Dreidimensionale Bildgebung Nozizeptive Intraepidermale Nervenfasern im menschlichen Hautproben

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Summary

Um die Änderungen des nozizeptiven intraepidermal Nervenfasern (IENFs) in schmerzhafte Neuropathie (PN) zu untersuchen, haben wir Protokolle, die direkt untersuchen könnte dreidimensionalen morphologischen Veränderungen in nozizeptiven IENFs beobachtet. Dreidimensionale Analyse IENFs hat das Potenzial, um die morphologischen Veränderungen in IENF PN bewerten.

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Dauch, J. R., Lindblad, C. N., Hayes, J. M., Lentz, S. I., Cheng, H. T. Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies. J. Vis. Exp. (74), e50331, doi:10.3791/50331 (2013).

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Abstract

Ein Schlag Biopsie der Haut wird üblicherweise zur intraepidermal Nervenfaser Dichten (IENFD) für die Diagnose der periphere Polyneuropathie 1,2 quantifizieren. Derzeit ist es üblich, 3 mm Hautproben von dem distalen Schenkel (DL) und dem proximalen Schenkel (PT) für die Bewertung der längenabhängigen Polyneuropathien 3 sammeln. Aufgrund der multidirektionalen Art IENFs, ist es schwierig zu prüfen überlappenden Nervenstrukturen durch die Analyse von zweidimensionalen (2D-) Bildgebung. Alternativ könnte dreidimensionale (3D)-Bildgebung eine bessere Lösung für dieses Dilemma.

Im vorliegenden Bericht stellen wir Methoden für die Anwendung 3D-Bildgebung zu schmerzhaften Neuropathie (PN) zu studieren. Um IENFs zu identifizieren, werden Hautproben für Immunfluoreszenz-Analyse von Protein-Genprodukt 9.5 (PGP), ein pan-neuronalen Marker verarbeitet. Derzeit ist es üblich, kleine Faser Neuropathie mit IENFD abschrecken diagnostizierenabgebaut durch PGP Immunhistochemie mit Hellfeldmikroskopie 4. In der aktuellen Studie, angewendet wir doppelte Immunfluoreszenz Analyse insgesamt IENFD identifizieren, die mit PGP und nozizeptiven IENF, durch den Einsatz von Antikörpern, die Tropomyosin-Rezeptor-Kinase erkennen A (Trk A), die hohe Affinität Rezeptor für nerve growth factor 5. Die Vorteile der Co-Färbung IENF mit PGP und Trk A-Antikörper profitiert die Studie von PN deutlich Färbung PGP-positive, nozizeptiven Fasern. Diese fluoreszierenden Signale quantifiziert nozizeptiven IENFD und morphologische Veränderungen von IENF mit PN assoziiert zu bestimmen. Die Fluoreszenzbilder werden durch konfokale Mikroskopie erfasst und verarbeitet, für die 3D-Analyse. 3D-Bildgebung liefert Dreh-Fähigkeiten weiter zu analysieren morphologische Veränderungen mit PN verbunden. Zusammengenommen fluoreszierenden Co-Färbung, konfokale Bildgebung und 3D-Analyse eindeutig profitieren die Studie von PN.

Introduction

Derzeit ist es üblich, für Ärzte, intraepidermalen Nervenfaser Dichten (IENFD) von der Haut Stanzbiopsien, die verwendet werden, um kleine Faser Neuropathie 3, 6-8 diagnostizieren kann quantifizieren. Biopsien aus dem distalen Schenkel (DL), 10 cm über den Malleolus lateralis und den proximalen Schenkel (PT), 20 cm unterhalb der Spina iliaca anterior 9. Alle IENF sind beschriftet mit Protein-Genprodukt 9.5 (PGP), ein pan-neuronalen Marker 10-12. Derzeit ist es üblich, kleine Faser mit Neuropathien diagnostizieren IENFD bestimmt durch Färbung mit PGP Hellfeldmikroskopie 6. Darüber hinaus haben mehrere Arbeitsgruppen Immunfluoreszenz Protokolle für PGP Immunhistochemie 7-9 verwendet. Kleine Faser Neuropathie ist häufig mit neuropathischen Schmerzen verbunden. Zur weiteren Verständnis der Rolle von IENF wichtig für Schmerzen Verarbeitung, entwickelten wir eine Technik, um Co-Label insgesamt IENF mit Fasern, die Schmerzen zu erzeugen. Nozizeptorentive IENF, speziell A &dgr; und C-Fasern, durch die Co-Kennzeichnung IENF mit PGP und des nozizeptiven Marker, Tropomyosin-Rezeptor-Kinase A (Trk A) 5 untersucht werden. Trk A ist der Rezeptor mit hoher Affinität für NGF, die für die Entwicklung der Nozizeption ist. Die Trk A-positive nozizeptiven Nervenfasern sind peptiderge Fasern, express Substanz P (SP) und Calcitonin Gene Related Peptide (CGRP). Zuvor angewendet Lauria und Kollegen der doppelten Kennzeichnung Technik PN, Co-Kennzeichnung PGP-positive IENF mit einer nozizeptiven Markierung 10 zu studieren. In unserer früheren Studie haben wir gezeigt, dass Trk A-positive IENF, aber nicht Trk A-negative IENF, in einem Tiermodell der schmerzhaften diabetischen Neuropathie 5 wurden hochreguliert. Diese Co-Kennzeichnung Technik bietet die Möglichkeit, die Quantifizierung von nozizeptiven IENFD vergleichen, um IENFD und die Fähigkeit zur morphologischen Veränderungen mit PN zugeordnet studieren insgesamt. Die Fähigkeit, nozizeptiven IENF und Unternehmen visualisierenre Quantifizierung der gesamten IENFD zu nozizeptiven IENFD könnte Ziel Beweis für das Vorhandensein von Schmerz und möglicherweise Einblick in die Schwere der Schmerzen mit PN assoziiert ist. Diese Technik ist auch auf die Haut von Tiermodellen. Im Vergleich zu früheren Studien, beschreibt das aktuelle Protokoll Methoden zur 3D-Bildanalyse, die Schaffung der Möglichkeit, Fehler, die in 2D Bildanalyse auftreten könnten, zu vermeiden.

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Protocol

Teil A: Immunhistochemie

Herstellung von 96-Well-Platte und Prävention von Hintergrundfärbung Durchschlag Hautproben von menschlichen Probanden gesammelt und inkubiert für 12-24 Stunden in Fixierlösung (2% Paraformaldehyd mit 0,75 M L-Lysin-Lösung (pH 7,4) und 0,05 mM Natriumperiodat) bei 4 ° C wie zuvor 8 beschrieben. Die Proben werden dann in Phosphat kryogeschützt Kochsalzlösung (PBS) mit 20% Glycerin bei 4 ° C für bis zu 1 Woche, eingebettet in Eindeckmitteln optimale Schnittleistung Temperatur (OCT), dann im Schnitt in 50 um dicke Schnitte auf einem Kryostaten. Die unten beschriebenen Protokoll wird 8 Hautpartien, wird die maximale Anzahl von Hautpartien möglich, frei schwebenden Immunhistochemie in eine 96-Well-Platte zu unterziehen.

TAG 1:

1. Prävention von nicht-spezifische Immunreaktivität in der Hornschicht

  1. Label-96-Well-Platte, wie in 1 gezeigt. In 150 ul Bild-IT FX Signal (Bild-IT), wirksam zu blockieren Hintergrundfärbung 11,12, in jede Vertiefung in Reihe 1 der 96-Well-Platte.
  2. In 150 ul 1X PBS in jedes Well in Reihe 2 und 3 der 96-Well-Platte.
  3. Erwerben Sie zwei 50 um Abschnitte pro Patient: ein Abschnitt aus der Biopsie bei DL genommen, einen Abschnitt aus der Biopsie bei PT gemacht. Eine Impföse (LeLoop) wird verwendet, um Abschnitte von einem übertragen spülen, um die nächste zu morphologischen Schäden zu vermeiden. Sanft übertragen jede 50 um Abschnitt, mittels Impföse, zu einem individuellen und von Reihe 1, mit Bild-IT. Inkubieren Abschnitte in Bild-IT für 30 min bei RT auf einem flachen Rocker.
  4. Spülen Abschnitte zweimal mit 1 × PBS (Zeilen 2 und 3) für 10 min bei RT. Zeigen Well-Platte auf einer flachen Rocker zwischen Spülungen.

2. Herstellung von 5% BSA Blocking Solution und 1% Spüllösung

  1. Während Biopsie Abschnitte in Bild-IT sind Inkubation, bereiten 5% Blocking Lösungtion (5% BSA, 0,3% TX-100, 0,1 M PBS-Vortex-Lösung bis BSA vollständig auflöst).
  2. In 150 ul 5% BSA Blocking-Lösung in jedes Well der Reihe 4.
  3. Mit einer Impföse übertragen Abschnitte in einzelnen Vertiefungen von 5% BSA-Lösung blockiert. Inkubieren Abschnitte in 5% BSA Blocking-Lösung für 1-2 h bei RT auf einem flachen Rocker.

3. Herstellung von 1% BSA Spüllösung und Verdünnung des primären Antikörper

  1. Während Teile in 5% BSA Blockierungslösung inkubiert werden, bereiten 1% Spüllösung (1% BSA, 0,3% TX-100, 0,1 M PBS-Lösung bis Vortex BSA vollständig auflöst).
  2. Während Teile in 5% BSA-Lösung blockiert Inkubation, verdünnte Primärantikörper in 1% Spüllösung.
    1. Für acht Abschnitte (8 x 150 = 1.200 ul ul) insgesamt 1.200 ul benötigt wird. Die primären Antikörper werden in 1.500 ul (etwa 20% mehr Volumen) gemacht.
    2. Verdünnungen der Primärantikörper: PGP, 1:500; Trk A,1:500 in 1% BSA Spüllösung.

4. Inkubation von Sectioned Biopsien in primärer Antikörper

  1. In 150 ul verdünnten Primärantikörper in die dafür vorgesehenen Vertiefungen der 96-Well-Platte (Zeile 5).
  2. Übertragen von Abschnitten 5% Blockierungslösung (Zeile 4) in die dafür vorgesehenen Vertiefungen primären Antikörper (Reihe 5).
  3. Verschließen Sie die 96-Well-Platte mit Parafilm und Alufolie ein Austrocknen zu verhindern und Belichtung.
  4. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte O / N bei 4 ° C auf einem flachen Rocker.

TAG 2:

5. Spülen Biopsien in 1% BSA Spüllösung

  1. In 150 ul 1% BSA Spüllösung in jede Vertiefung in Reihe 6, 7 und 8.
  2. Spülen Abschnitte dreimal mit 1% BSA Spüllösung (Zeilen 6, 7 und 8) für 1 Stunde jedesmal bei RT gerührt. Titelbild Well-Platte mit Aluminiumfolie und auf flachen Rocker zwischen Spülungen.

6. Verdünnung der Sekundärantikörper

<ol>
  • Während Teile in der letzten von 1% BSA Spüllösung spülen (Zeile 8) inkubiert, verdünnt Sekundärantikörper in 1% BSA Spüllösung:
    1. Für acht Abschnitte (8 x 150 = 1.200 ul ul) insgesamt 1.200 ul benötigt wird. Die sekundären Antikörper sind bis in 1.500 ul (etwa 20% mehr Volumen) gemacht.
    2. Verdünnungen der sekundären Antikörper: für PGP (Alexa Fluor 488 Esel-anti-Kaninchen, 1:250), für Trk A (Alexa Fluor 647 Esel-anti-Ziege, 1:250) in 1% BSA Spüllösung.
  • 7. Inkubation von Sectioned Biopsien in sekundären Antikörper

    1. In 150 ul verdünnten Sekundärantikörper in ihr bezeichneten Vertiefungen der 96-Well-Platte (Zeile 9).
    2. Übertragen Abschnitte von 1% BSA Blocking-Lösung (Reihe 8) in sekundären Antikörper gut (Zeile 9).
    3. Verschließen Sie die 96-Well-Platte mit Parafilm und Alufolie ein Austrocknen zu verhindern und Belichtung.
    4. Inkubieren Abschnitte in dem bezeichneten Sekundärantikörper O/ N bei 4 ° C auf einem flachen Rocker.

    8. Spülen Biopsien in 1% BSA Spüllösung

    1. In 150 ul 1% BSA Spüllösung in jede Vertiefung in Reihe 10, 11 und 12.
    2. Spülen Abschnitte dreimal mit 1% BSA Spüllösung (Reihen 10, 11 und 12) für 1 Stunde jedesmal bei RT gerührt. Titelbild Well-Platte mit Aluminiumfolie und auf einem flachen Rocker zwischen Spülungen.

    9. Vorbereitung von Objektträgern und Montage Sectioned Biopsien

    1. Während Biopsie Abschnitte in der letzten von 1% BSA Spüllösung (Zeile 12) spülen sind Inkubieren, bereiten Objektträger.
    2. Zeigen 50 ul 1% BSA Spüllösung auf einer Folie zu einer Zeit.
    3. Entfernen Abschnitte von 1% BSA Spüllösung (Reihe 12), und legen Sie es in den 50 ul Tropfen 1% BSA Spüllösung auf dem designierten Objektträger. Nach der Optimierung der Position des Abschnitts, überschüssige 1% BSA Spüllösung mit einem wulstförmigen Glaspipette, wobei Vorkehrungenzu vermeiden, berühren Sie die Probe.

    HINWEIS: Vergewissern Sie Abschnitt nicht umgeklappt; die Probe sollte gegen die Oberfläche des Objektträgers flach.

    1. Platz 1 Tropfen verlängern Gold-antifade Montage Reagenz mit DAPI in der Nähe der Biopsie auf dem Objektträger. Werfen Sie einen 22x22 mm Mikroskop Deckglas und legen Sie sie vorsichtig über Biopsie und ein Tropfen verlängern Gold-antifade Reagenz mit DAPI Drop. Wiederholen Sie für jeden Abschnitt.
    2. Lassen Objektträger trocken O / N bei RT im Dunkeln.

    HINWEIS: Entfernen Sie alle Luftblasen mit einer Pipettenspitze. Überschüssiges verlängern Gold-antifade Reagenz.

    Teil B: konfokale Bildgebung

    10. Konfokalen Imaging

    1. Bild Fluoreszenz-Signale mit einer Olympus FluoView 500 konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit einem 40x Öl-Immersions-(1.3 NA) Ziel-und Zoom zweimal mit FluoView Version 5.0 Software. Verwenden Alexa Fluor 488 und Alexa Fluor 647, die 543-nm HeNe grünen Laser und 633-nm HeNe Red Laser bzw. anzuregen. Die Alexa Fluor 488 Signal wird durch einen grünen Nachschlagetabelle (LUT) und dem Alexa Fluor 647 von einem roten LUT dargestellt.
    2. Stellen Sie die konfokale Öffnungen für jeden Detektor bei 400 um, um Signale zu verstärken. Sequential Scans sollten bei einer Auflösung von 1.024 x 1.024, um das Signal zu maximieren Trennung getroffen werden.
    3. Erfassen dreidimensionaler z-Serie mit 1,2 um z-Schrittweiten (bezogen auf die optimale Scan-Einheit durch die Software berechnet FluoView) mit Kalman Mittelung (zwei Rahmen).

    Teil C: Dreidimensionale Visualisierung und Animation

    11. Dreidimensionale (3D) Visualisierung und Animation

    1. Offene FluoView Dateien in Imaris x64-Software (Version 7.3, Bitplane AG) zur Visualisierung der 3D-Bild-Sets.
    2. Passen Sie bei Bedarf angezeigt werden, um den Kontrast des Nervs spezifisches Signal zu verbessern.
    3. Erstellen Sie einen surface die dermo-epidermalen Grenze zu visualisieren. Verwenden Sie das Tool in Contour Auslosung Modus, um die Grenze zu ziehen.
    4. Zuweisen einer halbtransparenten Oberfläche zu der Grenze, um die zugrunde liegenden Fluoreszenzsignale anzusehen.
    5. Standbilder der 3D-Fluoreszenz-Signale an Snapshot Bilder der 3D-Film zu erstellen.
    6. Verwenden Sie die Animation, Funktion, um einen 3D-Film zu erstellen. Die Bilder können gedreht werden 360 Grad mehrmals, jedes Signal getrennt und fusionierte zeigen (Abbildungen 2, 3 und 4). Set Animation, Filme, bestehend aus 200 Bildern bei 15 Bildern pro Sekunde animiert erstellen. Speichern Sie jeden Film als AVI-Datei roh.
    7. Komprimieren Sie die endgültige AVI-Film mit VirtualDub-Software (Version 1.9.4).

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    Representative Results

    Dabei haben wir das aktuelle Protokoll, um die Morphologie der IENF in PT und DL Hautbiopsien von Patienten mit PN studieren. Die Haut, aus drei Themen, wurde an der Universität von Utah gesammelt, um die Pathomorphologie mit PN zugeordnet demonstrieren. Die Themen umfassen: Fall 1: ein 51-jähriger Mann mit einer Geschichte von PN von Diabetes Typ 2 (Dauer: 14 Monate; Schmerz-Score: 51); Fall 2: ein 56-jähriger Mann mit einer Geschichte von PN von Diabetes Typ 2 (Dauer: 108 Monate; Schmerz-Score: 47) und Fall 3: ein 66-jähriger Mann mit einer Geschichte von PN von Typ-2-Diabetes (Dauer: 42 Monate; Schmerz-Score: 46). Neurologische Anamnese und Untersuchung, einschließlich quantitative sensorische Testung und Nervenleitgeschwindigkeit Studien wurden durchgeführt, um periphere Neuropathie zu beurteilen. Schmerz-Scores wurden auf der Grundlage der 0-100 visuellen Analogskala Schmerz-Skala bestimmt.

    Mit diesem Protokoll sind wir in der Lage, die 3D-Struktur von IENFs in der menschlichen Haut (Abbildung 2) zu studieren. In Abbildung 2 (3) zu untersuchen. 3D-Bildgebung des axonalen Schwellungen, in Abbildung 3 dargestellt, zeigt, dass diese Schwellungen kugelige Strukturen entlang IENFs verteilt sind. Zusätzlich können diese Verfahren verwendet werden, um zu untersuchen Verzweigung in IENFs (Abbildung 4). 3D-Bilder Verzweigungsgrad in Fig. 4 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass morphologische Veränderungen stattfinden mit der Anwesenheit von PN. Wie zuvor beschrieben, wurde das dermal-epidermalen Grenze basierend auf der Morphologie und Orientierung der Nerven und der Pixelintensität zwischen Dermis und Epidermis 8 bestimmt. Die blaue Tracing, in den 2, 3 dargestellt ist, und 4, Zeigt die dermo-epidermale Verbindung.

    Abbildung 1
    Abbildung 1. Schematisches Diagramm, das die Einrichtung für eine 96-Well-Platte für Hautbiopsie Immunhistochemie.

    Abbildung 2. Dreidimensionale (3D) Bilder von IENF. Repräsentative 3D-Bild (A) PGP-positive IENF, grün markiert, was insgesamt IENF (erste Drehung um 360 °) und (B) Trk A-positive IENF, rot markiert, was nozizeptiven IENF (zweite Drehung um 360 °), und (C ) eine zusammengefügte Bild zeigt PGP-positive, nozizeptiven IENF (dritte Drehung um 360 °) in einer Hautprobe aus Fall 1. Bar = 20 um. Klicken Sie hier, um Film anzusehen.

    Abbildung3. Dreidimensionale (3D) Bild des axonalen Schwellungen in IENF von PN. Repräsentative 3D-Bild des axonalen Schwellungen (Pfeilspitzen) entlang IENFs von PGP mit einem grünen Signal bezeichnet und im Unterhautfettgewebe Plexus in einer Hautprobe aus Fall 2. Bar = 10 um. Klicken Sie hier, um Film anzusehen.

    Abbildung 4. Dreidimensionale (3D) Bild des axonalen Verzweigung in IENF von PN. Repräsentative 3D-Bild des axonalen Verzweigung (Pfeilspitzen) entlang IENFs von PGP mit einem grünen Signal bezeichnet, in einer Probe von Haut Fall 3. Bar = 20 um. Klicken Sie hier, um Film anzusehen.

    Komponenten von 5% BSA Blocking Solution: Betrag für 12,5 ml benötigt
    1X PBS 8.125 ml
    0,1% Triton X-100 (TX-100) [Finale Konzentration: 0,03%] 3,75 ml
    Bovine Serum Albumin (BSA) 0.625 g
    TOTAL 12,5 ml

    Tabelle 1. 5% BSA Blocking Solution.

    Komponenten von 1% Spüllösung: Menge für 12 ml benötigt
    1X PBS 8.625 ml
    0,1% TX-100 [Finale Konzentration: 0,03%] 3,25 ml
    Bovine Serum Albumin (BSA) 0,125 g
    TOTAL 12 ml

    Tabelle 2. 1% BSA Blocking Solution.

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    Discussion

    Messung der IENFD wurde weithin verwendet, um den Grad von peripheren Neuropathien 13,14 bestimmen. Derzeit ist die am häufigsten verwendete Protokoll misst nur die Dichten von Nervenfasern, die die Basalmembran der Epidermis eindringen, es nicht zu berücksichtigen axonale Verzweigung und / oder morphologische Veränderungen der Nerven. Darüber hinaus hat IENFD aktuellen Analyse nicht gezeigt worden, um mit dem Vorhandensein von Schmerzen in PN 15 IENFD korrelieren.

    Wir bereits berichtet, dass eine erhöhte Anzahl von nozizeptiven IENFD mit Schmerzen Verhaltensweisen in db / db-Mäusen, einem Mausmodell für Typ 2 Diabetes 5 zugeordnet sind. In diesem Bericht haben wir zunächst eine doppelte Immunfluoreszenz angewendet Protokoll nozizeptiven IENF studieren. In der aktuellen Studie, erweitern wir unser Protokoll für die menschliche Haut von Patienten mit PN. Die Doppel-Immunfluoreszenz-Analyse liefert Messungen sowohl insgesamt IENF und nozizeptiven IENF, die Teilmenge der IENFs, die vermittelnSchmerzen. Diese nozizeptiven IENF sind meist positiv für Trk A und andere nozizeptive Neuropeptide 5. Ähnliche doppelte Immunfluoreszenz Analyse für schmerzhafte Neuropathien wurde von Lauria und Kollegen 10 beschrieben worden. Sie berichteten reduziert IENFD für transient receptor potential Kationenkanals Unterfamilie V Teil 1 (TRPV1) bei Patienten mit schmerzhaften Neuropathien. Das aktuelle Protokoll könnte einen alternativen Ansatz zur Messung von nozizeptiven IENFD auf unsere tierischen Daten 5 basiert.

    Das aktuelle Protokoll bietet eine 3D-Ansatz für das Studium IENF Struktur. In Kombination mit Doppel immunofluorecent Analyse stellt die aktuelle Protokoll Methoden, um die Morphologie der nozizeptiven IENFs untersuchen. Frühere Studien haben einen Zusammenhang zwischen nicht Dichten oder Verzweigung der nozizeptiven IENF mit PN gemeldet. Hier zeigen wir, ein Protokoll für die Untersuchung axonalen Verzweigung und Schwellungen in IENFs der menschlichen Haut. Unsere 3D-Analyse deutet darauf hin, dass diese methode könnte verwendet werden, um die morphologischen Veränderungen in IENF PN studieren. Darüber hinaus könnte die 3D-Bildgebung von Current Protocols IENFD Messung durch die Vermeidung von Fehlern, die bei reduziertem Visualisierung der überlappenden Strukturen mit 2D-Bildgebung zugeordnet werden, zu verbessern.

    Axonal Schwellung als Erweiterung einer axonalen Abschnitt mit einem Durchmesser größer als das Zweifache des ursprünglichen axonalen Kaliber 16 definiert. Diese Struktur enthält Fragmente der axonalen Zytoskeletts und Komponenten der axonalen Transport. Axonal Schwellung wird als ein frühes Merkmal Neuropathie 6,16,17. Allerdings hat 3D-Analyse der axonalen Schwellungen Strukturen nicht in der Literatur beschrieben. Wie in Abbildung 3 dargestellt ist, könnte 3D-Bildgebung wichtige Erkenntnis für axonale Schwellungen mit PN verbundene Dienstleistungen zu erbringen.

    Es ist gut charakterisiert, dass axonale Verzweigung die Erholung von Nervenverletzung 18 begleitet. Allerdings ist dieverfügbar Methodik zur Quantifizierung axonale Verzweigung ist immer noch auf 2D-Bildgebung begrenzt basiert. Wie in Fig. 4 beschrieben, kann axonalen Verzweigung in dem gewundenen Art der Regenerierung Nerven kompliziert sein. Folglich könnte die Verzweigungspunkte durch nahe Nervenfasern verdunkelt werden, um die Genauigkeit der Quantifizierung beeinflussen. Die 3D-Bildgebung Analyse unserer Protokoll bietet eine verbesserte Visualisierung für Details der Verzweigung Nerven.

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    Disclosures

    Interessenkonflikte zu erklären.

    Acknowledgements

    Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health unterstützt Grants K08 NS061039-01A2, das Programm für Neurologie Research & Discovery, and The A. Alfred Taubman Medical Research Institute an der University of Michigan. Diese Arbeit verwendet die Morphologie und Bildanalyse Kern der Michigan Diabetes Research and Training Center, National Institutes of Health Grants 5P90 DK-20572 aus dem National Institute of Diabetes and Digestive und Nierenkrankheiten finanziert. Die Autoren bedanken sich bei Robinson Singleton und Gordon Smith (University of Utah) für die großzügige Spende von menschlichen Hautproben, die anfängliche Entwicklung des nozizeptiven Biomarker Immunhistochemie Technik unterstützt danken.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    10X PBS Fisher Scientific BP399-4 To make up 1X PBS
    Image-IT FX Signal Invitrogen I36933 Image-IT
    Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) AbD Serotec 7863-0504 PGP
    Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) R&D Systems AF1056 Trk A
    Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit Invitrogen A21206 AF488 donkey α-goat
    Alexa Fluor 647 donkey α-goat Invitrogen A21447 AF647 donkey α-goat
    Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich A7906-100 BSA
    Triton X- 100 Sigma-Aldrich T9284 TX-100
    Non-calibrated Loop LeLoop MP 199025 inoculating Loop
    96-well assay plate Corning Incorporated 3603 Well plate
    Prolong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36931 DAPI
    Microscope Cover Glass 22x22 mm Fisher Scientific 12-541-B Coverslips
    Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15 Microscope Slides
    Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope Olympus FV500 Confocal Microscope
    Optimum Cutting Temperature Sakura 4583 OCT
    Leica cryostat Leica CM1850 Cryostat

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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