Die Spezifikation der telencephalen glutamatergen Neuronen von menschlichen pluripotenten Stammzellen

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dieses Verfahren ergibt telencephalen Neuronen durch Durchlaufen Kontrollpunkten, die ähnlich wie beim menschlichen Entwicklung beobachtet werden, sind. Die Zellen werden dürfen spontan zu differenzieren, sind Faktoren, die beide gegenüber der neuronalen Abstammungslinie schieben ausgesetzt, werden isoliert, und werden auf Deckgläschen ausplattiert, um die terminale Differenzierung und Reifung zu ermöglichen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (74), e50321, doi:10.3791/50321 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hier hat sich ein schrittweises Vorgehen für die effiziente Erzeugung telencephalen glutamatergen Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen (PSCs) beschrieben worden. Die Unterscheidung wird durch Brechen der menschlichen PSCs zu Klumpen, die sich rund um Aggregate zu bilden, wenn die Zellen in einer Suspensionskultur platziert initiiert. Die Aggregate werden dann in hESC Medium aus den Tagen 1-4 gewachsen für spontane Differenzierung zu ermöglichen. Während dieser Zeit haben die Zellen die Fähigkeit, einem der drei Keimblätter werden. Von Tag 5-8, werden die Zellen in einem neuronalen Induktionsmedium platziert, um sie in das neuronale Linie zu drücken. Um Tag 8 werden die Zellen erlaubt, auf Platten mit 6 Vertiefungen befestigen und differenzieren während welcher Zeit die Neuroepithelzellen Form. Diese Neuroepithelzellen kann am Tag 17 isoliert werden. Die Zellen können dann als Neurosphären gehalten werden, bis sie bereit sind, auf Deckgläser plattiert werden. Verwendung eines basischen Medium ohne Faktoren caudalizing sind Neuroepithelzellen specified in telencephalen Vorstufen, die dann weiter in dorsale telencephalen Progenitoren und glutamatergen Neuronen effizient differenziert werden kann. Insgesamt bietet unserem System ein Werkzeug für die menschliche glutamatergen Neuronen für Forscher erzeugen, um die Entwicklung dieser Neuronen und der Krankheiten, die sie betreffen, zu studieren.

Introduction

Menschlichen pluripotenten Stammzellen (PSCs), einschließlich der beiden humanen embryonalen Stammzellen (hES) und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS), haben die Fähigkeit, jeden Zelltyp des Körpers, einschließlich Neuronen 1-3 generieren. Gerichteten Differenzierung verschiedener neuronaler Subtypen aus humanen PSCs hält den Schlüssel für die Anwendung dieser Zellen in der regenerativen Medizin. Die Erzeugung von funktionellen neuronalen Subtypen während der Entwicklung ist ein komplexer Prozess, der die Induktion der neuronale Linie, die Spezifikation des regionalen Progenitoren entlang der rostro-kaudalen Achse und die Differenzierung von post-mitotischen Neuronen Typen aus den regionalen Progenitoren 4,5. Beginnend im Jahr 2001 wurden mehrere Systeme eingerichtet, um neuronale Linie von hES-Zellen, die eine Plattform zur Verfügung gestellt haben für die nachfolgende Generation von neuronalen Subtypen 6,7 generieren. Basierend auf Entwicklungsprinzipien, mehrere Neuronen-Typen wie spinalen motorischen Neuronen 8-12, Mittelhirn dopaminerge Neuronen 13-15, und neuronale Zellen der Netzhaut 16,17 wurden effizient von Mensch PSCs angegeben. Dies wurde durch die Anwendung kritischen Morphogene, die wichtig sind für die Spezifikation von diesen Neuronen-Typen während in vivo Entwicklung getan. Andere Protokolle sind auch entwickelt worden, um die Differenzierung zu Neuronen hESCs Verwendung von entweder 18 bis 20 zusätzliche Faktoren wie kleine Moleküle oder durch Co-Kultivierung mit anderen Zelltypen, um Differenzierung fördern 21 fördern.

Die menschlichen Neokortex ist hoch entwickelt und enthält viele Zelltypen, einschließlich glutamatergen Neuronen, die eine wichtige Rolle beim Lernen, Gedächtnis und kognitive Funktion 22,23 spielen. Der erste Schritt beim Erzeugen glutamatergen Neuronen in Kultur zu telencephalen Vorläuferzellen angeben. Yoshiki Sasai der Gruppe erstmals über die gerichtete Differenzierung von Vorläufern von Maus telencephalen WSR (mESCs) unter Verwendung eines serumfreien suspension Kultur in Gegenwart DKK1 (was hemmt Wnt-Signalisierung) sowie LeftyA (die Signalisierung hemmt nodalen) 24. Anschließend wurden mehrere Gruppen einschließlich Siemens auch die Spezifikation telencephalen Vorstufen aus menschlichem PSCs in serumfreiem Medium 25-27 berichtet. Die Erzeugung von telencephalen Vorstufen aus menschlichem PSCs erfordert nicht die Verwendung von exogenen Morphogene und die Effizienz bei der Erzeugung dieser Vorstufen ist viel höher als die aus mESCs 26,27. Hier hat sich ein chemisch definiertes System zur Induktion neuronalen die gut an Zhangs Gruppe 7 wurde festgestellt, beschrieben worden. Ohne den Zusatz von exogenen caudalizing Faktoren, dieses Protokoll effizient generiert telencephalen Vorstufen aus menschlichen PSCs 27. Diese Vorläuferzellen können dann in dorsalen oder ventralen Vorläuferzellen durch die Regelung der Signalisierung von Wnt-und Sonic-Hedgehog (SHH) unterschieden werden. Die dorsalen Vorläuferzellen können weiter in glutamatergen Neuronen e unterscheidenfficiently 27. Zusätzlich dieses Protokoll funktioniert auch gut für die Erzeugung von glutamatergen Neuronen aus menschlichem IPSCs 28, die zur Erzeugung von patientenspezifischer Neuronen, die verwendet werden, um den Wirkungsmechanismus sowie mögliche Therapien für eine große Reihe von Krankheiten zu erforschen ueber ermöglicht . Außerdem ist unser System bietet auch eine Plattform für die Entwicklung und Spezifikation der verschiedenen neuronalen Typen im Telencephalon erkunden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ein. Generierung von humanen pluripotenten Stammzellen Aggregate (D1-D4)

  1. Menschlichen pluripotenten Stammzellen sind auf embryonale Maus-Fibroblasten (MEF) Abzweige in Gegenwart von HES-Medium mit basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, 4 ng / ml) kultiviert. Nach 5-7 Tagen in Kultur, wenn die Kolonien groß aber noch undifferenzierten sind, sind sie bereit für den nächsten Schritt.
  2. Das Enzym Lösung sollte zunächst vorbereitet werden. In einem 50 ml-Röhrchen, löst den Dispase (oder Collagenase) bei einer 1 mg / ml-Konzentration in DMEM/F12 Medium. Da diese Lösungen zu mischen besten, wenn erwärmt, das Reagenzglas mit dem Medium und Enzym in einer 37 ° C heißen Wasserbad für 10 bis 15 min und dann unter Verwendung eines sterilisieren Steriflip Filter.
  3. Absaugen das Medium aus den Zellen, spülen Sie sie mit DMEM/F12, und saugen diese ebenfalls ausgeschaltet werden. 1 ml Dispase in jede Vertiefung und in den Inkubator für 3-5 min für hESCs (bis zu 10 min für iPS). Schauen Sie sich die Zellen unter dem Mikroskop; wenndie Kanten zu wellen leicht / sehen ein bisschen dunkler, sind die Zellen bereit für den nächsten Schritt. Es ist am besten, um die Zellen nach 3 min zu überprüfen und setzen Sie sie wieder ein, wenn nötig. Bei Verwendung dieses Protokolls zum ersten Mal ist es empfehlenswert, mit nur einer Platte von Zellen zu einer Zeit zu starten, da es wichtig ist, die Zellen aus dem Dispase so schnell wie möglich zu entfernen.
  4. Absaugen die Dispase aus den Zellen. Gently (die Zellen sind sehr anfällig in dieser Phase und kommen weg von der Platte relativ leicht) 1,5 ml DMEM/F12-Medium in jede Vertiefung, um abspülen Dispase. Absaugen die DMEM/F12 und fügen Sie 1,5 ml hESC Medium in jede Vertiefung.
  5. Zu lösen und die Zellen aufzubrechen, legen Sie die Spitze einer 10 ml Glaspipette in Richtung der unteren rechten Ecke eines gut (Berührung der Zellen) und bewegen Sie die Pipette nach oben und unten (vertikal) - die oben stoke sollte in der Nähe sein, dem Verfahren Abwärtsbewegung. Sobald die andere Seite der Wanne erreicht ist, in der horizontalen erzei wiederholenktion.
  6. Sobald alle Zellen in Suspension sind, legen Sie sie in 15 ml-Tuben und zentrifugieren bei 200 xg für 2 min. Es sollte ein Pellet von Zellen am Boden des Röhrchens sein. Absaugen des Mediums über dem Pellet.
  7. Die Größe des Zellkulturkolben, die verwendet werden, um die Aggregate in zu halten sollte, hängt von der ursprünglichen Menge der Zellen. Für 6 Vertiefungen (1 Platte) von HES, behandelt ein nicht Gewebekultur T75-Flasche mit 50 ml hESC Medium sollte genutzt werden. Übertragen der Zellen aus Schritt 1.6 in den Kolben und Inkubieren bei 37 ° C.
  8. Um loszuwerden der Zelltrümmer, sollte das Zellmedium und Kolben etwa 12 Stunden später ersetzt werden. Um dies zu tun, legen Sie alle mittel / Zellen in einer 50 ml Tube, drehen Sie die Zellen nach unten (200 xg für 2 min) und absaugen das alte Medium. Als Nächstes fügen Sie 50 ml frisches hESC Medium zu den Zellen, und in einen neuen T75-Flasche. Die Zellen können dann täglich gemäß demselben Verfahren (bis Tag 5) zugeführt werden.

  1. Übertragung der Zellen / Medium auf eine 50 ml-Röhrchen, und zentrifugieren die Zellen für 2 min bei 200 x g beträgt. Weiter, absaugen des Überstandes und übertragen die Zellen zu einer neuen (non-Gewebekultur behandelt) T75-Flasche mit 50 ml neuralen Induktion Medium (NIM).
  2. Sobald die Zellen in NIM sind, sollte die Hälfte des Mediums jeden zweiten Tag ersetzt werden. Die Aggregate sollte groß genug werden, wo sie auf dem Boden eines 50 ml konischen Röhrchen auf eigene nach wenigen Minuten (keine Zentrifugation erforderlich) zu versenken. Nach 2-3 Tagen in NIM (D7-D8 insgesamt), sollten die Zellen bereit sein, auf die Platte. Laminin oder fötalem Rinderserum (FBS) verwendet werden, um zu helfen die Zellen an den Platten zu befestigen.
  3. Die Anzahl von Gewebekultur behandelten Platten mit 6 Vertiefungen, die benötigt werden, hängt von der Dichte der Zellen, wie jedes Aggregat Lage sein sollten, auf der Platte für mehrere Tage wachsen ohne Berührung eines der anderen. Im Durchschnitt sind die Zellen von einemT75-Kolben erbringt ca. 4-6 6 Well-Platten im Wert von Zellen.
    1. Bei der Verwendung von Laminin, verdünnen Sie es in NIM auf 10-20 pg / ml zu beschichten die 6-Well-Platte (~ 0,5 ml / well). Nach der Beschichtung für 2-3 Std., Platte Zellaggregate auf 6-Well-Platten (~ 20-30 Aggregate pro Well). Nachdem die Aggregate angeschlossen haben, fügen Sie 1,5 ml der NIM.
    2. Bei der Verwendung von FBS, bereiten eine Mischung aus 90% NIM und 10% FBS (1,5 ml / well). 1,5 ml Medium mit den Zellen in jede Vertiefung, schütteln die Platte hin und her, um sich auszubreiten die Aggregate, und damit die Zellen O / N in einem Inkubator zu befestigen. Achten Sie darauf, das Medium (2 ml / Vertiefung NIM) ändern am nächsten Morgen die FBS zu entfernen.
  4. Nach einem Tag oder zwei ist vernickelt, wird jedes Aggregat verteilen, um eine Monoschicht bilden. Innerhalb von ein paar Tagen werden die Zentren der meisten dieser Zellen morphologisch ähnlich aussehen Cylinderzellen (längliche). Während dieser Zeit, ändern Sie den NIM jeden zweiten Tag. Einige PSC Linien (besondersly IPSC) können säulenförmige Zellen weniger effizient zu bilden. Wenn dies geschieht, kann die Zugabe von BMP-und TGF-Inhibitoren (Dorsomorphin 29, SB431542 19 bei 2 uM) während Stufe 2 hilfreich sein.
  5. Rund Tag 14-17, wird die säulenförmigen Zellen erscheinen kompakter. Manchmal sind diese Zellen bilden Stege oder Ringe mit sichtbarem Lumen im Inneren. Neben der säulenartigen Morphologie, exprimieren Zellen in diesem Stadium neuroepithelialen Marker wie PAX6 und SOX1 12,26.
  6. Bevor die Isolierung beginnen kann, muss man zunächst die Zellen, um zu bestimmen, ob es irgendwelche nicht-Neuroepithelzellen vorhanden sind. Eine objektive Marker kann verwendet werden, um die nicht-neuroepithelialen Kolonien anzuzeigen. Diese können dann durch Kratzen sie mit einem Pipettenspitze beseitigt werden.

3. Generation telencephalen Vorläufer (D17-D24)

  1. Die Zentren der Kolonien enthalten Neuroepithelzellen, und sollte aus dem Rest der Kolonie isoliert werden. Dies kann unter Verwendung werdeneiner Mikropipette und eine sterile 1 ml gefiltert Pipettenspitze. Wenn eine kleine Menge an Druck auf den mittleren Abschnitt der Kolonie aufgebracht wird, es in der Regel relativ leicht abhebt. Seien Sie vorsichtig, um sich nicht den äußeren Teil der Kolonie sowie lösen. Wenn die Center agieren stur und wird nicht kommen, sich auf ihre eigenen, können sie durch Herausschneiden sie mit einer Nadel unter dem Mikroskop in einem sterilen Haube entfernt werden. Übertragen Sie die mittleren Abschnitte der Kolonien zu einem 15-ml-Tube und Spin bei 200 xg für 2 min.
  2. Das Medium sollte aus der Zellen abgesaugt werden. Zwei Platten Wert von Zellen können dann zu einem nicht-Gewebekultur übertragen behandelt T25-Flasche, die 10 ml NIM unter Zusatz von B27 (ohne Vitamin A, 1:50). Verwenden 5-10 ml Medium pro Platte von Zellen.
  3. Wenn die Zellen angesehen werden am nächsten Tag, sollten sie über eine Sphäre Aussehen. Es ist notwendig, diese Zellen in eine neue Flasche (in Gegenwart von NIM und B27, 1:50) zu übertragen, da sie oft die peripheren Zellendie in schleichen und heften sich an der Unterseite der Flasche.
  4. Die Neurosphären sollte dann in Suspension für eine Woche mit NIM mit B27 (1:50) ergänzt kultiviert werden. Um Zelle Ausdauer zu fördern und die Proliferation, cyclische AMP (cAMP, 1 pM) sowie Insulin-Wachstumsfaktor (IGF-1, 10 ng / ml) in das Medium während Suspensionskultur zugesetzt werden. An dieser Stelle enthalten die Neurospheres telencephalen Progenitoren (FOXG1 +) und sind bereit, auf Deckgläschen für terminale Differenzierung plattiert werden.

4. Eine weitere Differenzierung in die telencephalen Neuronen (D25 +)

    1. Bereiten Sie die poly-ornithine/laminin beschichtete Deckgläser (im 24-Well-Platten) zum Plattieren der Zellen. Deckgläser werden zuerst gereinigt und dann mit Trick-Ornithin beschichtet (mit 0,1 mg / ml, 37 ° C, O / N, und in dem Tiefkühler).
      Poly-Ornithin Beschichtung:
      1. Sterilisieren Sie die Deckgläser: Legen Sie die Deckgläser in einerBecherglas mit Salpetersäure und sanft in die Abzugshaube schütteln für eine Stunde. Gießen Sie das Salpetersäure, spülen Sie mehrmals mit DI-Wasser, und lassen Sie die Deckgläser unter fließendem DI-Wasser für mindestens 15 min. Legen Sie die Deckgläschen in 95% Ethanol und entweder für 30 min (bei Verwendung sofort) oder speichern in Ethanol bei RT schütteln.
      2. In einer sterilen Haube, gieße den Inhalt der 50 ml Tube mit sterilisiert Deckgläser in den Deckel einer 6-Well-Platte. Mit sterilisiert Pinzette, abholen ein Deckglas zu einer Zeit und aufgerichtet in einem Well einer 24-Well-Platte. Wiederholen, so dass jeder auch ein Deckglas hat.
      3. Nachdem sie vollständig trocknen, tippen Sie auf die Platten bis Deckgläser gefallen Wohnung in jede Vertiefung. Weiter werden 100 ul Poly-Ornithin (0,1 mg / ml in sterilem dH 2 O) zu jedem Deckglas und bebrüten die Platten O / N bei 37 ° C.
      4. Am nächsten Tag, entfernen Platten aus dem Inkubator und ihnen erlauben, auf RT abkühlen. Anzusaugen Poly-Ornithin off jedes Deckglas (von der Kante des ter Deckglas) darf dabei nicht berührt oder zerkratzt werden die Deckgläser in den Prozess. Lassen Sie die Deckgläser für ca. 30 min vor dem Waschen zu trocknen.
      5. 1 ml sterile dH 2 O in jede Vertiefung, lassen Sie sich für 10 min, und saugen das Wasser aus jeder Vertiefung. Wiederholen Sie dies Waschschritt zwei weitere Male. Nachdem die Platten vollständig trocknen, (Urlaub deckt off in der Haube) legen Sie den Deckel auf, mit Alufolie abdecken und bei -20 ° C.
      1. Zur Beschichtung der Deckgläser mit Laminin, fügen Sie 50 ul einer Mischung aus neuronalen Differenzierungsmedium und Laminin (Endkonzentration von 20 ug / ml) zu jedem Poly-Ornithin behandelt Deckglas darauf achten, nur die Flüssigkeit berührt das Deckglas selbst (und nicht verschüttet Aus). Inkubieren bei 37 ° C für 1-2 Stunden vor der Herstellung der Zellen zur Befestigung.
  1. Sammeln und zentrifugieren Neurosphären bei 200 xg für 2 min in einem 15-ml-Tube. Absaugen des Überstandes.
  2. <li>
    1. Spülen Sie die Zellen mit DMEM-F12 und zentrifugieren Sie die Zellen wieder. Wenn die Neurospheres zu groß, um richtig zu befestigen sind, können sie dissoziiert werden mit Accutase bei diesem Schritt.
    2. Bei Verwendung Accutase: Nach Waschen der Zellen mit DMEM-F12 sind die Neurospheres dissoziiert kleine Cluster durch Zugabe Accutase (~ 2 ml) und Inkubation der Zellen bei 37 ° C für 3 min. Anschließend fügen die gleiche Menge an Trypsininhibitor (~ 2 ml) und die Zellen zentrifugieren bei 200 × g für 3 min. Die Zellen sollten dann in NDM resuspendiert werden und gebrochen Verwendung eines P200 Pipette. Die kleinen Clustern kann dann auf vorbeschichteten Deckgläschen plattiert werden.
  3. Absaugen den Großteil des Mediums und platzieren der Zellen auf einer 6 cm Petrischale in einigen Tropfen des Mediums, so daß sie auswählen wird einfacher. Fügen Sie ca. 4-5 Neurosphären jedem vorbeschichtete Deckglas. Es besteht keine Notwendigkeit, die Laminin absaugen zuerst.
  4. Lassen Sie die Neurosphären für mindestens 2-4 Stunden zu befestigen. Einmal haben sie einettached gut, sollte mehr Medium (0,5 ml / Deckglas) hinzugefügt werden. Es sollte von neuralen Differenzierungsmedium mit B27 (1:50) ergänzt, cAMP (1 uM) und neurotrophen Faktoren (BDNF, GDNF, und IGF, die alle bei 10 ng / ml) bestehen. An diesem Punkt die Hälfte des Mediums kann jeden zweiten Tag gewechselt werden und diese Zellen können mehrere Monate aufrechterhalten werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hier, um ein Protokoll menschlichen PSCs in telencephalen glutamatergen Neuronen differenzieren durch mehrere kritische Schritte: die Bildung von Aggregaten PSC weist die Induktion von Neuroepithelzellen, die Erzeugung von telencephalen Progenitoren und die terminale Differenzierung von Vorläuferzellen in diesen telencephalen Neuronen (Abbildung 1) beschrieben worden. Dieses System ist robust und effizient bei der Erzeugung von telencephalen Progenitoren und glutamatergen Neuronen. Als ein Beispiel (Abbildung 2), ohne Zugabe von caudalizing Faktoren wurden die HES in das neuronale Linie 27 differenziert. Auf 24 Tage nach Differenzierung, war die Mehrheit der neuralen Vorläuferzellen positiv für FOXG1 (a Transkriptionsfaktors durch Telencephalon ausgedrückt), aber negativ für HOXB4 (ein Marker für Hinterhirn und Rückenmark-Zellen), was die telencephalen Vorfahren erfolgreich generiert wurden (Abb. 2D). Diese telencephalen Vorläufer p ossess eine dorsale Phänotyp, wie durch die Expression von PAX6 (ein Marker durch dorsalen Vorläuferzellen exprimiert) (2E) angedeutet, aber nicht NKX2.1 (ein Marker für ventralen Vorläuferzellen) (2F). Nach weiteren Differenzierung, diese telencephalen dorsalen Vorläuferzellen in glutamatergen Neuronen, was positiv für die glutamatergen Marker TBR1 (rund 80%) 27 wurden differenziert. Neuronen, die positiv für TBR1 angefärbt waren ebenfalls positiv für neuronalen Marker βIII-Tubulin (2G) oder Mikrotubulus-assoziiertes Protein 2 (MAP2, 2H). Diese Zellen äußerte auch vesikulären Glutamat-Transporter 1 (VGLUT1), ein Marker für reife glutamatergen Neuronen, was die effiziente Erzeugung von telencephalen glutamatergen Neuronen in der Kultur (Abb. 2I).

highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50321/50321fig1.jpg "/>
Abbildung 1. Eine schematische Zeitplan für die neuronale Differenzierung.

Abbildung 2
Abbildung 2. Bilder Hervorhebung Zellen während mehreren kritischen Phasen während der neuronalen Differenzierung. (A) Human WSR wurden für 4 Tage kultiviert. Phase Bildern, die die Bildung von ESC Aggregate (B) und Neuroepithelzellen (C). Nach 24 Tagen nach Differenzierung von hES-Zellen, war die Mehrheit der NE-Zellen FOXG1 + aber HOXB4 - (D). Die telencephalen Vorläuferzellen (FOXG1 +) waren PAX6 + (E), aber NKX2.1 - (F) nach 1 Monat der Differenzierung. Nach zwei zusätzlichenWochen (6 Wochen insgesamt) der Differenzierung der Zellen auf den Deckgläschen, angefärbt meisten positiven Marker für die glutamaterge TBR1 (G, H) sowie den neuronalen Marker βIII-Tubulin (G) und MAP2 (H). Nach acht Wochen der Differenzierung wurden die Zellen positiv für das reife glutamatergen Marker, VGLUT1 (I). Maßstabsbalken: 100 um (A), 50 um (BI). (DI haben aus unseren früheren Veröffentlichung 27 mit Genehmigung angepasst).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Es gibt mehrere wichtige Schritte während der neuronalen Differenzierung. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die menschlichen pluripotenten PSCs sind, weil ansonsten die Zellen können bereits auf dem Weg zu einem nicht-neuronalen Abstammungslinie vorgespannt werden. Dies kann durch Anfärben der menschlichen PSCs mit Antikörpern gegen Pluripotenz Marker wie Oct4, Sox2, Nanog und Tra-1-60 1-3 bestätigt werden. Wenn die Menschen PSCs nicht sehr gut anbringen müssen nach Passagierung ihnen können ROCK-Inhibitor (Y27632) hinzugefügt, um zu helfen. Für diejenigen, die Schwierigkeiten mit der Führung ihre Zellen pluripotent sind einige potenzielle Probleme die Qualität / Dichte der MEF-Zellen, sowie die Menge KOSR verwendet, da Variation sein kann von Charge zu Charge. Obwohl MEF Feeder-Zellen verwendet wurden, um PSCs in dem obigen Protokoll halten, diese Methode funktioniert auch für PSCs, die kultiviert mit Feeder-freie Systeme.

Wenn die Zellen werden bis zu den PSC Aggregate bilden gebrochen, ist es wichtig, limes ihr Dispase Exposition nur ein paar Minuten (die Kanten abrunden). Die Länge der Zeit, dass sie vor die Ränder der IPSCs (bis 10 min) in der Regel länger als die von den WSR (3-5 min) führt. Es ist optimal, um die Dispase nur eine Platte des menschlichen PSCs hinzuzufügen zu einer Zeit, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht in dem Enzym zu lange, da dies zu schädigen oder zu töten die Zellen. Nachdem die Zellen in dem PSC Aggregat Stufe sind, ist es wichtig, um die Zellen mit einer niedrigen Dichte zu halten. Die Dichte ist auch sehr wichtig, wenn die Aggregate PSC plattierten sind. Diese Zellen werden auf der Platte in den nächsten Tagen zu erweitern und Vorkehrungen zu treffen, um sicherzustellen, dass sie nicht berühren, nachdem sie größer wachsen. Während der Befestigung der Schritt (2.2), ist es unerlässlich, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht über eine längere Zeit der FBS, da dies die Genexpression beeinflussen können. Vor Isolation der Neuroepithelzellen ist es auch wichtig, abkratzen die nicht-neuronalen Clustern, um eine reinere nachgebenPopulation von Zellen. Sollte ein zu charakterisieren, ob ihre Zellen in den neuronalen Linie gesucht werde, können verschiedene Faktoren wie Pax6 oder SOX1 nachgeschlagen werden. Pax6 schaltet um Tag 10 während der neuronalen Differenzierung und SOX1 schaltet von 2 Wochen nach der Differenzierung 12,26,30.

Dieses Protokoll ist an der Spitze der neuronalen Differenzierung, wie sie rekapituliert viele Schritte, die stattfinden, während der Entwicklung des menschlichen Nervensystems. Ohne die Verwendung von Faktoren caudalizing (Retinsäure, basisches FGF), Neuroepithelzellen effizient in telencephalen Progenitoren, die mit Neuroektoderms Zellen zuerst Erfassen eines rostralen Phänotyp während der in vivo Entwicklung 31 zusammenfällt differenzieren. Diese telencephalen Vorläuferzellen besitzen einen dorsalen Phänotyp auf endogenes Wnt-Signalweg, die die Zellen dorsalizes 27. Dieses System erzeugt dorsalen Vorläuferzellen, die dann weiter differenziert werden in glutamatergen Zelles. Während dieser Zelltyp ist sehr wichtig, ist es keineswegs die einzige Zelltyp, dass dieses System bilden kann, ist, bedeutet. Zum Beispiel hat sich die Zugabe von SHH gezeigt worden, um die Zellen ventralize, so dass sie in GABAergen Zellen differenzieren 27,32. Es wurde sogar gezeigt, dass diese hESC abgeleitet GABAergen Neuronen in Mäuse transplantiert werden, und dass sie in der Lage sind Bewegungsapparates Defekte durch Hirnläsionen 32 zu korrigieren. Da das Protokoll, das in diesem Artikel gezeigt wird, geht durch die stufenweise Checkpoints, bietet es ein Werkzeug, um eine breite Palette von Zellen innerhalb des menschlichen Nervensystems, die nur durch unser Verständnis der Entwicklung und unsere Vorstellungskraft begrenzt produzieren.

Die Fähigkeit, menschliche Neuronen aus PSCs bilden öffnet eine Vielzahl von Türen sowohl in der Grundlagenforschung als auch der klinischen Perspektive. Postmortem Gewebequellen sind begrenzt und die Qualität variieren kann, während menschliche PSC Differenzierung ermöglicht es den Forschern einer Ausbeuteunbegrenzt und gleichmäßige Versorgung der Zellen mit zu arbeiten. Mit dem Aufkommen der induzierten pluripotenten Stammzelle (iPSC) Technologie 1,3,33,34, ist es nun möglich, HES-ähnliche Zellen aus Fibroblasten Patienten einschließlich solcher mit verschiedenen Krankheiten 35-38 erhalten. Wie von unserer Gruppe 28 sowie viele andere gezeigt, hat die erfolgreiche Generierung von Neuronen aus iPSC gewesen und wird auch weiterhin ein einzigartiges und nützliches Werkzeug für diejenigen, die lange nach dem menschliche Modelle für Krankheiten und Entwicklung haben gesucht werden. Außerdem haben mehrere Gruppen gezeigt, dass PSC-derived Neuronen können bestimmte Aspekte des Krankheitsverlaufs 36,37,39-42 modellieren und können daher verwendet werden, um Verbindungen 43 zu screenen therapeutischen werden. Dies ist besonders ermutigend, da ohne eine gute Modellsystem, um Wirkstoffkandidaten für das zentrale Nervensystem mit testen, nur etwa 8% von ihnen wurde gezeigt, als klinisch wirksam 44. Allerdings könnte diese Methode und andere wie sie helfen, drastisch zu verbessern thZahl ist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Acknowledgements

Die Autoren bedanken sich bei Dr. Y. Sasai für die großzügige Bereitstellung der FOXG1 Antikörper danken. Diese Arbeit wurde von Connecticut Stem Cell Research Grants (08-SCB-UCHC- 022 und 11-SCB24) und spastische Paraplegie Foundation unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) Gibco 11330-032
Knockout Serum Replacer Gibco 10828-028
L-glutamine (200 mM) Gibco 25030
Non Essential Amino Acids Gibco 1140-050
2-Mercapt–thanol (14.3 M) Sigma M-7522
Neurobasal medium Gibco 21103-049
N2 Gibco 17502-048
B27 Gibco 12587-010
Heparin Sigma H3149
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine) Sigma 116K5103
Laminin (human) Sigma L-6274
Laminin (mouse) Invitrogen 23017-015
FBS Gemini 100-106
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A-7906
Dispase Gibco 17105-041
Collagenase Invitrogen 17104-019
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
ROCK Inhibitor Stemgent 04-0012
SB431542 Stemgent 04-0010
Dorsomorphin Stemgent 04-0024
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) Invitrogen 13256-029
Trypsin inhibitor Gibco 17075
0.1% gelatin Millipore ES-006-B
Foxg1 antibody Dr. Y. Sasai
Hoxb4 antibody (1:50) Developmental Studies Hybridoma Bank I12
Pax6 antibody (1:5000) Developmental Studies Hybridoma Bank PAX6
Nkx2.1 antibody (1:200) Chemicon MAB5460
Tbr1 antibody (1:2000) Chemicon AB9616
vGLUT1 antibody (1:100) Synaptic Systems 135302
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) PrepoTech Inc. 450-02
Glial derived neurotrophic factor (GDNF) PrepoTech Inc. 450-10
Insulin growth factor 1 (IGF1) PrepoTech Inc. 100-11
Cyclic AMP (cAMP) Sigma D-0260
Sonic hedgehog (SHH) R&D 1845-SH
50 ml tubes Becton Dickinson (BD) 352098
15 ml tubes BD 352097
6 well plates BD 353046
24 well plates BD 353047
T25 flasks (untreated) BD 353009
T75 flasks (untreated) BD 353133
Coverslips Chemiglass Life Sciences 1760-012
6 cm Petri dishes BD 353004
9'' glass pipetes Fisher 13-678-20D
Steriflip filters (0.22 μM) Millipore SCGP00525
Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM) Millipore SCGPU10RE
Phase contrast microscope (Observer A1) Zeiss R2625
Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150) Thermo Electron Corporation
Biosafety hood (Sterilgard III Advance) The Baker Company
Centrifuge (5702 R) Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., Tanabe, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  3. Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  4. Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes. Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).
  5. Wilson, S. I., Edlund, T. Neural induction: toward a unifying mechanism. Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).
  6. Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
  7. Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).
  8. Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).
  9. Singh Roy, N., Nakano, T., et al. Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells. Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).
  10. Lee, H., Shamy, G. A., et al. Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons. Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).
  11. Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).
  12. Li, X. J., Du, Z. W., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
  13. Perrier, A. L., Tabar, V., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).
  14. Roy, N. S., Cleren, C., et al. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).
  15. Yan, Y., Yang, D., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
  16. Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).
  17. Osakada, F., Ikeda, H., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
  18. Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells. Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).
  19. Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  20. Chambers, S. M., Qi, Y., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).
  21. Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
  22. Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. Patterning of the embryonic forebrain. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).
  23. Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus. Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).
  24. Watanabe, K., Kamiya, D., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  25. Watanabe, K., Ueno, M., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  26. Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  27. Li, X. J., Zhang, X., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136, 4055-4063 (2009).
  28. Zeng, H., Guo, M., et al. Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 5, e11853 (2010).
  29. Kim, D. S., Lee, J. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).
  30. Zhang, X., Huang, C. T., et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).
  31. Stern, C. D. Initial patterning of the central nervous system: how many organizers. Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).
  32. Ma, L., Hu, B., et al. Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice. Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).
  33. Li, W., Wei, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
  34. Lowry, W. E., Richter, L., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
  35. Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
  36. Ebert, A. D., Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  37. Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
  38. Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
  39. Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).
  40. Kiskinis, E., Eggan, K. Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).
  41. Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation. Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).
  42. Walsh, R. M., Hochedlinger, K. Modeling Rett syndrome with stem cells. Cell. 143, 499-500 (2010).
  43. Egawa, N., Kitaoka, S., et al. Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
  44. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates. Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics