Fabricação de chips microfluídicos e método para detectar a gripe

Bioengineering

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Summary

Um chip microfluídico integrado termoplástico tem sido desenvolvido para utilização como um diagnóstico molecular. O chip realiza a extracção dos ácidos nucleicos, a transcriptase reversa, e PCR. Os métodos para fabricar e executando o chip encontram-se descritos.

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Cao, Q., Fan, A., Klapperich, C. Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza. J. Vis. Exp. (73), e50325, doi:10.3791/50325 (2013).

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Abstract

Diagnóstico rápidos e eficazes têm um papel importante no controle de doenças infecciosas, permitindo que a gestão do paciente e tratamento eficazes. Aqui, apresentamos um chip microfluídico integrado termoplástico com a capacidade de amplificar vírus influenza A em paciente nasofaringe (NP), esfregaços e aspirados. Durante o carregamento da amostra do paciente, o dispositivo micro sequencialmente realiza on-chip a lise das células, purificação e concentração de RNA dentro da extracção em fase sólida (SPE), a transcrição reversa (RT) e de reacção em cadeia da polimerase (PCR), em câmaras de RT-PCR, respectivamente. Detecção do ponto final é realizada usando um Bioanalyzer off-chip (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Para os periféricos, utilizou-se uma bomba de seringa para dirigir reagentes e amostras, ao passo que dois aquecedores de película fina foram utilizadas como fontes de calor para a temperatura ambiente e as câmaras de PCR. O chip é desenhado para ser de camada única e adequado para o fabrico de elevado rendimento para reduzir o Fabricatiem tempo e custo. O chip microfluídico proporciona uma plataforma para analisar uma grande variedade de vírus e bactérias, limitado apenas pelas mudanças na concepção reagente necessários para detectar novos agentes patogénicos de interesse.

Introduction

Milhões de mortes foram relatadas durante os três pandemias de gripe do século 20 1. Além disso, a pandemia de gripe mais recente foi declarada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) 2, em 2009, e em 1 de agosto de 2010, 18.449 mortes foram registradas pela OMS 3. Esta pandemia demonstrou mais uma vez a alta carga de doenças infecciosas, e da necessidade de rápida e precisa detecção de gripe para ativar a confirmação da doença rápida, resposta adequada de saúde pública e tratamento eficaz 4.

Existem vários métodos utilizados para o diagnóstico da gripe, que incluem imunoensaios, ensaios rápidos antigénio directa fluorescente (DFA) e os métodos de cultura viral. Imunoensaios rápidos dramaticamente falta de sensibilidade 5-8, enquanto que os outros dois métodos são muito trabalhosa e demorada 9. Os testes moleculares oferecem múltiplas vantagens, incluindo um curto tempo de rotação SensIT, de altaivity, e maior especificidade. Várias entidades comerciais têm vindo a trabalhar no sentido rápidos testes moleculares (também chamados de testes de ácidos nucleicos ou NAT) para doenças infecciosas, e vários ensaios têm influenza em suas condutas. No entanto a maior parte deles necessitam off-chip de preparação da amostra. Nenhuma das alterações Clinical Laboratory Improvement (CLIA) renunciou testes moleculares incorporar a preparação da amostra para o cartucho de ensaio ou módulo.

Lab-on-a-chip desempenha um papel importante no desenvolvimento de dispositivos de point-of-care de teste. Após a introdução do chip primeira PCR, em 1993, 10, numerosos esforços têm sido feito para desenvolver chips de teste de ácido nucleico. No entanto, apenas alguns deles têm a preparação da amostra integrado bruto com amplificação a jusante.

Temos anteriormente demonstrada a miniaturização de uma coluna de extracção em fase sólida (SPE) em um chip microfluídico plástico 11 ea desenvolvermento e otimização de um contínuo fluxo de chip de PCR 12. Aqui, nós estendemos o trabalho anterior para integrar a SPE com RT e as etapas de PCR em um único chip para diagnósticos clínicos e demonstrar a sua capacidade para amplificar ácidos nucléicos de paciente nasofaringe (NP), esfregaços e aspirados.

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Protocol

1. Fabricação de chips 12

  1. Fazer duas placas de aglomerados Zeonex 690R: distribuir 8-9 gramas pelotas Zeonex uniformemente no centro de uma placa de metal, o pré-aquecimento na prensa aquecida a 198 ° C durante 5 min e, em seguida, aplicar a pressão lentamente até 2500 psi, durante mais 5 min. Para concluir esta etapa, foi utilizado um Carver imprensa quente.
  2. Grava o canal microfluídico na placa com um molde de epóxi. Os detalhes sobre a fabricação do molde são descritos em outra parte 12 (canal de desenho na Figura 2b): colocar uma placa sobre o molde epóxi; preaquecimento los na prensa aquecida a 157 ° C durante 10 min e, em seguida, aplicar a pressão lentamente até 1000 psi por mais 10 min . Remova a placa do molde à mão ou usando uma pinça, antes que esfrie. (Nota: usar luvas térmicas durante esta etapa.)
  3. Perfura-se o chip em relevo, na entrada, a porta de resíduos, e a saída do canal microfluídico. Usamos um diâmetro de 1,25 mmeter broca para fazer os três orifícios.
  4. Ligação do chip em relevo com uma outra placa (em cima): Lavar as fichas com IPA, RNAse Fora água desionizada e em sequência; ar seco e pré-aquecer-los na prensa aquecida a 131 ° C durante 10 min e em seguida pressionar a 350 psi para uma outra 10 min.
  5. Anexar Nanoports na entrada, de resíduos, e as portas de saída separadamente usando JB Weld Epoxy; curar durante 15 a 24 horas de acordo com as instruções do fabricante.
  6. Lavar o canal SPE com 50 ul RNAse Away, seguiu com 100 ul de água nuclease livre.
  7. Carregar o canal de SPE com 4 ul de solução de enxerto (metacrilato de metilo, de 3% w / v de benzofenona) e, em seguida, a ligação cruzada de metacrilato, por incubação durante 10 minutos num forno de UV de comprimento de onda 365 nm sob UV e 2.000 mJ / cm 2. Remover a solução residual com enxerto de vácuo. Utilizou-se o vácuo de parede. Para obter os melhores resultados, uma solução fresca deve ser usado. É geralmente aceitável, no entanto, para armazenar umsolução preparada a 4 ° C durante até uma semana.
  8. Tornar a solução coluna SPE (todos% v / v): dimetacrilato de etileno de 16%, 24% de metacrilato de butilo, 42% de 1-dodecanol, ciclohexanol 18%, e adicionar 1% de 2-dimetilamino-4-(metil-f enilamino)-fenol como o foto-iniciador.
  9. Retire o mesmo volume de solução de sílica microesferas como sendo a solução da coluna SPE (para fazer uma mistura a 1:1), e secá-la completamente, a 70 ° C durante a noite num forno de vácuo. Quebra-se o pellet tocando o tubo com a tampa fechada. Adicionar a solução da coluna SPE dentro do tubo de sílica seco de microsferas e vortex para misturar.
  10. Carregar 4 ul de solução de SPE no mesmo canal e, em seguida, formar ligações cruzadas por radiação UV é de 2,5 min. Em seguida, vire o chip de uma e outra irradiar para 2,5 min. A coluna de SPE polimerizada deve ser um sólido opaco branco.
  11. Lavar o canal com 500 ul de metanol a 100% para enxaguar o excesso de reagentes. Esta lavagem remove também intra-polímero posolventes rogenic, criando desse modo a estrutura de poros abertos da coluna SPE, após secagem em condições ambientes.
  12. Anexar dois aquecedores de película fina para o fundo do chip com a fita condutora térmica. Os lados dos aquecedores têm de estar alinhadas com a borda dos canais largos para desnaturação e recozimento separadamente (ver Figura 1).
  13. Coloque cinco termopares no chip através da morte terminou canais laterais abertas de cada chip (ver Figura 2b). Os termopares ficar nestes canais via ajuste de imprensa. Fita foi utilizada para continuar a fixar a localização dos termopares.

2. Método de Extracção em Fase Sólida

  1. Preparar 96 ul de etanol a 70%, com água tratada com DEPC e autoclavadas (desionizada ou Millipore-filtrada).
  2. Adicionar 4 de ul de RNA 25X Fixe a 96 ul de etanol a 70% em um tubo, e duplicar a mesma mistura com 100% de etanol, num tubo separado.
  3. Prepare 300ul de tampão de canal através da mistura do seguinte: 75 jul de tiocianato de guanidina 6 M (GuSCN), 150 ul de 2-propanol, 63 ul de água livre de nuclease, e 12 ul de RNA 25X seguros.
  4. Preparar 312 ul de tampão de lise por mistura de: 100 uL de 6 M GuSCN, 200 ul de 2-propanol, e 12 ul de RNA 25X seguros.
  5. Aquece-se a etanol a 70%, etanol a 100% de tampão de canal, e tampões de lise a 60 ° C durante 10-20 min para ativar o Secure RNA.
  6. Para equilibrar o canal microfluídico, execute o buffer de canal através do canal de SPE com um caudal de 0,8 ml / hr.
  7. Quick-descongelar a amostra de teste em VTM a 37 ° C em banho de água, e remover a amostra do banho de água imediatamente, logo que ele é descongelado.
  8. Centrifugar amostra a 13.000 rpm durante 10 min, e transferir 100 ul do sobrenadante para 300 ul de tampão de lise. Completa a mistura por adição de 6 ul de 1 ug / ul de ARN transportador.
  9. Vortex para misturar, e após centrifugação para5 seg, carregar o lisado inteiro para uma seringa Luer-lok cc 1.
  10. Executar lisado através do canal de SPE com um caudal de 0,8 ml / hr.
  11. Lava-se a canal de SPE com 100 ul de etanol a 70%, seguido de 100 ul de etanol of100% a 1 ml / hr. (Há um volume de 50 ul morto na ponta da seringa que não será empurrada para fora, então na verdade apenas 50 ul está a atravessar o canal.)
  12. Posicionar uma seringa vazia na marca de 0,5 ml e empurrar o ar através do canal para secá-la, a 1 ml / hr.
  13. Executar 67,5 ul de água livre de nuclease através do canal para eluir os ácidos nucleicos ligados a 0,5 ml / h, e recolher 13,5 uL da nanoport no porto de resíduos. (A perda de líquidos é devido ao volume de 54 ul morto na ponta da seringa e o canal de SPE.)

3. RT-PCR

  1. Prepare 36,5 uL da mistura principal de RT-PCR durante o passo de ar seco (2,12), utilizando os reagentes em um OneStep RT-PCR Qiagen kits.
  2. Carregar RT-PCR reagente no nanoport no porto de resíduos, e mistura-se com o RNA para obter a seguinte reacção 50 uL de RT-PCR: 13,5 ul de RNA eluído em água livre de nuclease, 4 ul de mistura de RT-PCR de enzima, solução de 10 ul de Q, 10 μl1X um tampão passo, 2 mM de MgCl 2 25 uL, 1 ul de 50 mM de primer forward 5'-GAC CRA TGT TCC CAC CTC TGA C-3 ', 1 ul de 50 mM de iniciadores inverso 5'-TGG AGG GCA TTY ACA AAK CGT CTA-3 ', 2 ul de dNTPs, 0,75 ul de 1,0% w / v de BSA, 0,73 e 5,02 ul de água PEG8000 nuclease ul livre.
  3. Coloque a mistura de RT-PCR para o canal de RT por vácuo suave (utilizou-se o vácuo de parede) e selar o Nanoport com um encaixe fechado.
  4. Aplicar 35 V para o aquecedor 1. Manter os reagentes no canal de RT, durante 30 min, após o aquecedor 1 equilibra a 50 ° C. Manter os reagentes no canal de RT, durante 15 min, após o aquecedor uma equilibra a 95 ° C.
  5. Aplicar 27 V para o aquecedor 1 e 50 V para o aquecedor 2, esperar cerca de três minutos ou até que um aquecedor equilibra a 60 e deg, C e aquecimento 2 equilibra a 95 ° C.
  6. Empurrar os reagentes para dentro do canal de PCR com 0,5 ul / min. Deve ter cerca de 20 min para os reagentes fluir através do canal de serpentina.
  7. Como a amostra torna-o no final do canal de serpentina, recolher os produtos de PCR na saída utilizando um pipetador de tamanho adequado e de ponta.

4. Detecção de Produtos PCR

  1. Usamos um Agilent teste de DNA de alta sensibilidade para detectar os produtos. Para executar este teste tirar a Agilent Kit DNA Alta Sensibilidade da geladeira 30 minutos antes do teste.
  2. Ligue o Bioanalyzer e abra o software especialista 2100.
  3. Carregar o 1 uL dos produtos de PCR para o ensaio e seguir o protocolo Agilent ( http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent 20Manual.pdf% ).
  4. Analisar e registrar os dados.

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Representative Results

Um resultado típico é mostrado na Figura 3, para uma amostra de influenza A lavagem nasofaríngeo infectado. Devido às diferentes quantidades de vírus influenza em cada amostra de paciente, a concentração final de produto de PCR pode variar. Um bom resultado deve ter baixo ruído, dois picos escada claras (35 e 10380 pb) e um pico único produto com o tamanho do produto concebido (107 pb) para a amostra positiva. Enquanto que o pico do produto deveria, teoricamente, estar ausente dos controlos negativos, fizemos observar picos espúrios próximos PCR do locus específico da gripe a partir de dimeros de iniciadores de formação em algumas amostras. Picos múltiplos produtos reflectem a contaminação potencial do teste. Se isso ocorrer, outra alíquota da amostra deve ser testada novamente. A electroforese em gel pode ser utilizada para uma verificação posterior dos resultados do teste 13.

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Figura 1. De cima para baixo esquemática simplificada chip. Os contornos vermelhos mostram a localização dos aquecedores de contacto na parte inferior do chip.

Figura 2
Figura 2. O fluxo de ensaio microfluídicos 13. (A) Imagem de dois chips microfluídicos com aquecedores ligados de filme fino e dois barril bomba de seringa. As seringas de vidro foram conectados a cada chip com um tubo flexível para carregar os reagentes e amostras. Três portas foram colados nas entradas de canal de SPE e da porta de escoamento, e a saída do canal de PCR (b) criação do canal com três secções:. Preparação da amostra (SPE), RT e câmara de fluxo contínuo PCR canal. Dois aquecedores de resistência fixos estão ligados através fita térmica para a parte inferior do chip. O fluxo do fluido entre os canais é de laminar e as alterações na resistência do fluido permitida para válvulas menos operação. A profundidade é de 500 mm para SPE e canais de IF, e o canal de PCR é de 100 um de profundidade. As larguras são de 500 mm para a coluna de SPE, 1 mm para a câmara de RT, e variar de 200 a 400 um para as secções largas e estreitas do canal de fluxo contínuo de PCR. O chip é de 70 mm de comprimento, 25 mm de largura e 1,4 mm de altura. (C) microfluídica fluxo do processo de ensaio. A amostra de nasofaringe é misturado com tampão de lise, aplicada ao chip, o chip é executado, e os produtos de PCR são lidos utilizando um chip de electroforese capilar comercial. 13 para ver figura maior .

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Figura 3. Em resultado de chip ponto final diagnóstico. Pico O produto da PCR é o pico do meio para o tamanho de 107 pb. Picos esquerda (35 pb) e direita (10380 pb) são os picos de escada de controlo. A concentração dos produtos de cada pico é a área sob a curva. Estes são tabulados. (Um) resultado positivo, sem qualquer pico de ruído. (B) resultado positivo com Primer-dímeros em 42 pb. Clique aqui para ver maior figura .

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Discussion

O método de diagnóstico aqui apresentados demonstram a capacidade de um chip microfluídico integrado plástico para amplificar influenza A RNA a partir de amostras de pacientes com elevada especificidade e um limite de detecção de baixo 13 Concebemos este chip para o ponto de teste de potencial cuidado:. (A) a temperatura do fluido e controle foram simplificados, (b) o chip é de baixo custo e conveniente para a fabricação de alto rendimento usando moldagem por injecção, e (c) o chip é descartável e destinado a um uso do tempo, reduzindo assim a preocupação de contaminação cruzada da amostra.

Embora o nosso tempo de execução no chip atual de 3 horas, a nossa plataforma de extracção contém amplo espaço para otimização de processos. Por exemplo, a solução de lavagem e tempos de secagem para a direita antes de eluição pode ser reduzido através de uma combinação do aumento da taxa de fluxo e redução dos volumes de lavagem. Além disso, o custo pode ser aparadas, simplificando o processo de fabricação de chips e substituição peri caro ou complicadopherals, como as bombas de seringa, fonte de alimentação, com alternativas como bombas de seringa descartáveis ​​de infusão e baterias pequenas abertura do fase sólida geometria coluna de extração e porosidade vai permitir reduções significativas nos requisitos da bomba. Além disso, uma vez que o desenho de chips é padronizado para a fabricação de volume elevado, muitos dos termopares utilizados no desenvolvimento de dispositivo será eliminado.

Mais do que outros fatores, a robustez do nosso módulo de detecção on-chip influenza depende do controle de temperatura boa e entrega de amostra apropriado. Ligeiro deslocamento da temperatura desejada no-chip, bem como não intencionais múltiplos ciclos de congelação-descongelação da amostra de influenza, tanto poderia reduzir o rendimento final de PCR. Além desses fatores, as variações em nossos resultados on-chip de PCR de 13 amostras de pacientes diferentes também pode ser atribuído a: Variação da carga viral, diferentes níveis de contaminação de células humanas e blood, a presença de inibidores de PCR após extracção de ácido nucleico, 14,15 e inesperadas reacções químicas e / ou físicas entre as amostras e os reagentes de teste, ou o próprio dispositivo 16.

Em resumo, demonstramos a viabilidade do nosso chip microfluídico para amplificar o RNA do vírus influenza A em medicamente relevantes amostras de nasofaringe. O chip tem o potencial para ser aplicado a outro ADN ou ARN alvos.

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Disclosures

Os autores declararam não interesses concorrentes financeiros.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi suportada pelo National Institutes of Health (NIH) concessão R01 EB008268.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-dodecanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 443816-500G
2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 196118-50G
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies, Santa Clara, CA G2943CA
2-Propanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 19516
Benzophenone Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 239852-50G
BSA Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA A7979-50ML
Butyl methacrylate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 235865-100 ml
Carrier RNA Qiagen, Valencia, CA 1017647
Cyclohexanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 105899-1L
Ethanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E7023
Ethylene dimethacrylate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 335861
Ethylene glycol dimethacrylate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 335681-100ML
Glass syringe 250 μl Hamilton, Reno, NV 81127
Guanidine thiocyanate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 50981
High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies, Santa Clara, CA 5067-4626
Hot press Carver,Wabash, IN 4386
J-B Weld Epoxies Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL 7605A11
Luer-Lok syringes BD-Medical, Franklin Lakes, NJ 309628
Magnesium Chloride Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA AB-0359
Methanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 494437
Methyl methacrylate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M55909
Nanoport Upchurch Scientific N-333-01
Nanoport Fitting Upchurch Scientific F-120x
Nuclease free water Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA PR-P1193
OneStep RT-PCR kit Qiagen, Valencia, CA 210210
PEG8000 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 41009
Power supply VWR,Radnor, PA 300V
RNAse Away Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 83931-250ML
RNASecure Applied Biosystems, Foster City, CA AM7005
Silica microspheres Polysciences,Warrington, PA 24324-15
Syringe pump Harvard Apparatus,Holliston, MA HA2000P/10
Thermally Conductive Tape Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL 6838A11
Thermocouple Omega Engineering, Stamford, CT 5SRTC-TT-J-40-36
Thin-film Heaters Minco,Minneapolis, MN HK5166R529L12A
Ultraviolet Crosslinker UPV, Upland, CA CL-1000
Zeonex Zeon Chemicals, Louisville, KY 690R

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