele opstelling. Affiniteit-zuivering tag sterk toeneemt doel-specificiteit, zoals in de meeste gevallen het label uniek het eiwit van belang zijn. In recente studies is vlag-of HA-affiniteitszuivering grote schaal gebruikt.

In tegenstelling tot bestaande recombinant eiwitzuivering protocollen waarin enkele tags worden gebruikt, hebben we de unieke combinatie van twee tags. Onze werkwijze omvat de fusie van een GST-tag aan de N-terminus en een His-tag aan het C-uiteinde van het eiwit van belang, voor een optimale verhouding tussen de hoeveelheid en zuiverheid van het gewenste eiwit. De GST is een lange markering (29 kDa), die zeer efficiënt voor zuivering op glutathion Sepharose kralen. Bovendien gebruiken GST garandeert kosteneffectiviteit van onze methode 1. De mogelijkheid splitsen van de GST met PreScission enzym (met herkenningssequentie LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, waardoor de toevoeging van twee aminozuren) heeft vele voordelen, bijvoorbeeld, en vermijdt veranderingen van de fysiologische functies eiwit door allosterische belemmering. De kleine His-tag gefuseerd met het andere eiwit uiteinde dient in een tweede zuiveringsstap eiwit zuiverheid te verhogen door het wassen van de gesplitste GST, alsmede afgebroken eiwitten en andere verontreinigingen. Bovendien wordt het protocol geen dialyse stap nodig bij het overschakelen van de GST naar de kolom Zijn-zuiveringsstap (TALON hars). Gemeenschappelijke verontreinigingen dergelijke zuiveringswerkwijzen zijn heat shock eiwitten (HSP). De toevoeging van een incubatiestap met MgCl2 en ATP maakt de verwijdering van deze verontreinigingen (figuur 1).

Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) en High Performance Liquid Chromatography (HPLC) zijn gangbare technieken die afhankelijk zijn van dure instrumentatie hoge opbrengst van het gezuiverde eiwit van belang te genereren. De batch zuiveringsprotocol hier geïntroduceerde daarentegen is handmatig en niet dure instrumentele opstelling vereist. Een hoge opbrengst van eiwit kan worden bereikt door het opschalen van het protocol. Tegelijkertijd, partijnummer zuiveringsprotocol, het elutievolume kan worden aangepast om eiwitconcentratie, die niet wordt gegeven met FPLC en HPLC verbeteren.

ntent "> Ook, partijnummer GST-His zuiveringsprotocol, eiwitten met een grootte-bereik van ~ 10-300 kDa kunnen worden gezuiverd. Een van de grootste voordelen is gegeven door het feit dat een aantal eiwitten kunnen zuiveren tegelijkertijd bijvoorbeeld, zowel wild-type en de mutante eiwitten. Het succes van de gepresenteerde protocol alleen afhankelijk van het expressieniveau en de oplosbaarheid van het eiwit van belang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Productie van Recombinant Baculovirus

Baculovirussen worden gegenereerd met de Bac-to-Bac Baculovirus Expression System van Invitrogen voornamelijk volgens protocol van de fabrikant met slechts geringe wijzigingen:

  1. Een gewijzigde pFastBac 1 vector (Gibco, leven) werd opgericht met de GST en His-labels (figuur 2). De multikloneringsplaats (MCS) van een PET-52b (+) vector (Novagen), met daarin een 10xHis-tag, werd ingebracht in de MCS van een pFastBac 1 vector om pFastBac 1-Strep-10xHis genereren. De pET-52b (+) MCS sequentie werd met PCR geamplificeerd tussen de Xbal en Blpl restrictieplaatsen, het toevoegen van een BglII-restrictieplaats aan het 5'-uiteinde en een HindIII restrictieplaats aan het 3 'uiteinde. Het PCR product werd vervolgens gekloneerd tussen HindIII en BamHI restrictieplaats van pFastBac 1, waarbij de verenigbaarheid van BamHI en BglII restrictie sequenties. Aangezien het doel was om een ​​pFastBac 1 die de expressie van genererenrecombinant eiwit met streptavidine-en 10xHis-labels, de BamHI restrictieplaats van de PET-52b (+) MCS sequentie werd niet gebruikt. Ook werd het Xbal restrictieplaats niet gebruikt om de redundantie van restrictieplaatsen die tussen de plaatsen reeds in de MCS van pFastBac 1 en deze ingebracht met de MCS van pET-52b (+) voorkomen. De GST coderende sequentie met de website PreScission Protease erkenning (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) werd vervolgens in pFastBac 1-Strep-10xHis. De GST cDNA sequentie van pGEX-6P-2 (GE Healthcare) werd PCR geamplificeerd met primers die NcoI en KpnI-restrictieplaatsen aan het 5 'en 3' uiteinden respectievelijk. De NcoI-plaats kan de toevoeging van een startcodon maar ook een alanine aan het GST. Het PCR product werd vervolgens gekloneerd in pFastBac 1-Strep-10xHis tussen de NcoI en KpnI-restrictieplaatsen, waardoor het verwijderen van de Streptavidine-tag. De aldus verkregen nieuwe fusievector werd genoemd pFastBac 1-GST-10xHis.
  2. Kloon het cDNA dat codeert voor het protein van belang in de pFastBac-GST-10xHis vector tussen de GST (N-terminal) en de His-tag (C-terminal). Let op de cDNA stopcodon verwijderen om de fusie met het C-terminale His-tag mogelijk.
  3. Transform E. DH10Bac coli met het recombinante pFastBac (verkregen bij stap 1.2) aan de bacmide genereren. Laat kolonies overnacht groeien bij 37 ° C en enige uren bij 30 ° C op selectieplaten met Bluo-gal en IPTG (10 ug / ml tetracycline, 50 ug / ml kanamycine, 7 ug / ml gentamycine, 100 ug / ml Bluo- Gal, 40 pg / ml IPTG).
  4. Pick en restreak 2 witte kolonies (uit stap 1.3) over de selectie platen om de witte fenotype bevestigen.
  5. Inoculeer 2 ml LB dat 10 ug / ml tetracycline, 50 ug / ml kanamycine, 10 ug / ml gentamycine met de twee witte kolonies van stap 1.4 en laat ze gedurende de nacht groeien onder schudden (250 rpm) bij 37 ° C.
  6. Om de bacmide DNA zuiveren pellet bacteriën van stap 1.5,resuspendeer de cellen in 300 ul van oplossing I en voeg 300 ul van oplossing II (Maxiprep kit van Qiagen). Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, voeg 300 pl 3 M KOAc pH 5,5 en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Centrifugeer de monsters bij 4 ° C, maximale snelheid gedurende 10 minuten. Voeg 800 ul isopropanol aan de supernatanten en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Centrifugeer de monsters gedurende 15 min bij 4 ° C en was het pellet met 500 ui 70% ethanol. Laat het pellet droog en resuspendeer het onder steriele omstandigheden in 40 pl Tris-EDTA pH 8,0. De bacmide DNA moet bij 4 ° C worden bewaard
  7. Genereer baculovirussen zoals beschreven in het protocol van de fabrikant. Baculovirussen kan worden opgeslagen bij 4 ° C beschermd tegen licht.

2. Recombinante eiwitexpressie

  1. Om de meest efficiënte baculovirus voor zuivering kiezen en te controleren hoe laat de piek van eiwitexpressie wordt bereikt, voert een mini-infectie assay eens volgt: Infect 2 x 10 7 van Sf9 geïnfecteerde cellen gekweekt bij 27 ° C in Grace's medium (aangevuld met 10% FBS en 1% P / S) met 133 pl (1/150) van baculovirus. Verzamel fracties van 1,5 ml bij 0, 24, 48 en 72 uur na infectie. Pellet de cellen en de expressie van het eiwit van belang door western blotting met behulp van anti-tag antilichamen te analyseren.
  2. Gebruik de meest efficiënte baculovirus van stap 2.1 een spinner die 1,0 x 10 6 Sf9 cellen per ml in 500 ml medium in een verhouding van 1/150 tussen virus en media infecteren. Laat de geïnfecteerde cellen groeien in suspensie bij 27 ° C en oogst de cellen wanneer de maximale eiwitexpressie (zoals bepaald in stap 2.1) wordt bereikt. Gepelleteerde cellen worden opgeslagen bij -80 ° C tot verder gebruik.

3. Bereiding van oplosbaar cellysaat

Alle volgende incubatiestappen worden uitgevoerd bij 4 ° C uitgevoerd onder milde rotatie.

  1. Lyse Sf9 cellen die de proteïne van belang in ~ 20 ml GST bindingsbuffer (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% Triton-X-100, 1 mM DTT PBS1X een eindconcentratie van NaCI van 250 mM, en proteaseremmer cocktail (Roche). In een ijswaterbad, dounce de oplossing 20x met een dounce homogeniseerapparaat, ultrasone trillingen 3x 30 seconden (70% vermogen), en Dounce weer 20x.
  2. (Optioneel). Incubeer de totale cellysaat met 1 mM MgCl2 en Benzonase 7 nuclease (2,5 U / ml) gedurende 30 min bij 4 ° C aan DNA of RNA verontreiniging te verwijderen.
  3. Centrifugeer bij 18.000 rpm gedurende 30 min bij 4 ° C. Houd de bovenstaande vloeistof.
  4. (Optioneel). Centrifugeer de supernatant opnieuw voor 30 min bij 18.000 rpm bij 4 ° C om een ​​heldere oplosbare lysaat krijgen. Passeren de bovenstaande vloeistof op een 0,2 of 0,45 pm filter om verstopping te voorkomen.

4. Binding van eiwit op GST Beads

  1. Incubeer de oplosbare cellysaat met 1 ml GST-parels (vooraf gewassen tweemaal met10 ml GST bindingsbuffer) gedurende 1 uur bij 4 ° C onder voorzichtige rotatie.

Opmerking: De incubatietijd moet worden geoptimaliseerd overeenkomstig de stabiliteit van het eiwit en bindingsefficiëntie.

  1. Snel centrifugeren op 700 toeren per minuut en supernatant die ongebonden eiwitten (dit kan voor verdere analyse worden bewaard). Was de GST-gebonden eiwitten (Figuur 3B, baan 1) met GST wasbuffer (GST binding buffer met 350 mM NaCl definitief).
  2. Herhaal stap 4.2 2x. Bij de laatste wasbeurt, verwijder zoveel supernatant mogelijk.
  3. Incubeer de kralen met 5 mM ATP en 15 mM MgCl2 (in 10 ml GST bindingsbuffer) gedurende 1 uur bij 4 ° C te voorkomen specifieke binding van heat-shock eiwitten 8. Was de kralen drie keer met GST wasbuffer.

5. PreScission Splitsing van GST

  1. Centrifugeer de GST kralen, verwijder het supernatant en was de GST kralen met P5 buffer (50 mM NaHPO 4 pH 7,0, 500 mM NaCl, 10% glycerol, 0,05% Triton-X-100, 5 mM imidazool).
  2. Incubeer de GST-parels PreScission enzym in P5 buffer van 3 uur tot overnacht bij 4 ° C. (Verdeel het GST kralen in fracties van 100 ui en voeg 4-8 eenheden (2-4 pl) enzym verdund in 100 pl buffer P5).

Opmerking: De incubatietijd van de PreScission stap moet worden geoptimaliseerd volgens het molecuulgewicht en de stabiliteit van het eiwit. Indien wordt waargenomen, kan de incubatietijd nachts worden verlaagd tot ten minste 2 uur in plaats van.

  1. Snelle draai en verzamel de bovenstaande vloeistof. Herhaal deze stap tweemaal na toevoeging van 100 ui P5 buffer op de kralen en bundelen alle fracties (Figuur 3B, baan 2).

Opmerking: De resterende parels worden gebruikt voor analyse van splitsing efficiëntie (Figuur 3B

6. -Eiwit binding aan TALON metaalaffiniteitshars

  1. Verdeel de elutie van bovenaf in 3 fracties van 1 ml en incubeer elk met 100 ul Talon metaalaffiniteitshars droge parels (vooraf gewassen tweemaal met P5 buffer) gedurende 1 uur onder rotatie.

Commentaar: Het verdelen van de elutie in verschillende fracties verhoogt binding / wasbeurten efficiëntie.

  1. Was de hars 5 minuten met P30 buffer (P5 buffer met een eindconcentratie van 30 mM imidazool).
  2. Herhaal stap 6.2 2x en bundelen de kralen in een enkele buis. Vóór de laatste wasbeurt, verwijder zoveel supernatant mogelijk.

Commentaar: Dit komt overeen met de TALON gebonden monster (Figuur 3B, laan 4).

7. Elutie van het gezuiverde eiwit

  1. Incubeer de eiwitgebonden TALON hars gedurende 5 minuten onder rotatie met P500 buffer (P5 buffer met een eindconcentratie van 500 mM imidazool). Gebruik een verhouding tussen buffer en kralen van 1:01 v / v. (Bijvoorbeeld, als je 200 pl droog kralen had genomen, moet je 200 ul P500 toevoegen). Herhaal deze stap twee keer en houden elkaar geëlueerde fractie afzonderlijk (genoemd elutie 1 (E1), elutie 2 (E2) en elutie 3 (E3); Figuur 3B, lanen 5-7).

Opmerking: De resterende parels worden gebruikt voor analyse van elutie efficiëntie (Figuur 3B, laan 8). Typisch wordt 60-80% van het eiwit geëlueerd in totaal.

  1. Analyseer de kwantiteit en kwaliteit van uw gezuiverde eiwit door het laden van ongeveer 20-40 ul van elke fractie met een standaard BSA concentratie op een SDS-PAGE en vlek met Coomassieblauw (Figuur 3B) of SYPRO eiwit vlek voor visualisatie.

Commentaar: Het eiwit van belang kan ook worden thro gedetecteerdughout de zuiveringsprocedure met anti-GST en anti-His-antilichamen (Figuur 3C).

8. Opslag van het gezuiverde eiwit

  1. Dialyseer het gezuiverde eiwit tegen een geschikte opslagbuffer (bijv. 20 mM Tris acetaat pH 8,0, 200 mM KAc, 10% glycerol, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT) bij 4 ° C. Het is belangrijk om te controleren op precipitatie van het gezuiverde eiwit gedurende de dialyse. We meestal dialyseren 2x gedurende 1 uur bij 4 ° C onder roeren rotatie.
  2. Maak kleine hoeveelheden van het gezuiverde eiwit (10-20 pi) en bevriezing op droog ijs gedurende 30 minuten. Bewaar de monsters bij -80 ° C en voorkomen dat veel dooi / vries-cycli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Teneinde de doelmatigheid van de GST-His zuiveringsprotocol illustreren we gezuiverd Rec14 een S. pombe eiwit van 32,9 kDa. De Rec14 cDNA werd gekloneerd in onze gemodificeerde pFastBac 1 vector waardoor de toevoeging van GST-en His-tag aan de N-en C-termini, respectievelijk (figuur 1A). Recombinant baculovirus werden vervolgens bereid en gebruikt om SF9 geïnfecteerde cellen te infecteren voor eiwitexpressie. De oplosbare cellysaten werden geïncubeerd met GST-parels en gebonden eiwitten werden geëlueerd door het splitsen van de GST met PreScission protease. De resulterende Rec14-His eiwit affiniteit gezuiverd op Talon hars en gebonden eiwitten werden geëlueerd met buffer die TALON 500 mM imidazool. Gezuiverd Rec14-His werd gedialyseerd in opslagbuffer en opgeslagen bij -80 ° C (Figuur 1B).

De oplosbare en totale cellysaten van Sf9-cellen geïnfecteerd met de recombinante baculovirus Rec14 of mock-geïnfecteerde als controle, werden geanalyseerd met CoomAssie blauwe kleuring, zodat we de expressie van GST-Rec14-His-eiwit (Figuur 3A) bevestigen. Tijdens het zuiveringsproces werden vele monsters geanalyseerd om de efficiëntie van de werkwijze te volgen. Analyse van deze stalen door Coomassie blauw kleuring (Figuur 3B) toont dat tijdens de eerste stap van zuivering GST-Rec14 juist is gebonden aan GST korrels, met een schijnbaar molecuulgewicht van ~ 60 kDa door de fusie van Rec14 (32.9 kDa) met GST (29 kDa) (baan 1). Na PreScission splitsing van de GST, GST-free Rec14-His migreert ongeveer 37 kDa (laan 2) terwijl het gesplitste GST kan worden gevisualiseerd op het GST-parels (laan 3, ongeveer 25 kDa). Ondanks een gedeelte van-GST gratis Rec14 dat bleef gebonden aan GST kralen (baan 3), opvallende verrijking in Rec14-His werd bereikt (baan 2, zonder verontreiniging zichtbaar op Coomassieblauw kleuring). Deze stap kan worden verbeterd door de incubatietijd van het eiwit met PreScission. Analyse van Rec14-Zijn gebonden aan TALONkralen (na stap 7,1, laan 4) vergeleken met de eiwitten geëlueerd na GST zuiveringsstap (laan 2), blijkt dat een groot deel van Rec14-His is gebonden aan TALON kralen. Na enkele wasbeurten, werd Rec14-Zijn geëlueerd en verzameld. Drie eluties was uitgevoerd. De analyse toonde een hoge zuiverheid van Rec14-His (geen contaminant zichtbaar door Coomassie kleuring, lanen 5 tot 7), en de grootste concentratie van Rec14-His in de eerste elutie. Vergelijking van geëlueerde fracties (lanen 5 tot 7) de TALON korrels na elutie (laan 8) illustreert de doeltreffendheid van de elutie, omdat slechts weinig Rec14-His worden gedetecteerd als gebonden aan kralen.

Monsters in figuur 3B werden onderworpen aan Western blot analyse met anti-GST en anti-His-antilichamen om Rec14 volgen gedurende de procedure (figuur 3C). De anti-GST blot toont aan dat sommige GST-Rec14 en GST alleen, in de geëlueerde eiwitten van GST zuiveringsstap (laan 2) waren, en eop verontreinigingen werden verwijderd door de His-tag affiniteitszuiveringsfase. Deze vlek laat ons ook om te controleren of GST was efficiënt verwijderd uit Rec14 door de PreScission behandeling en de His-tag zuiveringsstap (lanen 4-8). De anti-Zijn vlek is gericht op te sporen Rec14. We kunnen dus bevestigen dat GST-Rec14-His-His en Rec14 niet volledig gesplitst en uit de GST korrels (laan 11). Bovendien, in een hoge concentratie, Rec14 lijkt te aggregeren (laan 13). Samengevat, de gepresenteerde resultaten tonen de doeltreffendheid van de GST-His zuivering voor de zuivering van S. pombe Rec14.

Figuur 1
Figuur 1. Schematisch overzicht van de GST-Zijn twee-staps affiniteit zuiveringsmethode. A. GST-Rec14-His construct gekloond in pFastBac (Baculovir. us expressie vector) B. Two-step affiniteit zuivering van GST-Rec14-Zijn van Sf9 oplosbare cellysaat:. GST-binding, gevolgd door PreScission splitsing van de GST,-Talon binding en elutie met imidazol Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2
Figuur 2. Schematische weergave van pFastBac 1-GST-10xHis. GST (groen), PreScission proteaselocatie (lichtblauw), de multikloneringsplaats (rood), en de 10-His tag (donker blauw) worden getoond. In kleine letters zijn de nucleotide sequenties afkomstig van pET-52b (+). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

together.within-page = "altijd"> Figuur 3
Figuur 3. Voorbeeldige resultaat van GST-Zijn zuivering van Rec14. A. Coomassie kleuring van de totale eiwitfractie (laan 2 & 3) en oplosbare cellysaat (baan 4 en 5) van pseudo-behandelde Sf9-cellen (laan 2 en 4) of geïnfecteerd met GST-Rec14-His baculovirus (laan 3 en 5). Rec14-His en GST bezitten een molecuulgewicht van ongeveer 32,9 kDa en 29 kDa, en het GST-Rec14 His-fusie-eiwit een molecuulgewicht van ongeveer 61,9 kDa. B. Coomassie kleuring tonen elke stap van eiwitzuivering methode ( sturen zie werkwijze) C. Western blot van de fracties volgens de zuiveringsprocedure met anti-GST (baan 1 tot 8) en anti-His (laan 9 tot 16) antilichamen.upload/50320/50320fig3large.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De GST-His zuiveringsprotocol hier gepresenteerde geschikt voor de zuivering van een breed gebied van afmetingen van recombinant eiwit: We succesvol gezuiverd Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), en een instabiele hoog molecuulgewicht eiwit Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Bovendien, de eiwitten gezuiverd met dit protocol waren biochemisch actief 6. Het succes van deze werkwijze hangt uitsluitend af van de expressie, oplosbaarheid en stabiliteit van het gewenste eiwit.

Moleculaire biologie vectoren voor expressie in andere gastheren, zoals E. coli of gist, kan gemakkelijk worden gewijzigd met de alom beschikbare GST en His-tags. Dit wijst op de toepasbaarheid en de kosteneffectiviteit van de huidige techniek voor de meeste moleculaire biologie laboratoria. Een verscheidenheid van voordelen beïnvloed onze beslissing om geïnfecteerde cellen te verkiezen boven bacteriële of zoogdiercellen voor recot eiwitexpressie en zuivering. Zo kunnen posttranslationele modificaties zoals methylatie, fosforylatie en ubiquitinylatie sterk beïnvloeden de enzymatische functie van een eiwit 10. Vandaar dat de fysiologische eigenschappen van een eiwit te bestuderen, is het gunstig om een ​​systeem dat zorgt voor posttranslationele modificatie, zoals Sf9 geïnfecteerde cellen gebruiken. Een ander voordeel van Sf9 dan zoogdiercellen, bijvoorbeeld, is economische aard, aangezien de geïnfecteerde cel systeem vereist aanzienlijk minder cellen en zonder dure transfectie methode in vergelijking met het zoogdiersysteem.

De eenvoud van de gepresenteerde methode zal onderzoekers helpen om een ​​eiwit of eiwitcomplex verkrijgen in een sterk gezuiverde vorm met standaard laboratoriumapparatuur, hetgeen voordelig is voor een lab met minimale apparatuur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Wij danken Anne-Marie Dion-Cote voor beraadslagingen die leiden tot de ontwikkeling van de methode. JK en RB zijn FQNRT doctorale geleerden, M.-MG is een Vanier CIHR geleerde, en J.-YM is een FRSQ senior onderzoeker. Dit werk werd ondersteund door fondsen van de Natural Sciences and Engineering Research Council om JY. M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
E.Coli DH10Bac (competent) Invitrogen
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen
Maxi Prep Kit Qiagen 12163 Solution I and II
Ultra Pure Bluo-Gal Gibco (Life) 15519028
IPTG Gibco (Life) 15529019
Sf9 infected cells ATCC CRL-1711
PreScission enzyme GE Healthcare 27084301
Grace's infected medium supplemented Gibco (Life) 11605-094
Fetal Bovine Serum characterized Hyclone SH30396.03
P/S (Penicillin-Streptomycin) Gibco (Life) 15070-063
Glutathione Sepharose resin GE bioscience 17075605
Protease inhibitor cocktail Roche 11873580001
Talon resin Clontech 635504
Imidazole BioShop 288324
Gentamicin Gibco (Life) 15710064
Polyclonal GST-antibody Production in house
Monoclonal 6X-His-antibody Clontech 631212
EQUIPMENT
Dounce homogenizer (tight) Wheaton 357546
Sonicator (Fisher dismembrator) Fisher Model 150
Dialysis bag (50 mm) Fisher Scientific 2115217

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
  2. Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL. Trends Genet. 12, 209-210 (1996).
  3. Carr, S., et al. Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems. Vaccine. 18, 153-159 (1999).
  4. Armisen, P., et al. Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports. J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).
  5. Kuhn, S., Zipfel, P. F. The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins. Gene. 162, 225-229 (1995).
  6. Buisson, R., et al. Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).
  7. Filimonova, M. N., et al. Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism. Biochemistry. 62, 983-988 (1997).
  8. Thorslund, T., et al. The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).
  9. Genois, M. M., et al. Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum. Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).
  10. Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression. Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics