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Immunology and Infection

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Summary

Monozyten abgeleiteten Makrophagen sind wichtige Zellen des angeborenen Immunsystems. Hier beschreiben wir eine einfach zu bedienende

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Erbel, C., Rupp, G., Helmes, C. M., Tyka, M., Linden, F., Doesch, A. O., Katus, H. A., Gleissner, C. A. An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization. J. Vis. Exp. (76), e50332, doi:10.3791/50332 (2013).

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Abstract

Monozyten abgeleiteten Makrophagen eine wichtige Zelltyp des angeborenen Immunsystems. Mausmodelle Studium Makrophagen Biologie leiden unter den phänotypische und funktionelle Unterschiede zwischen Maus und Mensch Monozyten-Makrophagen. Daher beschreiben wir hier ein in vitro-Modell zu erzeugen und zu studieren primären humanen Makrophagen. Kurz nach Dichtegradientenzentrifugation von peripheren Blut von einem Unterarm Vene gezogen werden Monozyten aus peripheren mononukleären Zellen mit negativen magnetischen Kügelchen Isolierung isoliert. Diese Monozyten werden dann sechs Tage lang unter speziellen Bedingungen kultiviert werden, um verschiedene Arten von Makrophagen-Differenzierung oder Polarisation zu induzieren. Das Modell ist einfach zu bedienen und umgeht die Probleme von artspezifischen Unterschiede zwischen Maus und Mensch verursacht. Weiterhin ist es näher an der in vivo-Bedingungen als die Verwendung von immortalisierten Zelllinien. Zusammenfassend ist die hier beschriebene Modell geeignet, um zu studieren macrophage Biologie, identifizieren Krankheitsmechanismen und neue therapeutische Targets. Obwohl nicht vollständig ersetzen Experimente mit Tieren oder menschlichen Geweben erhalten post mortem, ermöglicht die hier beschriebene Modell Identifizierung und Validierung von Krankheitsmechanismen und therapeutische Ziele, die von großer Bedeutung für verschiedene menschliche Krankheiten können.

Introduction

Monozyten abgeleiteten Makrophagen eine wichtige zelluläre Komponente der angeborenen Immunsystems und zur viele akute oder chronische entzündliche Prozesse 1. Makrophagen spielen eine wichtige Rolle in vielen entzündlichen Erkrankungen wie Arteriosklerose oder Krebs 2. Makrophagen zeigen einen hohen Grad an Plastizität und sind in der Lage, verschiedene Phänotypen in Abhängigkeit von der lokalen Mikromilieus 3 übernehmen. So studieren Makrophagen Differenzierung und Heterogenität ist für die Erhöhung unserer Kenntnis der Pathophysiologie vieler Krankheiten unerlässlich und Identifizierung neuer therapeutischer Targets und Entwicklung neuartiger Therapien zu ermöglichen.

In vielen Fällen sind murine Modelle verwendet werden, um die Pathophysiologie von bestimmten Krankheiten zu untersuchen. Allerdings ist das Studium der Biologie mit Makrophagen Mausmodelle durch mehrere Unzulänglichkeiten begleitet: (1) Der Anteil der Leukozyten Teilmenge Zahlen (dh Monozyten und Granulozyten) in peripHeral Blut von Mäusen oder Menschen unterscheidet sich deutlich darauf hindeutet, verschiedene Rollen von Monozyten in murinen und humanen Pathophysiologie. (2) Es gibt erhebliche Unterschiede in der Genexpression zwischen Maus und Mensch Monozyten im peripheren Blut hindeutet erhebliche Unterschiede in ihrer Funktion während Gesundheit und Krankheit 4. (3) Eine Reihe von Markern, die verwendet werden, um murine Monozyten und Makrophagen (F4/80, LyC, etc.) Identifizieren nicht in menschlichen myeloischen Zellen existieren, so dass die Übertragung von Erkenntnissen in Maus-Modellen der menschlichen Situation ziemlich schwierig werden.

So, um unser Verständnis der Makrophagen-Differenzierung und Heterogenität in der menschlichen Krankheit zu erhöhen, müssen wir die Verwendung von Modellen der Arbeit mit humanen Makrophagen zu machen. Daher beschreiben wir hier ein Modell der humanen primären Makrophagen Generation, die einfach zu bedienen ist und ermöglicht Untersuchung der menschlichen Monozyten-Makrophagen in vitro unter verschiedenen Bedingungen, die sich in verschiedenen Makrophagen poPolarisation Typen. In mehreren Studien haben wir die in-vitro-Modell von Monozyten abgeleiteten primären humanen Makrophagen verwendet, um Makrophagen Biologie und ihre mögliche Bedeutung für die menschliche Arteriosklerose 5-7 zu analysieren.

Obwohl nicht vollständig ersetzen Experimente mit Tieren oder menschlichen Geweben erhalten post mortem, ermöglicht die hier beschriebene Modell Identifizierung und Validierung von Krankheitsmechanismen und therapeutische Ziele, die von großer Bedeutung für verschiedene menschliche Krankheiten können.

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Protocol

1. Protokoll

  1. Planen Sie Puffer wie folgt:
    1. Planen Sie Puffer für PBMC Trennung: "Waschpuffer" = 0,02% EDTA in PBS (0,5 M EDTA Nutzung).
    2. Planen Sie Puffer für Monozyten Trennung: "MACS Spülpuffer" = 0,5% BSA (250 mg) + 2 mM EDTA (200 ul) + PBS (50 ml). Degas der Puffer.
    3. Planen Sie Puffer für FACS-Färbung und Lagerung der Zellen: "FACS-Puffer" = 10% FCS in PBS und "Fixierung Puffer" = 1% PFA in PBS.
  2. Unentschieden 30 ml Vollblut von einem Unterarm Vene. Verwenden EDTA als Antikoagulans.
  3. Isolieren PBMC (Histopaque) wie folgt:
    1. Bereiten Sie zwei sterile 50 ml Röhrchen (kein Poly-Styrol).
    2. Verdünnen das Blut aus Schritt 2 mit PBS 1:1 beträgt.
    3. 25 ml + 25 ml Histopaque Vollblut / PBS pro Röhrchen. Stellen Sie sicher, dass Histopaque und Blut nicht mischen.
    4. Zentrifuge bei 400 xg für 30 min bei RT, keine Bremse.
    5. Saugen Plasma und entsorgen.
    6. Saugen undurchsichtig Schnittstelle und Pipette in sauberen 50 ml Wannee.
    7. 20 ml 0,02% EDTA in PBS.
    8. Zentrifuge bei 250 xg für 5 min bei 4 ° C.
    9. Überstand verwerfen.
    10. 10 ml 0,02% EDTA in PBS.
  4. Zählen von Zellen wie folgt:
    1. Gut mischen durch Vortexen für 10 sec.
    2. Nehmen Sie 200 ul Zellsuspension + 300 ul 0,02% EDTA in PBS + 500 ul Trypanblau (200-500 Zellen/10 Quadrate, sonst ändern Verdünnungsfaktor).
  5. Führen negativen Isolierung von Monozyten wie folgt:
    1. Zentrifuge Zellen in Schritt 3,10 für 10 min, 120 x g erhalten. Überstand verwerfen.
    2. Waschen Zellpellet 2x durch Zugabe von 10 ml PBS + 0,02% EDTA und Zentrifuge für 10 min, 120 x g.
    3. In 9 ml sterilem Wasser für 3 Sekunden, 1 ml 10X PBS.
    4. Waschen Sie noch einmal mit PBS + 0,02% EDTA und Zentrifuge 10 min, 120 x g.
    5. Zählen Sie während der Zentrifugation.
    6. Verdünnen Sie in EasySep Puffer bei 5 x 10 7 / ml.
    7. In 50 ul / ml Monozyten Bereicherung SchwanzSchwanz.
    8. Inkubieren für 10 min bei 4 ° C.
    9. Vortex Perlen für 30 sek.
    10. In 50 ul / ml Perlen.
    11. Inkubieren für 5 min bei 4 ° C.
    12. Füllen Sie EasySep Puffer Volumen von 2,5 ml abzuschließen. Die Lösung scheint nun bräunlich.
    13. Setzen Sie in Magneten.
    14. Warten 2.5 min bei RT. Während dieser Zeit nicht Monozyten, gebunden an die magnetischen Kügelchen werden mit der Rohrwand bewegen und bleiben dort haften.
    15. Gießen Puffer mit unverbindlichen Monozyten in frischen sterilen Röhrchen. Diese Lösung sieht weißlich.
    16. Waschen einmal mit PBS + 0,02% EDTA und zentrifugieren für 10 min, 120 x g.
  6. Platte Zellen in einer Kunststoffschale oder mehrwandigen Platte mit einer Dichte von 0,5 x 10 6 / cm 2. 1 ml der Kultur media / 1 x 10 6 Zellen.
  7. Kultur Zellen unter Bedingungen von Interesse für 6-14 Tage.
  8. Ändern Medien nach 3 Tagen durch Austausch 50% der Medien mit frischem Medium (siehe Tabelle 1 für weitere Details).
  9. Nach sechs Tagen Ernte Zellen zur mRNA-Isolierung, Durchflusszytometrie, Western Blot, etc.

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Representative Results

Mit dem oben beschriebenen Protokoll, wir routinemäßig erhalten 25,1 x 10 6 ± 2,2 x 10 6 ml Blut monocytes/100 (Mittelwert ± Standardabweichung aus 26 unabhängigen Experimenten, 1A). Monozyten Reinheit durch durchflusszytometrische Färbung für CD14 bestimmt wird routinemäßig von mehr als 95% (97,1 ± 0,4%, mittlere ± Standardabweichung von 3 unabhängigen Experimenten, 1B). Die Lebensfähigkeit der Zellen von frisch isolierten Monozyten durch Trypanblau-Färbung bestimmt wird routinemäßig von mehr als 95% (Daten nicht gezeigt). Während zunächst Zellen runden und Schwimmer sind, sie beginnen in der Regel die Einhaltung innerhalb von wenigen Stunden. Die Einhaltung wird mit einer Formänderung in Richtung einer "Spiegelei" oder Spindel-Form (Abbildung 2) verbunden. Nach sechs Tagen in Kultur mit M-CSF (100 ng / ml) mit oder ohne Zusatz von oxidiertem LDL (100 ug / ml für die letzten 24 Stunden), sind etwa 80% der Zellen nicht lebensfähig oxLDL ausgesetzt, während treatment mit oxLDL führte in etwa 70% lebensfähige Zellen (Abbildung 3). Durchflusszytometrie nach sechs Tagen Kultur mit M-CSF zeigt, dass, während die Zellen, die die Leukozyten-Marker CD45RO halten, sie dem Monozytenmarker herunterregulieren CD14 (Abbildung 4). Besondere Bedingungen können Makrophagen induzieren Polarisation - also M1-oder M2-polarisierten Makrophagen exprimieren typische Marker wie IL-6, TNF-alpha (M1) oder CD36 und CD206 (M2) (Abbildung 5). Makrophagen können weiter in funktionelle Experimente untersucht werden. Zum Beispiel kann die Aufnahme von oxidiertem LDL studierte mit fluoreszierend Etiketten LDL (Abbildung 6).

Abbildung 1
Abbildung 1. (A) Die Zahl der peripheren Monozyten nach negativer Wulst Isolation erhalten. Zellzahlen sind normalisierend für 100 ml peripheres Blut. Daten von 26 unabhängigen Experimenten. (B) Die Reinheit der Monozyten unter Verwendung negativen Wulst Isolation mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Repräsentative Vorderseite Streudiagramm und ein Histogramm der CD14-Färbung, negative Kontrolle als gepunktete Linie dargestellt.

Abbildung 2
Abbildung 2. Zellen nach 3 und 6 Tagen Kultur mit M-CSF. Maßstab bar = 50 um.

Abbildung 3
Abbildung 3. Die Lebensfähigkeit von Makrophagen nach 6 Tagen in Kultur mit M-CSF oder nach 6 Tagen in Kultur mit M-CSF und oxLDL (100 ug / ml) zugegeben für die letzten 24 Stunden, wie durch Propidiumiodid (PI)-Färbung bestimmt. Repräsentative Vorderseite scAtter Plots und Histogramme für PI-Färbung.

Fig. 4
Abbildung 4. Durchflusszytometrie für die Monozyten CD14 auf frisch isolierten Monozyten oder Monozyten-Makrophagen nach sechs Tagen in Kultur mit M-CSF (100 ng / ml).

Abbildung 5
Abbildung 5. Gene Expression von IL-6, TNF-alpha, CD36 und CD206 (Mannose-Rezeptor) in primären humanen Makrophagen mit M-CSF (100 ng / ml, 6 Tage) und der polarisierte Richtung eines M1 Phänotyp (LPS, 100 ng / ml differenziert und IFN-gamma, 20 ng / ml, dann 18 h) oder M2 (IL-4, 20 ng / ml für die letzten 18 Stunden). Genexpressiongemessen mittels quantitativer PCR. * P <0,05, ** P <0,01.

Abbildung 6
Abbildung 6. (A) Immunfluoreszenzbild von M-CSF-induzierten Makrophagen humanen Makrophagen. Die Zellen wurden 10 ug / ml Dil-markierten oxLDL für 4 Stunden ausgesetzt. Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt. Maßstab bar = 50 um. (B) Repräsentative Histogramm der durchflusszytometrischen Messung von Dil-oxLDL-Aufnahme durch M-CSF-induzierte humanen Makrophagen. Grau = unbehandelte Kontrolle, schwarze Linie = oxLDL-behandelten Makrophagen.

<tr>
Typ Bedingungen Refs
M0
  • 6 Tage M-CSF (100 ng / ml)
7-8
M1
  • 6 Tage M-CSF (100 ng / ml) und LPS (100 ng / ml) und Interferon-γ (20 ng / ml)
oder
8
  • 6 Tage GM-CSF (50 oder 100 ng / ml)
oder
9-10
  • 6 Tage GM-CSF (50 ng / ml) und LPS (100 ng / ml)
oder
9
  • 3 Tage M-CSF (100 ng / ml) zuzüglich 3 Tage LPS (10 ng / ml) und IFN-gamma (50 ng / ml)
oder
10
  • 3 Tage GM-CSF (100 ng / ml) zuzüglich 3 Tage LPS (10 ng / ml) und IFN-gamma (50 ng / ml)
10
M2a
  • 6 Tage M-CSF (50 oder 100 ng / ml)
oder
9-10
  • 6 Tage M-CSF (100 ng/ Ml) und IL-4 (20 ng / ml) während der letzten 18 Stunden der Kultur
oder
8
  • 6 Tage XVivo10 (Cambrex) zzgl. IL-4 (10 ng / ml)
oder
10
  • 6 Tage M-CSF (100 ng / ml) und IL-13 (5 ng / ml)
8
M2b
  • 6 Tage M-CSF (100 ng / ml) und Immunkomplexen und TLR-Liganden
8
M2c
  • 6 Tage XVivo10 (Cambrex) zzgl. IL-4 (10 ng / ml)
10
M4
  • 6 Tage CXCL4 (1 uM)
7
M-Hb
  • 7 Tage autologen Serum und Hb-Hp-Komplexe (100 nm)
11
M-ox
12
Andere Arten Makrophagen
  • 14 Tage GM-CSF sowie TNF-alpha (0,5 ng / ml) von IFN-gamma (2,5 ng / ml) für 2 Tage gefolgt
13

Tabelle 1. Beispiel für die Bedingungen und typische Marker etabliert M1 oder M2 Makrophagen Polarisation Arten (siehe Referenzen für bestimmte Verfahren zur Isolierung oder Zellkultur Bedingungen).

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Discussion

Monozyten abgeleiteten Makrophagen sind der Schlüssel Zelltyp des angeborenen Immunsystems. Sie spielen eine wichtige Rolle in vielen entzündlichen Erkrankungen einschließlich Arteriosklerose oder Krebs 2. So studieren Makrophagen Biologie ist für die Erhöhung unserer Kenntnisse über die Pathophysiologie vieler Krankheiten wesentliche und für die Entwicklung neuer Therapien zu ermöglichen.

Viele Studien gelten von Mausmodellen Überexpression oder fehlen bestimmte Gene von Interesse. Im Falle von Monozyten abgeleiteten Makrophagen, scheint dies nicht der beste Weg, um Prozesse zu untersuchen Relevanz beim Menschen, wie es wesentliche Unterschiede zwischen murinen und humanen Monozyten und Monozyten-abgeleiteten Zellen 4 sind. Somit scheinen gültige Modelle unter Verwendung von primären humanen Zellen eine gute Alternative zu Krankheit relevanten Mechanismen von Makrophagen Differenzierung zu studieren.

Ein klarer Vorteil der In-vitro-Modell präsentiert hier ist, dass es nicht auf immortali verlassenzed Zelllinien wie THP-1 oder andere 14-15. Während Zelllinien kann leicht gewonnen und umgehen die Notwendigkeit regelmäßiger Blutabnahmen Zelllinien sind phänotypisch und funktionell nicht identisch mit primären Zellen. Somit Cho et al. Haben das Gen Signaturen von primären humanen Makrophagen verglichen und verglichen sie mit zuvor veröffentlichten Daten von THP-1 12,14 erhalten. Sie fanden eine signifikante, aber moderate Korrelation zwischen beiden Zelltypen darauf hindeutet, dass THP-1-Zellen möglicherweise nicht das ideale Modell zu Makrophagen Differenzierung und Heterogenität in vielen Fällen zu studieren. Außerdem gibt es verschiedene Modelle, wie nicht-adhärenten Monozyten wie THP-1-Zellen zu Makrophagen zu differenzieren. Selbst wenn Sie die wohl anwendbar Protokoll, in dem THP-1-Zellen mit PMA behandelt werden, gefolgt um fünf Tage ruhen in Kultur ohne PMA (PMAR), haben Zellen nicht ganz wie primäre Zellen verhalten 16. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse, dass für das Studium menschlicher KrankheitenMechanismen auf zellulärer Ebene scheinen primäre Makrophagen besser geeignet als Zelllinien.

Man muss sich bewusst sein, andere Methoden, die Isolation von primären humanen Monozyten erlauben: Einhaltung Kunststoff, positive Wulst Isolierung oder Gegenstrom Zentrifugation Elutriation 17. Die Monozyten Bereicherung Cocktail welche hier enthält Antikörper gegen CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123, Glycophorin A und Dextran-beschichteten magnetischen Partikeln. Diese Antikörper binden an Epitope auf Leukozyten als Monozyten, die anschließend binden können die magnetischen Teilchen und die in der Röhre durch das Magnetfeld gehalten, während des gesamten ungebundenen Monozyten in ein zweites Gefäß überführt werden kann. Weiterhin enthält die Anreicherung Cocktail Antikörper gegen humanes Fc-Rezeptoren (die einen hohen Grad von Monozyten), die nicht-spezifische Bindung an Monozyten zu verhindern. Dementsprechend liefert die hier vorgestellte Methode "unberührte" nicht-aktivierten Monozyten mit einem hohen Reinheitsgrad.

Es gibt einige Punkte, die im Auge behalten werden müssen, wenn die Anwendung dieses Modells. Ficoll / Histopaque Zentrifugation sollte bei Raumtemperatur durchgeführt werden. EDTA im Waschpuffer ies notwendig, Integrin-abhängige Bindung von Thrombozyten an Monozyten hemmen. Es ist wichtig, Saatgut der Monozyten an der richtigen Dichte, um eine optimale Differenzierung zu erreichen. Beide Seeder Monozyten zu locker oder zu dicht Ergebnisse in suboptimalen Wachstums und der Differenzierung. Optionen für Änderungen umfassen Aussäen der Zellen auf spezifische Substrate oder mit verschiedenen Wachstumsfaktoren (z. B. GM-CSF 18) oder Zugabe von bestimmten Zelle Aktivatoren (zB Zytokine oder LPS 8, Tabelle 1).

Verwendung von Zellen aus verschiedenen Individuen erhalten kann in einem größeren Ausmaß der Variation in Bezug auf bestimmte Zellfunktionen führen. So Martín-Fuentes et al. Haben gezeigt, dass Monozyten-Makrophagen von verschiedenen Individuen unterschiedliche Kapazitäten von LDL-Aufnahme 19 anzuzeigen. Interessanterweise bleiben diese Unterschiede im Laufe der Zeit darauf hindeutet, dass Unterschiede zwischen den Zellen von verschiedenen Spendern sind nicht stabilwegen der unterschiedlichen Versuchsbedingungen, sondern beziehen sich auf einzelne genetische oder epigenetische Unterschiede. Einerseits erfordert dies größere Variation größere Zahlen, um signifikante Ergebnisse in bestimmten Experimenten wie oxLDL Aufnahme zu erhalten. Im Gegensatz dazu, diese Unterschiede auch den Wissenschaftlern ermöglichen, Unterschiede zwischen gesunden und kranken Menschen auf zellulärer Ebene und verrät so Roman Krankheitsmechanismen zu studieren.

Insgesamt ist das hier beschriebene Protokoll einfach zu bedienen, reproduzierbar und nützlich, um sehr reine Monozyten Populationen, die dann in Richtung Makrophagen differenziert werden kann erhalten. In Abhängigkeit von den Kulturbedingungen, können verschiedene Arten von Monozyten-Makrophagen untersucht zur Identifizierung von spezifischen physiologischen oder pathophysiologischen Prozessen relevant für die menschliche Krankheit werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nicht zu einem Interessenkonflikt offen zu legen.

Acknowledgments

Wir danken Nadine Wambsganss für hervorragende technische Assistenz. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) und zum Teil durch einen Zuschuss von der Innovation Fund GRENZE (Universität Heidelberg) zu CAG unterstützt

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 ml centrifuge tube (sterile) Fisher 055398
D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium) Invitrogen 14190-250
EDTA Sigma T9285
BSA Sigma A-8806
FCS Invitrogen
EasySep Human Monocyte Enrichment Kit StemCell Technologies 19059
EasySep Magnet StemCell Technologies 18000
FACS tubes Fisher 352008
Macrophage-SFM (1X) Invitrogen 12065-074
Penicillin-streptomycin Sigma P-4458
Nutridoma-SP Roche 11011375001
human M-CSF 10 μg Peprotech 300-25
Cell Culture Plates 6-well Fisher 07-200-80

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References

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Comments

1 Comment

  1. We have been isolating cells with CD14 macs isolation and plating them for 3-4 hours to get adherent cells. We have been trying to isolate RNA from 1 million cells. We use the standard silica column kit for total RNA isolation( Nucleopsin RNA form Macherey Nagel). We get very low quantity of RNA (about 20 ng/ul) from about a million cells in a total elution volume of 30 ul ( total 600 ng from 1 million cells approximately). This is too low to use for making frist strand cDNA. Have you had any similar problems with RNA isolation or can you recommend a different method for RNA isolation. Also what is the RNA yield you normally get from monocytes/macrophages.

    Reply
    Posted by: Nikhil K.
    April 11, 2015 - 5:45 PM

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