三维成像伤害表皮内神经纤维在人体皮肤活检

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Summary

为了研究伤害表皮内神经纤维(IENFs)在痛苦神经病(PN)的变化,我们开发的协议,可以直接检查观察伤害IENFs的三维形态变化。三维分析IENFs的有潜力评估的形态变化IENF PN。

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Dauch, J. R., Lindblad, C. N., Hayes, J. M., Lentz, S. I., Cheng, H. T. Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies. J. Vis. Exp. (74), e50331, doi:10.3791/50331 (2013).

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Abstract

一拳的皮肤活检是常用的量化表皮内神经纤维密度(IENFD)的周边多发性神经病变的诊断1,2。目前,通常的作法是,以收集从小腿远端(DL)和近端大腿长度依赖多神经病的评价3(PT)中的3毫米的皮肤活组织切片检查。然而,由于多向性质IENFs,它是具有挑战性的研究通过分析重叠的神经结构的二维(2D)成像。另外,三维(3D)成像,可以提供一个更好的解决方案,这种困境。

在目前的报告中,我们提出了应用三维成像的方法研究痛性神经病变(PN)。为了拣选IENFs的,皮肤样本进行处理的蛋白基因产物9.5(PGP),锅的神经元的标记物的免疫荧光分析。目前,标准做法是诊断小纤维神经病使用IENFD阻止使用PGP免疫组化开采的明视场显微镜4。在目前的研究中,我们采用双重免疫分析识别总IENFD,使用PGP,痛觉IENF,通过使用抗体,承认原肌球蛋白受体激酶A(TRK),高亲和力受体的神经生长因子5。 PGP和TRK A抗体共同染色IENF与优势,有利于PN明确PGP阳性,痛觉纤维染色的研究。这些荧光信号可以被量化,以确定的伤害IENFD及形态学的影响IENF与PN。荧光共聚焦显微镜图像采集和3D分析处理。 3D成像提供了旋转的能力,以进一步分析与PN相关的形态学变化。两者合计,荧光染色,共聚焦成像和3D分析明显受益PN的研究。

Introduction

目前,通常的做法是从皮肤打孔活检,可用于诊断小纤维神经病6-8医师量化表皮内神经纤维密度,(IENFD)。活检取自小腿远端(DL),10厘米以上外踝,和大腿近端(PT),20厘米以下的髂前上棘9。 ,所有IENF标记蛋白基因产物9.5(PGP),泛神经标记10-12。目前,标准做法是小纤维神经病诊断确定由PGP染色与明视场显微镜6 IENFD。此外,一些研究小组已经使用PGP免疫组化免疫协议7-9。小纤维神经病变通常伴有神经性疼痛。为了进一步了解必不可少的疼痛处理IENF的作用,我们制定了技术合作标签总IENF的纤维,产生疼痛。 Nocicep略去IENF,特别是Aδ和C纤维,可以研究通过使用PGP IENF标签和痛觉标记,原肌球蛋白受体激酶A(TRK)5。蒂尔克是伤害性的发展是必不可少的神经生长因子的高亲和力受体。 A-阳性的TRK痛觉神经纤维肽纤维快递P物质(SP)和降钙素基因相关肽(CGRP)。此前,劳里亚和他的同事们采用双标记技术,研究PN,共同标签PGP阳性IENF与疼痛标记10。在我们以前的研究中,我们证实蒂尔克A-阳性IENF,但不是蒂尔克A-负面IENF的,上调糖尿病痛性神经病变的动物模型。这个共同标签技术提供了比较量化痛觉IENFD的,总IENFD和学习能力与PN相关的形态学变化的能力。可视的痛觉IENF和COMPA能力,重新量化总IENFD到痛觉IENFD的疼痛的存在可以提供客观的证据,并有可能洞察疼痛的严重程度与PN。这种技术也适用于皮肤的动物模型。在以往的研究相比,目前的协议描述为3D图像分析的方法,创造了机会,以避免错误可能发生在2D图像分析。

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Protocol

A部分:免疫组化

96 - 孔板的下游和预防的背景染色打孔皮肤活检从人类受试者收集孵育12-24小时,在固定液(用0.75M的L-赖氨酸溶液(pH7.4)中的2%的多聚甲醛和0.05 mM的高碘酸钠)在4℃下,如前面所述样本,然后cryoprotected的在磷酸盐缓冲盐水(PBS),在4℃的20%甘油1周,嵌入安装媒体最佳的切削温度(OCT),然后划分成50微米厚的部分在低温恒温器中。下面描述的协议,是专为8内的皮肤,皮肤切片的最大数量未能经过自由浮动的免疫组化实验在一个96 - 孔板。

第1天:

1。防止非特异性免疫反应的角质层

  1. 出版商96 -孔板,如在图1中示出。 图像IT FX信号(图像),有效阻断背景染色11,12,第1行中的96孔板,每孔加入150μl。
  2. 行2和3的96 - 孔板中,在每孔中加入150μl的PBS洗涤。
  3. 收购两项每名患者的50微米的部分:一节从DL活检,活检采取PT的一个部分。接种环(LeLoop)是用来传输从一个部分到下一个冲洗,以避免形态破坏。轻轻将每50微米的部分,用接种环,进入个人的第1行,包含图像。孵育30分钟,在RT上平坦的摇臂部分在图像。
  4. 冲洗部分用1X PBS(行2和3)的两倍,在RT下10分钟。将漂洗之间的一台摇臂孔板。

2。 5%BSA封闭液和1%的清​​洗液的制备

  1. 虽然活检切片图像IT孵化,准备5%封闭的解决方案重刑(5%BSA,0.3%TX-100,0.1 M的PBS涡BSA解决方案,直到完全溶解)。
  2. 进入第4行每口井的5%BSA封闭液加入150μl。
  3. 用接种环,部分转移到个别井的5%BSA封闭液。为1-2小时,在RT下孵育5%牛血清白蛋白封闭溶液中的部分,在平坦的摇臂。

3。 1%BSA冲洗液和稀释初级抗体的制备

  1. 虽然部分5%BSA封闭溶液中孵育,制备1%冲洗液(1%BSA,0.3%TX-100,0.1M PBS涡的BSA溶液,直至完全溶解)。
  2. 虽然部分5%BSA封闭溶液中孵育,稀释第一抗体在1%漂洗液。
    1. 对于八个部分(8×150微升= 1200微升)共1,200微升是必要的。第一抗体是由在1500微升(约20%的额外体积)。
    2. 稀释的主要抗体:PGP,1:500; TRKÅ,1:500在含1%BSA的冲洗液。

4。孵化的切片活检小学抗体

  1. 到指定的96 - 孔板的孔中(第5行),加入150μl稀释的第一抗体。
  2. 传输部分从封锁5%的溶液(第4行)到指定的初级抗体井(第5行)。
  3. 用封口膜和铝箔密封的96 - 孔板,以避免干燥和曝光灯。
  4. 一台摇臂上,孵育96孔板O / N在4℃。

第2天:

5。在1%BSA的冲洗液冲洗穿刺活检

  1. 到第6行中的各孔,7,和8中,加入150μl含1%BSA的冲洗液。
  2. 冲洗部分三次,用1%BSA(行6,7,和8),在RT 1小时,每次冲洗液。盖孔板铝箔和冲洗平面之间的摇杆。

6。稀释二级抗体

<醇>
  • 当章节被培养在含1%BSA的冲洗液在最后一次漂洗(第8行),1%BSA的冲洗液中稀释的二抗:
    1. 对于八个部分(8×150微升= 1200微升)共1,200微升是必要的。该次级抗体是由在1500微升(约20%的额外体积)。
    2. 的二级抗体稀释:PGP(的Alexa Fluor 488驴抗兔1:250),蒂尔克的Alexa Fluor 647驴抗山羊,1:250),A(1%BSA冲洗液中。
  • 7。孵化的切片活检中学抗体

    1. 到他们的指定的96 - 孔板的孔中(行9)加入150μl稀释的二级抗体。
    2. 从1%BSA封闭溶液(第8行),在进入第二抗体以及(9行)传输部分。
    3. 用封口膜和铝箔密封的96 - 孔板,以避免干燥和曝光灯。
    4. 孵育部分在指定的二级抗体Ø/ N在4°C一台摇臂上。

    8。在1%BSA的冲洗液冲洗穿刺活检

    1. 加入150μl含1%BSA的冲洗液到每口井的行10,11,和12。
    2. 冲洗部分三次,用1%BSA漂洗溶液(行10,11,和12),在RT每次1小时。盖以及用铝箔板和一台摇臂之间冲洗。

    9。显微镜玻片制备和安装切片活检

    1. 虽然活检切片孵育1%BSA冲洗液(第12行)在最后一次漂洗时,准备显微镜幻灯片。
    2. 将50μl的1%BSA漂洗溶液一次一张幻灯片上。
    3. 删除部分从1%BSA的冲洗液(第12行),并将其放置在1%BSA漂洗指定的显微镜载片上的解决办法,将50μl滴。优化部分的位置后,用鼓起的玻璃吸管,去除多余的1%BSA冲洗液,采取预防措施以避免触及标本。

    注意:请确保部分不折叠;,试样应反对表面的显微镜幻灯片持平。

    1. 将1滴延长Gold抗淬灭试剂用DAPI附近的活检安装在显微镜幻灯片。一个22x22毫米显微镜的盖玻片,轻轻把它放在活检和一滴延长Gold抗淬灭试剂DAPI下降。重复的每个部分。
    2. 让显微镜玻片干燥RT在黑暗O / N。

    注:删除任何气泡,用枪头。擦去多余的延长黄金抗淬灭剂。

    B部分:共聚焦成像

    10。共聚焦成像

    1. 荧光图像信号采用奥林巴斯FluoView的500激光扫描共聚焦显微镜40X的油浸目标和变焦两次与FluoView 5.0版软件(1.3 NA)。 使用的Alexa Fluor 488和647的Alexa Fluor 543-nm的绿色氦氖激光和633 nm的氦氖红色激光,分别以激发。的Alexa Fluor 488的信号表示由绿色的查找表(LUT)的Alexa Fluor 647由红色LUT。
    2. 每个检测器的共焦的孔设置在400微米,以提高信号。应采取循序扫描,分辨率为1024×1024,以最大限度地提高信号分离。
    3. 使用1.2μm的z轴步进间隔(基于计算由FluoView软件的最佳扫描单元)与卡尔曼的平均(两帧)捕获三维的z系列。

    C部分:三维可视化与动画

    11。三维(3D)的可视化和动画

    1. Imaris里X64软件(版本7.3,位平面AG)打开Fluoview文件,以可视化的三维图像集。
    2. 调整显示根据需要,以提高特定的神经信号的对比度。
    3. 创建一个SUrface可视化真皮表皮边界。使用轮廓工具绘制模式绘制边界。
    4. 分配一个半透明的表面的边界,以便查看相关的荧光信号。
    5. 捕获静止图像的3D荧光信号来创建快照映像的3D电影。
    6. 使用动画功能来创建一个3D的电影。图像可以360度旋转几次,以显示每个信号分开和合并后的( 图2,图3,和4)。设置动画创建由每秒15帧200帧动画电影。作为一个原始的AVI文件保存每部电影。
    7. 压缩最终的AVI电影的VirtualDub软件(版本1.9.4)。

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    Representative Results

    我们套用了目前的协议与PN患者在PT和DL皮肤活检研究的形态IENF。犹他州立大学的皮肤,从三个科目,收集展示的病理形态学与PN。主要内容包括:案例1:一名51岁的男性与2型糖尿病(持续时间:14个月;疼痛得分:51)的PN历史案例2:一个56岁的男性与PN的历史2型糖尿病(工期:108个月;疼痛得分:47);案例3:一个66岁的男性与PN 2型糖尿病(持续时间:42个月;疼痛得分:46)的历史。神经系统病史和体检,包括定量感觉测试和神经传导研究,进行评估外周神经病变。疼痛分数确定基于0-100视觉模拟疼痛的规模。

    通过此协议,我们能够研究在人体皮肤IENFs的三维结构( 图2)。图2中图3)。轴索肿胀,在图3中,三维成像显示,这些隆起的球状结构分布IENFs的。此外,这些方法都可以使用,研究分支在IENFs( 图4)。分支如图4所示的三维图像表明,形态学变化与PN的存在。如前所述,根据形态和方向的神经和真皮和表皮8的像素之间的强度差异来确定的真皮-表皮边界。蓝色的跟踪, 如图2,图3所示,和4个,表明真皮表皮交界处。

    图1
    图1。设置为96孔板皮肤活检免疫组化的示意图。

    图2。三维(3D)图像的IENF。 PGP阳性IENF(A)代表的3D图像,标记为绿色,代表首创的360°旋转总IENF()及(B)蒂尔克A-积极IENF的,标记为红色,代表伤害性IENF的(第二个360°旋转)和(C )合并后的图像显示PGP阳性,的伤害IENF(第三个360°旋转)从案例1在皮肤样本。酒吧= 20微米。 点击这里观看电影。

    3。的三维(3D)图像的轴突肿胀在IENF的PN。代表性的3D图像在皮肤样本从案例2中,轴索的肿胀(箭头)沿IENFs,PGP标记的绿色信号,并在皮下神经丛。酒吧= 10微米。 点击这里观看电影。

    图4。的三维(3D)图像轴索分支的PN IENF。代表的3D图像沿IENFs轴突分支(箭头),由PGP标记与一个绿色的信号,从案例3皮肤样本。酒吧= 20微米。 点击这里观看电影。

    5%BSA封闭液的组成: 所需金额12.5毫升
    1X PBS 8.125毫升
    0.1%的Triton X-100(TX-100)[终浓度:0.03%] 3.75毫升
    牛血清白蛋白(BSA) 0.625克
    12.5毫升

    表1中。 5%BSA封闭液。

    1%的组件冲洗解决方案: 12毫升所需金额
    1X PBS 8.625毫升
    0.1%TX-100 [终浓度:0.03%] 3.25毫升
    牛血清白蛋白(BSA) 0.125克
    12毫升

    表2中。 1%BSA封闭液。

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    Discussion

    测量IENFD已被广泛用于周围神经病变13,14的程度来决定。目前,最常用的协议仅用于测量神经纤维的密度,穿透基底膜的表皮,它并没有考虑到轴突分枝和/或神经的形态变化。此外,还没有被证明电流IENFD分析与疼痛的存在PN 15相关联IENFD的。

    我们以前报道,都与在db / db小鼠的疼痛行为,2型糖尿病的小鼠模型增加的痛觉IENFD的数字。在该报告中,我们首先采用免疫荧光双协议研究痛觉IENF的。在目前的研究中,我们将扩大我们的协议,对人体皮肤与PN患者。双重免疫分析提供了两个总IENF疼痛及IENF的测量,子集的IENFs调解疼痛。这些的伤害IENF大多是正面蒂尔克A等的痛觉神经肽5。劳里亚和他的同事10类似的双重免疫分析已经由痛苦的神经病变。他们减少痛苦的神经病变患者的瞬时受体电位阳离子通道亚科V成员1(TRPV1)IENFD。目前的协议可以提供另一种方式为我们的动物数据 ,基于伤害IENFD的测量。

    目前的协议提供了一个3D的方法研究IENF结构。结合双免疫荧光分析,目前协议规定的方法检查痛觉IENFs形态。以往的研究还没有报道密度或PN的伤害IENF与分支之间的关联。在这里,我们展示了一个协议,用于研究轴突分支和肿胀在人体皮肤IENFs的。我们的3D的分析表明,这种米ethod可以用来研究PN IENF的形态变化。此外,三维成像可以改善目前的协议IENFD测量,避免错误,都与减​​少重叠结构与二维成像的可视化。

    被定义为轴索肿胀轴突部,其直径大于2倍的原始轴突口径16的放大。这个结构包含轴突细胞骨架和轴突运输的组成部分片段。轴索肿胀的早期特征性轴索型神经病6,16,17。然而,轴索膨胀结构的三维分析的文献报道。 如图3所示,三维成像能提供重要线索,与PN轴索肿胀。

    这是很好的特点,轴突分支伴随着神经损伤的恢复18。然而,本基于二维成像量化轴突分支的可用方法仍然有限。 图4中所描述的,复杂的曲折性神经再生轴突分枝。因此,分枝点附近的神经纤维被遮蔽影响定量结果的准确性。我们的协议提供的三维成像分析改进的可视化分支神经的细节。

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    Disclosures

    没有利益冲突的声明。

    Acknowledgements

    这项工作是由美国国立卫生研究院资助的支持K08 NS061039-01A2,神经学研究发现,和A.阿尔弗雷德·陶布曼医学研究所在密歇根大学的计划。这项工作用了密歇根州的糖尿病研究和培训中心,由国家卫生部授予5P90 DK-20572研究院从国家糖尿病,消化道和肾脏疾病研究所资助的形态和图像分析核心。笔者想感谢罗宾逊的Singleton和戈登史密斯(犹他州大学)的慷慨捐款支持初始伤害性的生物标志物免疫组化技术的发展,人类皮肤样本。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    10X PBS Fisher Scientific BP399-4 To make up 1X PBS
    Image-IT FX Signal Invitrogen I36933 Image-IT
    Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) AbD Serotec 7863-0504 PGP
    Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) R&D Systems AF1056 Trk A
    Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit Invitrogen A21206 AF488 donkey α-goat
    Alexa Fluor 647 donkey α-goat Invitrogen A21447 AF647 donkey α-goat
    Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich A7906-100 BSA
    Triton X- 100 Sigma-Aldrich T9284 TX-100
    Non-calibrated Loop LeLoop MP 199025 inoculating Loop
    96-well assay plate Corning Incorporated 3603 Well plate
    Prolong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36931 DAPI
    Microscope Cover Glass 22x22 mm Fisher Scientific 12-541-B Coverslips
    Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15 Microscope Slides
    Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope Olympus FV500 Confocal Microscope
    Optimum Cutting Temperature Sakura 4583 OCT
    Leica cryostat Leica CM1850 Cryostat

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    References

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