המפרט של נוירונים glutamatergic Telencephalic מתאי גזע pluripotent אדם

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

הליך זה מניב נוירונים telencephalic על ידי עובר מחסומים שדומים לאלו שנצפו בהתפתחות האנושית. התאים מותרים באופן ספונטני כדי להבדיל, חשופים לגורמים שדוחפים אותם לכיוון השושלת העצבית, מבודדים, ומצופים על coverslips כדי לאפשר בידול מסוף והתבגרות.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (74), e50321, doi:10.3791/50321 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

כאן, הליך הדרגתי ליצירת נוירונים glutamatergic telencephalic מתאי גזע pluripotent אדם (PSCs) יעילות שתואר. תהליך הבידול הוא יזם על ידי שבירת PSCs האדם לתוך גושים שמכתרים את טופס אגרגטים כאשר התאים מוקם בתרבות השעיה. המצרפים אז הם גדלו במדיום hESC מימים 1-4 לאפשר לבידול ספונטני. במהלך תקופה זו, את התאים יש את היכולת להפוך כל אחת משלוש השכבות הניבטות. מימים 5-8, את התאים מוקם בהשראה עצבית בינוני לדחוק אותם לשושלת העצבית. סביב היום 8, התאים מותר לצרף אל 6 גם צלחות ולהבחין שבמהלך הזמן את צורת תאי neuroepithelial. תאים אלה neuroepithelial יכולים להיות מבודדים ביום 17. התאים לאחר מכן ניתן לשמור אותו כneurospheres עד שהם מוכנים להיות מצופים על coverslips. שימוש באמצעי בסיסי ללא כל גורמי caudalizing, תאי neuroepithelial הם specifieד למבשרי telencephalic, שאז יכול להיות מובחן יותר לתוך אבות telencephalic גב ונוירונים glutamatergic יעילות. בסך הכל, המערכת שלנו מספקת כלי ליצירת נוירונים glutamatergic אדם לחוקרים ללמוד פיתוח של הנוירונים האלה ואת המחלות שמשפיעות עליהם.

Introduction

תאי גזע pluripotent אדם (PSCs), כוללים שני תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע pluripotent מושרים (iPSCs), יש את היכולת לייצר כל סוג תא בגוף, כוללים תאי עצב 1-3. בידול מכוון של תת עצבי שונים מPSCs אדם מחזיק את המפתח ליישום של תאים אלה ברפואת רגנרטיבית. הדור של תת עצבי פונקציונלי במהלך פיתוח הוא תהליך מורכב כרוכים בגיוס של שושלת עצבית, מפרט של אבות אזוריים לאורך ציר rostro-הזנב, ובידול של סוגי תאי עצב לאחר mitotic מאבות 4.5 האזוריים. החל משנת 2001, מספר מערכות שהוקמו כדי ליצור שושלת עצבית מhESCs, שספק פלטפורמת לדור הבא של תת עצבי 6,7. בהתבסס על עקרונות התפתחותיים, סוגים שונים של תאי עצב מוטורי כגון תאי עצב שדרה 8-12, המוח התיכון DOPהנוירונים aminergic 13-15, ותאי רשתית עצבי 16,17 כבר צוינו ביעילות מPSCs אדם. הדבר נעשה על ידי יישום morphogens הקריטי חשובים למפרט של סוגי תאי עצב אלו במהלך התפתחות בגוף חייה. פרוטוקולים אחרים יש גם פותח כדי לקדם את הבידול של hESCs לנוירונים או באמצעות גורמים נוספים כגון 18-20 מולקולות קטנות או על ידי שיתוף culturing עם סוגי תאים אחרים כדי לעזור לקדם את הבידול 21.

הניאוקורטקס האנושי מפותח מאוד ומכיל סוגים רבים של תאים, כולל תאי עצב glutamatergic אשר משחקים תפקיד חשוב בלמידה, זיכרון ותפקוד הקוגניטיבי 22,23. הצעד הראשון ביצירת נוירונים glutamatergic בתרבות הוא לציין בתאים telencephalic. הקבוצה של Yoshiki Sasai דיווחה בידול המכוון של מבשרי telencephalic מעכבר ESCs (mESCs) באמצעות suspensio הסרום ראשון חינםתרבות n בנוכחות DKK1 (אשר מעכב איתות Wnt) כמו גם LeftyA (אשר מעכב קטרי איתות) 24. כתוצאה מכך, מספר קבוצות כולל זו שלנו גם דיווחו על המפרט של מבשרי telencephalic מPSCs אדם בללא בינוני 25-27 סרום. הדור של מבשרי telencephalic מPSCs אדם אינו דורש השימוש בmorphogens אקסוגניים והיעיל ביצירת המקדמים הללו הוא הרבה יותר גבוה מזה מmESCs 26,27. כאן, מערכת הגדרה כימית לזירוז עצבי שהוקם גם על ידי קבוצתו של ג'אנג 7 כבר תארה. ללא תוספת של גורמים אקסוגניים caudalizing, פרוטוקול זה יעיל מייצר מבשרי telencephalic מPSCs אדם 27. אבות אלה לאחר מכן ניתן מובחנים לאבות הגבו או גחון על ידי ויסות האיתות של Wnt וסוניק קיפוד (שש). את אבות הגב עוד יכולים להתמיין לתאי עצב דואר glutamatergicfficiently 27. בנוסף, פרוטוקול זה גם עובד היטב עבור הדור של נוירונים glutamatergic מ28 iPSCs האנושי, המאפשר לדור של נוירונים מטופל ספציפיים שיכול להיות מנוצל כדי לחקור את מנגנון הפעולה, כמו גם טיפולים פוטנציאליים למגוון רחב של מחלות . יתר על כן, המערכת שלנו מספקת גם פלטפורמה כדי לחקור את הפיתוח ואת המפרט של סוגים עצביים מגוונים בtelencephalon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הדור של מצרפי תאי גזע pluripotent אדם (D1-D4)

  1. תאי גזע pluripotent אדם מתורבתים בפיברובלסטים עובריים של עכבר מתקני האכלה (MEF) בנוכחות בינונית hESC בתוספת גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF, 4 ng / ml). לאחר 5-7 ימים בתרבות, כאשר המושבות גדולות אבל עדיין לא מובחנות, שהם מוכנים לצעד הבא.
  2. פתרון האנזים הראשון צריך להיות מוכן. בצינור מ"ל 50, לפזר dispase (או collagenase) בריכוז 1 מ"ג / מ"ל ​​לDMEM/F12 בינוני. מאז פתרונות אלה לערבב טובים ביותר כאשר חממו, הנח את הצינור המכיל את האנזים לבינוני ו° C אמבט מי 37 במשך 10-15 דקות ולאחר מכן לעקר אותו באמצעות מסנן Steriflip.
  3. לשאוב את המדיום מהתאים, לשטוף אותם עם DMEM/F12, ולשאוב את זה גם כן. הוסף 1 מ"ל של dispase לכל באר ומקום באינקובטור במשך 3-5 דקות לhESCs (עד 10 דקות לiPSCs). תראה את התאים תחת מיקרוסקופ; כשהקצוות להתכרבל מעט / נראים כהה קצת, התאים הם מוכנים לצעד הבא. זה הכי טוב כדי לבדוק את התאים לאחר 3 דקות ולהחזיר אותם במידת צורך. בעת שימוש בפרוטוקול זה בפעם הראשונה, עדיף להתחיל עם רק צלחת אחת של תאים בכל פעם שזה חשוב להסיר את התאים מdispase מהר ככל האפשר.
  4. לשאוב את dispase מהתאים. בעדינות (התאים פגיעים מאוד בשלב זה ויבואו את הצלחת בקלות יחסית) להוסיף 1.5 מ"ל של DMEM/F12 בינוני לכל גם כדי לשטוף את dispase. לשאוב את DMEM/F12 ולהוסיף 1.5 מ"ל של מדיום hESC לכל באר.
  5. כדי לנתק ולהפריד את התאים, הנח את קצה פיפטה 10 מיליליטר כוס לעבר הפינה הימנית התחתונה של היטב (לגעת בתאים) ולהעביר את פיפטה ולמטה (אנכי) - עליית סטוק צריך להיות בסמיכות לשבץ הירידה ימשיך. ברגע שהצד השני של גם הוא הגיע, לחזור בנואש אופקי ction.
  6. לאחר שכל התאים נמצאים בהשעיה, למקם אותם בצינורות 15 מ"ל וחובצה אותם ב 200 XG עבור 2 דקות. לא צריך להיות גלול של תאים בחלק התחתון של הצינור. לשאוב את המדיום מלמעלה גלולה.
  7. גודלו של בקבוק תרבית התאים שצריכים להיות מנוצל כדי לשמור המצרפים תלוי בכמות המקורית של תאים. במשך 6 בארות (צלחת 1) של hESCs, תרבות אחת לא התייחסה אל רקמת T75 בקבוקון עם 50 מ"ל של מדיום hESC צריך להיות מנוצל. העברת התאים מצעד 1.6 לבקבוק ולדגור על 37 ° C.
  8. על מנת להיפטר מפסולת התא, התא הבינוני והבקבוק יש להחליף כ 12 שעות מאוחר יותר. כדי לעשות זאת, הנח את כל התאים / הבינוניים לתוך צינור מ"ל 50, לסובב את התאים למטה (200 XG עבור 2 דקות), ולשאוב את המדיום הישן. לאחר מכן, להוסיף 50 מ"ל של מדיום hESC טרי לתאים והמקום לT75 בקבוק חדש. התאים אז יכולים להיות מוזנים יומי בעקבותיו הליך זה (עד יום 5).

ss = "jove_title"> 2. אינדוקציה של תאי Neuroepithelial (D5-D17)

  1. להעביר את התאים / הבינוני לצינור מ"ל 50, וחובצה את התאים עבור 2 דקות ב 200 x גרם. בשלב הבא, לשאוב את supernatant, ולהעביר את התאים ל( תרבות הלא רקמת מטופלים) החדשה T75 בקבוקון עם 50 מ"ל של מדיום השראה עצבי (נים).
  2. ברגע שהתאים הם בנים, מחצית הבינונית יש להחליף בכל יום אחר. המצרפים צריכים להיות גדולים מספיק כדי שבו הם ישקעו לתחתית צינור 50 מיליליטר חרוטים מעצמם לאחר כמה דקות (לא צנטריפוגה חובה). לאחר 2-3 ימים בנים (D7-D8 כולל), התאים צריכים להיות מוכנים לצלחת. Laminin או סרום שור עוברי (FBS) יכול להיות מנוצל כדי לעזור לתאים לצרף את הצלחות.
  3. מספר תרביות רקמה טופל 6 צלחות גם כי יש צורך תלוי הצפיפות של התאים כמו כל המצרפי צריך להיות מסוגל לגדול על הצלחת במשך כמה ימים נוספים בלי לגעת בכל אחד מהאחרים. בממוצע, לתאים מאחדT75 בקבוק יניב כ 04-06 יוני צלחות בשווי של תאים כן.
    1. אם אתם משתמשים בlaminin, לדלל אותו בנים ל10-20 מיקרוגרם / מ"ל ​​למעייל הצלחת 6-הטובה (~ 0.5 מ"ל / היטב). לאחר ציפוי במשך 2-3 שעות, אגרגטים תא לוח על גבי צלחות 6-כן (~ 20-30 אגרגטים לטובים). לאחר המצרפים צרפו, להוסיף 1.5 מ"ל של נים.
    2. אם אתם משתמשים בFBS, להכין תערובת של 90% ו 10% נים FBS (1.5 מ"ל / היטב). הוסף 1.5 מ"ל של מדיום עם תאים לכל היטב, בעדינות לנער את הצלחת קדימה ואחורה כדי לפזר את אגרגטים, ולאפשר לתאים לצרף O / N באינקובטור. הקפד להחליף הבינוני (2 מ"ל / היטב של נים) בבוקר שלמחרת כדי להסיר FBS.
  4. לאחר יום או ימים של להיות מצופה, בכל צבירה תפרוש כדי ליצור monolayer. בתוך כמה ימים, המרכזים ביותר של תאים אלה מופיעים מורפולוגית דומה לתאי columnar (מוארך). במהלך תקופה זו, לשנות את הנים בכל יום אחר. כמה קווי PSC (אספסיאלly iPSC), עלול להיוצר תאי columnar בצורה פחות יעיל. אם זה קורה, התוספת של BMP ומעכבי TGF (Dorsomorphin 29, 19 בSB431542 2 מיקרומטר) בשלב 2 יכולה להיות מועילה.
  5. סביב 14-17 ימים, תאי columnar יופיעו יותר קומפקטיים. לפעמים תאים אלה יוצרים רכסים או טבעות עם לומן גלוי בפנים. חוץ ממורפולוגיה העמודים, תאים בשלב זה להביע סמני neuroepithelial, כגון PAX6 וSOX1 12,26.
  6. לפני הבידוד יכול להתחיל, יש לבחון את התאים הראשונים כדי לקבוע אם יש נוכחיים בתאים שאינם neuroepithelial. סמן אובייקטיבי יכול להיות מנוצל כדי לציין את המושבות שאינן neuroepithelial. אלה אז יכולים להיות מסולקים על ידי גירוד אותם עם קצה פיפטה.

3. הדור של אבות Telencephalic (D17-D24)

  1. המרכזים של המושבות מכילים את תאי neuroepithelial, וצריכים להיות מבודדים משאר המושבה. ניתן לעשות זאת באמצעותmicropipette וטיפ סטרילי 1 מ"ל מסונן פיפטה. כאשר כמות קטנה של לחץ מוחלת על החלק המרכזי של המושבה, זה בדרך כלל מרים אותן די בקלות. היה זהיר לא לתת לחלק החיצוני של המושבה לנתק גם כן. אם המרכזים להיות עקשנים ולא יורד בעצמם, הם יכולים להסיר על ידי גוזמים אותם באמצעות מחט תחת מיקרוסקופ בברדס סטרילי. להעביר את חלקי המרכז של המושבות לצינור מ"ל 15 ולסובב ב 200 XG עבור 2 דקות.
  2. הבינוני צריך להישאף משל התאים. שתי צלחות בשווי של תאים ואז ניתן להעביר לתרבות הלא רקמה טופלה T25 בקבוקון המכיל 10 מ"ל של נים עם התוספת של B27 (ללא ויטמין A, 1:50). השתמש 5-10 מ"ל של מדיום לצלחת אחת של תאים.
  3. כאשר התאים נתפסים למחרת, הם צריכים מרחב כמו מראה. זה הכרחי כדי להעביר תאים אלה לתוך בקבוק חדש (בנוכחות הנים וB27, 1:50) כפי שהוא לעתים קרובות התאים ההיקפייםשמתגנב ולצרף לתחתית הבקבוק.
  4. Neurospheres צריך אז להיות מתורבת בהשעיה למשך שבוע באמצעות נים בתוספת B27 (1:50). על מנת לקדם את סיבולת תא וההתפשטות, מחזורי AMP (cAMP, 1 מיקרומטר), כמו גם אינסולין גורם גדילה (IGF1, 10 ng / ml) ניתן להוסיף למדיום בתרבות השעיה. בשלב זה, את neurospheres מכיל אבות telencephalic (FOXG1 +) והם מוכנים למצופים על coverslips לבידול מסוף.

4. הבחנה נוספת לנוירונים Telencephalic (D25 +)

    1. הכן את coverslips המצופה poly-ornithine/laminin (בצלחות 24 גם) לציפוי התאים. Coverslips מנוקה ראשון, ולאחר מכן הם מצופים תכסיס-ornithine (ברמה של 0.1 מ"ג / מ"ל, 37 ° C, O / N, ומאוחסן במקפיא).
      ציפוי Poly-ornithine:
      1. לעקר את coverslips: הנח את coverslips במבחנה המכילה חומצה חנקתית ועדינות לנער במנדף למשך שעה אחת. לשפוך את החומצה חנקתית, יש לשטוף מספר פעמים במי DI, ולהשאיר את coverslips תחת מים זורמים DI לפחות 15 דקות. הנח את coverslips באתנול 95% וגם ללחוץ למשך 30 דקות (אם משתמש באופן מיידי) או בחנות באתנול בRT.
      2. במכסת מנוע סטרילי, לשפוך את תכולת השפופרת המכילה 50 המ"ל coverslips המעוקר לתוך המכסה של צלחת 6-כן. השימוש במלקחיים מעוקרים, להרים coverslip אחד בכל פעם ולהזקיף באחת גם מצלחת 24 היטב. חזור על כך שכל יש גם coverslip.
      3. אחרי שהם יתייבשו לחלוטין, קש על הצלחות עד coverslips נפל שטוח בכל אחד גם. הבא להוסיף 100-ornithine פולי μl (0.1 מ"ג / מ"ל בד"ה סטרילי 2 O) לכל coverslip ודגירת צלחות O / N ב 37 ° C.
      4. למחרת, להסיר צלחות מן החממה ולאפשר להם להתקרר לRT. לשאוב פולי ornithine את כל coverslip (מקצה tהוא coverslip) לוודא שלא לגעת או לשרוט את coverslips בתהליך. לאפשר את coverslips להתייבש במשך כ 30 דקות לפני השטיפה.
      5. הוסף 1 המ"ל סטרילי DH 2 O לכל באר, תן לו לשבת 10 דקות, ולשאוב את המים מכל באר. חזור על לשטוף זה צעד עוד שתי פעמים. לאחר הצלחות להתייבש לגמרי, (חופשה מכסה את מכסה מנוע ב) למקם את המכסים על, מכסה ברדיד אלומיניום, ולאחסן ב -20 ° C.
      1. למעייל coverslips עם laminin, להוסיף 50 μl מתערובת של מדיום התמיינות עצבי וlaminin (ריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מ"ל) לכל coverslip טופל פולי ornithine להיות זהיר כדי לקבל את הנוזל נוגע coverslip עצמו (ולא רק לשפוך כבוי). דגירתם על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שעות לפני הכנת התאים לקובץ מצורף.
  1. האיסוף וסרכזת neurospheres ב 200 XG עבור 2 דקות בצינור מ"ל 15. לשאוב את supernatant.
  2. <li>
    1. יש לשטוף את התאים עם DMEM-F12 וחובצה את התאים שוב. אם neurospheres הם גדולים מדי כדי לצרף כראוי, הם יכולים להיות מנותקים עם Accutase בשלב זה.
    2. אם אתם משתמשים בAccutase: לאחר שטיפת התאים עם DMEM-F12, את neurospheres הם ניתק לקבוצות קטנות על ידי הוספת Accutase (~ 2 מ"ל) ודוגר את התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. לאחר מכן, להוסיף את אותה כמות של טריפסין מעכב (~ 2 מ"ל) וחובצה את התאים ב 200 XG ל3 דקות. התאים אמורים להיות מושעה מחדש אז בNDM ושבור באמצעות פיפטה P200. את האשכולות הקטנים אז יכולים להיות מצופים על coverslips מראש מצופה.
  3. לשאוב את רובו של המדיום ולמקם את התאים על צלחת פטרי 6 סנטימטר בכמה טיפין של המדיום, כך שבחירתם נעשית קלה יותר. הוסף כ 4-5 neurospheres לכל coverslip מראש מצופה. אין צורך לערב את laminin הראשון.
  4. בואו neurospheres לצרף לפחות 2-4 שעות. ברגע שיש להםttached היטב, יותר בינוני (0.5 מ"ל / coverslip) יש להוסיף. זה צריך להיות מורכב מבינוני עצבי בידול בתוספת B27 (1:50), מחנה (מיקרומטר 1), וגורמי neurotrophic (BDNF, GDNF, ו IGF, כל שעת 10 ng / ml). בשלב זה המחצית הבינונית ניתן לשנות בכל יום אחר והתאים האלה יכולים להישמר במשך מספר חודשים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הנה, בפרוטוקול כדי לבדל PSCs אדם לתוך הנוירונים glutamatergic telencephalic דרך כמה שלבים קריטיים: ההיווצרות של אגרגטים PSC, האינדוקציה של תאי neuroepithelial, הדור של אבות telencephalic, ובידול המסוף של אבות אלה לתוך תאי עצב telencephalic (איור 1) יש תואר. מערכת זו היא חזקה ויעילה בדור של אבות telencephalic ונוירונים glutamatergic. כדוגמה (איור 2), ללא תוספת של גורמי caudalizing, את hESCs היה מובחן לשושלת העצבית 27. בהודעת בידול ימים 24, רוב המבשרים עצביים היו חיוביים לFOXG1 (גורם שעתוק הביע telencephalon) אבל שליליים לHOXB4 (סמן למוח האחורי ותאי חוט שדרה) המצביע על אבות telencephalic נוצרו בהצלחה (האיור 2D). אבות telencephalic אלה p ossess פנוטיפ הגבה, כפי שצוין על ידי הביטוי של PAX6 (סמן שהביע אבות גב) (2E איור), אך לא NKX2.1 (סמן לאבות גחון) (האיור 2F). בעקבות הבחנה נוספת, אבות גב telencephalic אלה מובחנים לנוירונים glutamatergic, שהיו חיוביים עבור סמן TBR1 glutamatergic (סביב 80%) 27. נוירונים שמוכתמים חיובי לTBR1 היו גם חיוביים לסמני βIII-טובולין (האיור 2G) עצביים או חלבון microtubule הקשורים 2 (MAP2, איור 2H). תאים אלה גם הביעו טרנספורטר שלפוחי גלוטמט 1 (vGLUT1), סמן לנוירונים glutamatergic בוגרים, מה שמרמז על הדור היעיל של נוירונים glutamatergic telencephalic בתרבות (האיור ט 2).

highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50321/50321fig1.jpg "/>
איור 1. ציר זמן סכמטי לתהליך התמיינות תאי העצב.

איור 2
איור 2. תמונות הדגשת תאים במהלך מספר שלבים קריטיים במהלך התמיינות עצבית. () ESCs אדם היה בתרבית במשך 4 ימים. תמונות המראות את שלב ההיווצרות של אגרגטים ESC (B) ותאי neuroepithelial (ג). לאחר 24 ימים לאחר בידול מhESCs, רוב תאי NE היו FOXG1 + אבל HOXB4 - (ד). את אבות telencephalic (FOXG1 +) היו PAX6 + (E) אבל NKX2.1 - (F) לאחר חודש 1 של בידול. אחרי שתיים נוספיםשבועות (6 שבועות סה"כ) להבחנת התאים על coverslips, רובם מוכתמים חיוביים עבור סמן TBR1 glutamatergic (G, H), כמו גם את הסמנים העצביים βIII-טובולין (G) וMAP2 (H). לאחר שמונה שבועות של התמיינות, התאים היו חיוביים עבור סמן glutamatergic הבוגר, vGLUT1 (אני). ברי היקף: 100 מיקרומטר (A), 50 מיקרומטר (BI). (DI הותאם מהפרסום הקודם שלנו 27 ברשות).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ישנם מספר שלבים קריטיים בתהליך ההתמיינות העצבי. חשוב להבטיח שהאדם הוא PSCs pluripotent כי כבר עלולים להיות מוטים באופן אחר את התאים לקראת הפיכת שושלת שאינה עצבית. זה יכול להיות מאושר על ידי מכתים את PSCs האדם עם נוגדנים נגד סמני pluripotency כגון Oct4, Sox2, Nanog, וTra-1-60 1-3. אם PSCs האדם לא מייחס היטב אחרי passaging, מעכב ROCK (Y27632) ניתן להוסיף לעזרה. לאלו שיש קושי בשמירה על pluripotent התאים שלהם, כמה בעיות פוטנציאליות הן באיכות / צפיפות של תאי MEF, כמו גם הרבה KOSR בשימוש כמו שם יכול להיות וריאציה מ תצוו יצווה. למרות שתאי מזין MEF היו בשימוש כדי לשמור PSCs בפרוטוקול לעיל, שיטה זו פועלת גם לPSCs כי הם בתרבית באמצעות מערכות מזין חינם.

כאשר התאים נמצאים שבורים בצורת מצרפי PSC, חשוב לlimזה חשיפתם לdispase רק כמה דקות (הקצוות יהיו לעגל כלפי מעלה). משך הזמן שלוקח עד שהקצוות של iPSCs (עד 10 דקות) הוא בדרך כלל ארוכים יותר מזה של ESCs (3-5 דקות). התרחיש אופטימלי הוא להוסיף לdispase רק צלחת אחת PSCs אדם בכל פעם כדי לוודא שהתאים אינם באנזים במשך זמן רב מדי כמו זה יכול לפגוע או אפילו להרוג את התאים. לאחר שהתאים נמצאים בשלב צבירת PSC, חשוב לשמור על התאים בצפיפות נמוכה. הצפיפות היא גם די חשובה כאשר מצרפי PSC הם מצופים. תאים אלה ירחיבו על הצלחת בימים הקרובים, ויש לנקוט אמצעי זהירות כדי להבטיח שהם לא מוכנים לגעת אחרי שהם יגדלו. במהלך השלב המצורף (2.2), הוא הכרחי כדי להבטיח שהתאים אין לי חשיפה ממושכת לFBS כמו זה יכול להשפיע על ביטוי הגנים. לפני מבודד את תאי neuroepithelial, חשוב גם לגרד את האשכולות שאינם עצביים כדי להניב יותר טהוראוכלוסייה של תאים. אם אחד רוצה לאפיין אם התאים שלהם הולכים לשושלת העצבית, גורמים שונים יכולים להיות ביט כמו Pax6 או Sox1. Pax6 מדליק סביב היום 10 במהלך התמיינות עצבית, וSox1 סיבובים על ידי 2 שבועות לאחר התמיינות 12,26,30.

פרוטוקול זה הוא בחוד החנית של התמיינות עצבית כהוא משחזר שלבים רבים המתרחשים במהלך ההתפתחות של מערכת העצבים האנושית. ללא שימוש בגורמי caudalizing (חומצה רטינואית, הבסיסי FGF), תאי neuroepithelial יעילות להתמיין אבות telencephalic, המתלכד עם תאי neuroectoderm רכישת פנוטיפ המקורי הראשון במהלך בפיתוח vivo 31. אבות telencephalic ניחנו בפנוטיפ הגבה בשל איתות של Wnt אנדוגני שdorsalizes התאים 27. מערכת זו יוצרת אבות גב אז מה שיכול להיות עוד יותר מובחנת לתא glutamatergics. בעוד סוג התא הזה הוא מאוד חשוב, זה בהחלט לא סוג התא היחיד שמערכת זו היא מסוגלת ליצור. לדוגמה, תוספת של שישה הוכחה ventralize התאים, ומאפשר להם להתמיין לתאי GABAergic 27,32. הוא אפילו הראה כי הנוירונים האלה hESC נגזרים GABAergic ניתן להשתיל לעכברים, ושהם מסוגלים לתקן את הפגמים של תנועה עקב נגעים במוח 32. כי הפרוטוקול שהראה במאמר זה עובר דרך המחסומים בצעדים, הוא מציע כלי לייצור מגוון רחב של תאים במערכת העצבים האנושית שמוגבלת רק על ידי ההבנה של התפתחות והדמיון שלנו שלנו.

היכולת ליצור נוירונים אדם מPSCs פותחת מספר רב של דלתות הוא ממדע בסיסי, כמו גם פרספקטיבה קלינית. מקורות רקמות לאחר מוות מוגבלים והאיכות יכולה להשתנות, ואילו בידול PSC אדם מאפשר לחוקרים להניבהיצע מוגבל ועקבי של תאים לעבוד איתו. עם כניסתו של תא גזע pluripotent המושרה (iPSC) טכנולוגיה 1,3,33,34, עכשיו זה אפשרי להשיג תאי hESC דמויים מfibroblasts מטופל כולל אלה עם מחלות שונות 35-38. כפי שמוצג על ידי הקבוצה שלנו 28, כמו גם רבים האחרים, הדור המוצלח של נוירונים מiPSC היה וימשיך להיות כלי ייחודי ושימושי למי שבקשו זמן רב לאחר מודלים אנושיים למחלות ופיתוח. בנוסף, מספר קבוצות הראו כי הנוירונים PSC-derived יכולים מודל היבטים מסוימים של תהליך המחלה 36,37,39-42 ולכן יכולים להיות מנוצל כדי להקרין תרכובות טיפוליות 43. זה מעודד במיוחד משום שללא מערכת מודל טובה לבדיקת תרופות מועמדות למערכת העצבים המרכזית עם, רק 8% מהם הוכחו כיעיל קליני 44. עם זאת, שיטה ואחרים כמותו זה יכול לעזור לשפר באופן דרמטי ההוא מספר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לד"ר י Sasai למתן נוגדן FOXG1 בנדיבות. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר בתאי גזע קונטיקט (08-SCB-UCHC- 022 ו 11-SCB24) וקרן Paraplegia ספסטי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) Gibco 11330-032
Knockout Serum Replacer Gibco 10828-028
L-glutamine (200 mM) Gibco 25030
Non Essential Amino Acids Gibco 1140-050
2-Mercapt–thanol (14.3 M) Sigma M-7522
Neurobasal medium Gibco 21103-049
N2 Gibco 17502-048
B27 Gibco 12587-010
Heparin Sigma H3149
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine) Sigma 116K5103
Laminin (human) Sigma L-6274
Laminin (mouse) Invitrogen 23017-015
FBS Gemini 100-106
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A-7906
Dispase Gibco 17105-041
Collagenase Invitrogen 17104-019
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
ROCK Inhibitor Stemgent 04-0012
SB431542 Stemgent 04-0010
Dorsomorphin Stemgent 04-0024
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) Invitrogen 13256-029
Trypsin inhibitor Gibco 17075
0.1% gelatin Millipore ES-006-B
Foxg1 antibody Dr. Y. Sasai
Hoxb4 antibody (1:50) Developmental Studies Hybridoma Bank I12
Pax6 antibody (1:5000) Developmental Studies Hybridoma Bank PAX6
Nkx2.1 antibody (1:200) Chemicon MAB5460
Tbr1 antibody (1:2000) Chemicon AB9616
vGLUT1 antibody (1:100) Synaptic Systems 135302
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) PrepoTech Inc. 450-02
Glial derived neurotrophic factor (GDNF) PrepoTech Inc. 450-10
Insulin growth factor 1 (IGF1) PrepoTech Inc. 100-11
Cyclic AMP (cAMP) Sigma D-0260
Sonic hedgehog (SHH) R&D 1845-SH
50 ml tubes Becton Dickinson (BD) 352098
15 ml tubes BD 352097
6 well plates BD 353046
24 well plates BD 353047
T25 flasks (untreated) BD 353009
T75 flasks (untreated) BD 353133
Coverslips Chemiglass Life Sciences 1760-012
6 cm Petri dishes BD 353004
9'' glass pipetes Fisher 13-678-20D
Steriflip filters (0.22 μM) Millipore SCGP00525
Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM) Millipore SCGPU10RE
Phase contrast microscope (Observer A1) Zeiss R2625
Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150) Thermo Electron Corporation
Biosafety hood (Sterilgard III Advance) The Baker Company
Centrifuge (5702 R) Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., Tanabe, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  3. Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  4. Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes. Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).
  5. Wilson, S. I., Edlund, T. Neural induction: toward a unifying mechanism. Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).
  6. Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
  7. Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).
  8. Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).
  9. Singh Roy, N., Nakano, T., et al. Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells. Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).
  10. Lee, H., Shamy, G. A., et al. Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons. Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).
  11. Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).
  12. Li, X. J., Du, Z. W., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
  13. Perrier, A. L., Tabar, V., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).
  14. Roy, N. S., Cleren, C., et al. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).
  15. Yan, Y., Yang, D., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
  16. Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).
  17. Osakada, F., Ikeda, H., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
  18. Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells. Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).
  19. Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  20. Chambers, S. M., Qi, Y., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).
  21. Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
  22. Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. Patterning of the embryonic forebrain. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).
  23. Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus. Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).
  24. Watanabe, K., Kamiya, D., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  25. Watanabe, K., Ueno, M., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  26. Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  27. Li, X. J., Zhang, X., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136, 4055-4063 (2009).
  28. Zeng, H., Guo, M., et al. Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 5, e11853 (2010).
  29. Kim, D. S., Lee, J. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).
  30. Zhang, X., Huang, C. T., et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).
  31. Stern, C. D. Initial patterning of the central nervous system: how many organizers. Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).
  32. Ma, L., Hu, B., et al. Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice. Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).
  33. Li, W., Wei, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
  34. Lowry, W. E., Richter, L., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
  35. Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
  36. Ebert, A. D., Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  37. Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
  38. Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
  39. Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).
  40. Kiskinis, E., Eggan, K. Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).
  41. Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation. Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).
  42. Walsh, R. M., Hochedlinger, K. Modeling Rett syndrome with stem cells. Cell. 143, 499-500 (2010).
  43. Egawa, N., Kitaoka, S., et al. Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
  44. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates. Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics