Isolamento del liquido cerebrospinale da embrioni roditori per l'uso con sezionato espianti cerebrali corticali

Neuroscience

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Summary

Il liquido ventricolare cerebrospinale (CSF) bagna le cellule progenitrici neuroepiteliale e cerebrali corticali durante lo sviluppo iniziale del cervello nell'embrione. Qui si descrive il metodo messo a punto per isolare liquor ventricolare da embrioni di roditori di età diverse, al fine di indagare la sua funzione biologica. Inoltre, dimostriamo il nostro dissezione cerebrale espianto corticale e cultura tecnica che permette di crescita espianto con volumi minimi di terreno di coltura o nel liquido cerebrospinale.

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Zappaterra, M. W., LaMantia, A. S., Walsh, C. A., Lehtinen, M. K. Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants. J. Vis. Exp. (73), e50333, doi:10.3791/50333 (2013).

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Abstract

Il QCS è un fluido complesso con una proteoma varia dinamicamente durante tutto lo sviluppo e in età adulta. Durante lo sviluppo embrionale, il QCS nascente differenzia dal liquido amniotico alla chiusura del tubo neurale anteriore. Volume di CSF aumenta poi nei giorni successivi, come le cellule progenitrici neuroepiteliale che rivestono i ventricoli e del plesso coroide generate CSF. I contatti embrionali CSF apicale, superficie ventricolare delle cellule staminali neurali del cervello in via di sviluppo e il midollo spinale. CSF fornisce la pressione del fluido cruciale per l'espansione del cervello sviluppo e distribuisce crescita importante promuovere fattori di cellule progenitrici neurali temporalmente in un modo specifico. Per studiare la funzione del CSF, è importante isolare campioni puri di embrionale CSF senza contaminazione da sangue o tessuto telencephalic sviluppo. Qui, si descrive una tecnica per isolare campioni relativamente puri ventricolare embrionale CSF che possono essere utilizzati perun'ampia gamma di saggi sperimentali compresi spettrometria di massa, elettroforesi proteica, e coltura di cellule e espianto primaria. Dimostriamo come sezionare e cultura espianti corticali su membrane porose in policarbonato per crescere sviluppo del tessuto corticale con ridotti volumi di supporto o nel liquido cerebrospinale. Con questo metodo, gli esperimenti possono essere eseguiti utilizzando CSF ​​da varie età o condizioni per studiare l'attività biologica del proteoma CSF sulle cellule bersaglio.

Introduction

Il QCS è un fluido complesso che bagna la neuroepitelio sviluppo 1-6 e offre 7 essenziali pressione e promuovere la crescita spunti per lo sviluppo del cervello 8-12. Per studiare il QCS nel corso dello sviluppo del cervello, abbiamo sviluppato tecniche per isolare liquor ventricolare di sviluppare embrioni di ratto o il mouse durante le varie fasi di sviluppo 6,9. Metodi precedenti di isolamento incluso con una lente di micro-ago e isolamento del QCS con un micro-iniettore 1,2. Il nostro metodo utilizza un micro-capillare pipetta di vetro la cui punta è stato tirato per creare un punto ultrafine per la penetrazione nel tessuto migliore. Il micro-capillare pipetta di vetro è collegato ad un aspiratore modo che la raccolta liquor ventricolare può essere controllato con cambiamenti nella pressione dolci. Per studiare l'influenza delle cellule staminali di segnali CSF, si sezionare cerebrali corticali espianti, disporle su membrane in policarbonato, e galleggiare li cu appropriatemedia lture integrato con campioni di CSF 9. Con questa tecnica, ridotti volumi di supporti sono sufficienti per la coltura tissutale, consentendo un uso efficiente di CSF 9.

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Protocol

1. Embryo Isolamento / Preparazione

Questa tecnica può essere utilizzata per topo o ratto. In questo protocollo si dimostra la tecnica di raccolta QCS e cerebrale dissezione espianto corticale con cervello di topo embrionale. Ci osservazioni su eventuali differenze importanti rispetto a ratti topi che esistono all'interno delle tecniche generali. Per il sistema embrionale stadiazione età, E1 è classificato come il giorno della spina di ratti, e E0.5 è classificato come il giorno della spina di topi.

  1. Preparare un micro-dissezione piatto con elastomero Sylgard silicone. Sylgard 184 elastomero di silicone viene fornito come parte liquida a due componenti, parte A e parte B. Parte sono mescolati A e B parte in un rapporto di 10:1 in peso o volume. Dopo che i componenti liquidi vengono miscelati, versa l'elastomero Sylgard in una piastra di Petri a coprire l'intera superficie del piatto. Alcune bolle d'aria possono essere presenti che dissipare durante il processo di polimerizzazione. Mettere il coperchio sulla piastra di Petri e lasciare che il elastomer per curare. L'elastomero può essere indurita a temperatura ambiente per 24 ore, oppure a temperature più elevate (per esempio 37 ° C) per una più rapida polimerizzazione. Una volta che i componenti liquidi solidificano, il piatto dissezione è pronto all'uso. Il piatto può essere usato ripetutamente per esperimenti multipli, a condizione che sia ben pulita dopo la procedura.
  2. Preparazione del micro-pipetta capillare (ago). Micro-pipette capillari vengono preparati mediante l'applicazione di calore e tirare con un PC-10 verticale estrattore micropipetta Narishige con le seguenti impostazioni: Un tiro passo; Heater # 2 impostato a 58, 100 g di peso tiro. La punta fine della micropipetta è attentamente spense con pregiati N ° 55 pinze. Il risultante diametro medio interno della cannula è 85 micron.
  3. Preparare il gruppo aspiratore per l'aspirazione CSF. Inserire micro-stantuffo provvista di micro-pipette capillari nell'ago capillare. In alternativa, collegare un filtro di plastica monouso per la fine del gruppo del tubo aspiratore che è collegato to la micro-pipetta capillare. Spingere l'ago attraverso la guarnizione in posizione sul lato opposto del gruppo aspiratore.
  4. Trasferimento di embrioni isolati dalla cucciolata di un micro-dissezione piatto preparato con Sylgard.
  5. Togliere le membrane extra-embrionali e tessuti in modo che l'embrione è chiaramente esposta. Ogni strato di tessuto-prima la parete uterina e quindi la decidua, può essere sezionato con le forbici iridectomia fini (ad esempio strumenti per le scienze Belle # 15000-02). Ad ogni sito di impianto, la prima parete uterina, quindi la decidua può essere incisi parallelamente all'asse lungo dell'utero, e l'incisione può essere aperto ulteriormente utilizzando una pinza sottile. La decidua può essere rimosso dopo un'incisione simile, esponendo le membrane fetali. Si deve essere esercitato in modo che le membrane fetali non sono incise o perforato.
  6. Lavare con soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) e rimuovere il liquido in eccesso dal embrione circostante utilizzando una pipetta e un Kimwipe o filtrocarta tagliata in triangoli.

2. Collezione ventricolare CSF

  1. Visualizzare embrione al microscopio dissezione: per mouse, l'embrione deve essere che sul suo lato, in modo tale che si ha una vista sagittale dell'embrione. Con embrioni di ratto E16 o più, posizionare l'embrione sulla sua colonna vertebrale dorsale, lungo il suo dimensione planare, da un cranio in direzione caudale, come se l'embrione è sdraiato sulla schiena. In questo modo il CSF può essere raccolto sia da destra e sinistra ventricolo laterale.
  2. Costantemente inserire la micro-pipetta capillare nel ventricolo laterale, ventricolo mesencefalico o cisterna magna, tentando di non contattare le cellule neuroepiteliali volta la pipetta è stata inserita. Per E14.5 embrioni di topo o più, il CSF può essere aspirato dal ventricolo destro e quindi l'ago rimosso e inserito nel ventricolo sinistro. A causa della pervietà dei ventricoli e il tubo neurale in embrioni più giovane di E14.5, ilintero volume del CSF può spesso essere aspirato dai ventricoli laterali con l'inserimento di un ago singolo. Tuttavia, questo non è sempre il caso come tempi di sviluppo e la pervietà dei ventricoli collegamento può variare leggermente, e quindi, il micro-pipetta capillare può anche essere inserita nella cisterna magna per raccogliere il massimo volume CSF.
  3. Una volta che il micro-pipetta capillare viene inserita nel ventricolo laterale, ventricolo mesencefalico o cisterna magna, attenzione e delicatezza iniziare l'aspirazione del CSF nella pipetta, utilizzando il micro-stantuffo per creare pressione negativa e aspirare il CSF, o fornendo una leggera pressione negativa creata per via orale in modo tale che CSF inizia a fluire dolcemente nel micro-pipetta capillare in modo lento e controllato. Si raccomanda che lo spettatore controlla con propri funzionari locali in materia di politiche istituzionali di questi approcci.
  4. Continuare ad applicare pressione negativa e raccogliere il liquor nella micro-capillare pipetta.In entrambi embrioni di topo e ratto di E16.5/E17 o più giovane, è possibile osservare il collasso ventricolo leggermente dalla comparsa di un divot formando sul lato della testa che il micro-pipetta capillare è dentro In anziane embrioni, a causa della maggiore dimensione del cervello, potrebbe non essere possibile osservare la testa collasso.
  5. Interrompere l'applicazione di pressione e rimuovere delicatamente la micro-capillare pipetta dal ventricolo laterale.
  6. Delicatamente espellere il campione CSF in una provetta Eppendorf che è stata raffreddata su ghiaccio.
  7. Continua la raccolta del QCS da una intera cucciolata di animali e in comune i campioni nel tubo stesso.
  8. Centrifugare a 10.000 xg a 4 ° C per 10 minuti per eliminare cellule contaminanti.
  9. Analizzare i campioni per eventuali segni di contaminazione cellule neuroepiteliali o globuli rossi. I segni di contaminazione sono di solito indicati dal fluido che appare torbida o rosso / rosa, o la presenza di un pellet con una macchia di sangue tinta. Dopo centrifugazione, il CSF possono essere esaminate al microscopio per le prove di cellule o detriti cellulari. Se ci sono segni di contaminazione del fluido deve essere eliminato. Come controllo aggiuntivo, il contenuto di pellet possono essere colorati per cellule. Un campione pulito CSF ​​può essere usato per la coltura cellulare, cultura corticale, spettrometria, western blot, ELISA, saggi e altri. Il QCS chiara dovrebbe essere trasferito in una nuova provetta sterile Eppendorf. Il campione può essere utilizzato per l'analisi, in pool con altri campioni o SNAP congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C. Il congelamento e lo scongelamento di piccoli campioni di fluido può provocare una diminuzione piccolo volume e cambiamenti nella concentrazione di proteina. Ciò può essere evitato liofilizzazione dei campioni.

3. Espianto Dissection corticale

  1. Trasferire la E14.5 embrione isolato dalla cucciolata su un micro-dissezione piatto preparato con Sylgard.
  2. Rimuovere embrione da membrane extra-embrionali e tessuti, come descritto al punto 1.5.
  3. <li> lavaggio con soluzione sterile salina bilanciata di Hanks (HBSS) e rimuovere il liquido in eccesso dal embrione circostante utilizzando una pipetta.
  4. Sezionare attraverso la regione cervicale separa la testa dal resto dell'embrione (Figura 1A).
  5. Usando un bel bisturi (bisturi oftalmico), tagliare lungo la linea mediana del cuoio capelluto. Afferrare entrambi i lati di questa incisione con una pinza sottile e togliere la pelle. Successivamente, usare le forbici iridectomia per fare un'incisione che corre la lunghezza della linea mediana del cranio in via di sviluppo. Successivamente, fare due incisioni aggiuntivi, circa 1/3 della distanza fra le estremità anteriore e posteriore del cranio sviluppo. Utilizzare una pinza sottile di cogliere i "lembi" del cranio che derivano da questa parte della dissezione, e rimuovere il tessuto in via di sviluppo cranio, esponendo la corteccia (Figura 1B).
  6. Utilizzo del bisect bisturi il cervello lungo la linea mediana a metà piano sagittale, che separa gli emisferi destro e sinistro corticali (figure1B, C). La pia e aracnoide sono lasciati aderenti alla corteccia, e la dura madre viene rimosso insieme con il cranio in via di sviluppo.
  7. Preparare ogni emisfero corticale separatamente. Posizionare il lato mediale dell'emisfero in modo che si può vedere l'eminenza gangliare e la corteccia in via di sviluppo (figure 1 C, D).
  8. Utilizzando il bisturi, fare una incisione coronale attraverso il neuroepitelio corticale caudale al bulbo olfattivo in via di sviluppo. Questa incisione dovrebbe iniziare al confine anteriore delle eminenze ganglionari mediale e laterale, e si estendono attraverso la regione cingolata anteriore del rudimento di sviluppo corticale (Figura 1E).
  9. Fai un'altra incisione coronale appena caudalmente al confine posteriore dell'eminenza gangliare laterale (Figura 1F). Questa incisione dovrebbe estendersi anche dal limite laterale della eminenza gangliare alla parete mediale del rudimento di sviluppo corticale.
  10. Ritrarre la corticale crea "flap"ta dalle due incisioni fatte a passi 3,7 e 3,8, con una leggera pressione bisturi o da un flusso di HBSS consegnati con una pipetta 200 pl per evitare danni meccanici alla corteccia. Poi fare una incisione trasversale lungo il confine che separa l'eminenza laterale gangliare dalla corteccia di sviluppo (Figure 1G, H). Poi, sezionare via di sviluppo e l'ippocampo orlo corticale del telencefalo mediale, all'apice della neocorteccia dove la superficie laterale e parete corticale interemisferica.
  11. Fare una incisione trasversale lungo il confine che separa l'eminenza laterale gangliare dalla corteccia di sviluppo (Figura 1H).
  12. Rimuovere qualsiasi tessuto sezionato supplementare che è sul piatto Sylgard dal espianto sezionato corticale. Si può usare pipettaggio gentile con tampone HBSS fresco per pipettare via qualsiasi tessuto sezionato in più. La corteccia è sezionato con il lato rivolto verso il basso meningea (Figura 1I).

  1. Preparare un anello di filo di platino collegato ad una pipetta di vetro. Riscaldare la pipetta di vetro con un filo di platino ripiegato inserito nell'estremità della pipetta di vetro. Ruotando la fine del ciclo filo di platino, la dimensione del ciclo può essere aumentato o diminuito, e il ciclo può essere sagomato per adattarsi alle dimensioni del espianto desiderato. (Questo può essere preparato in anticipo e riutilizzati.)
  2. Riscaldare l'estremità del filo di platino per sterilizzare il loop.
  3. Isolare l'espianto sezionato corticale e rimuovere il supporto HBSS supplementari pipettando dolce, lasciando una piccola quantità da utilizzare con il gancio di metallo.
  4. Inserire un centimetro 1 membrana in policarbonato in un piatto di 4 cm di diametro di imaging.
  5. Utilizzando il lato del cappio di filo di platino, capovolgere delicatamente la corteccia in modo che il lato rivolto verso l'alto meningea.
  6. Sollevare l'espianto corticale fuori del piatto dissezione, ponendo l'espianto a metà del ciclo e con le forze idrostatiche intrinsecisollevare l'espianto su una superficie piana.
  7. Delicatamente il espianto sulla membrana di policarbonato, e sollevare l'anello del filo di platino distanza tale che l'espianto rimane sulla membrana in piano con la superficie ventricolare fare contatto con la membrana.
  8. Sollevare delicatamente la membrana e pipettare 50 pl di CSF o altri mezzi di comunicazione sotto la membrana.
  9. Coprire il piatto di imaging, collocarlo in un contenitore umidificato secondaria, e incubare a 37 ° C in 5% CO 2 per 24 ore a sostenere continua proliferazione cellulare e la crescita espianto. Figura 2 rappresenta uno schema della preparazione finale corticale piatto espianto.

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Representative Results

La raccolta CSF dovrebbe produrre un chiaro, fluido trasparente. Non ci dovrebbero essere tracce di contaminazione da sangue, come dimostrato da un fluido tinta rosso o giallo nell'aspirato e nel tubo Eppendorf. Ci dovrebbe anche essere alcuna prova di tessuto in aspirazione e il tubo Eppendorf. Quando il CSF viene centrifugata, si può anche valutare la CSF microscopicamente per garantire che non vi è alcuna contaminazione. Se ci sono segni di contaminazione, il QCS deve essere eliminata. Da una cucciolata E14.5 il mouse, si può anticipare la raccolta 10-15 CSF pl. Tabella 1 illustra volumi medi di CSF raccolti dalle dimensioni dei cuccioli media nei topi e nei ratti di varie epoche embrionali. Quando puri campioni di CSF sono stati raccolti, il CSF può essere analizzata utilizzando un numero di tecniche diverse. Figura 3 mostra un rappresentante gel colorato con argento 2UG di topo E14.5 CSF.

Espianti cerebrali corticali può essere coltivata spiritoh variando volumi di CSF più un mezzo di base, se necessario, in modo che il volume totale di 50 microlitri. Figura 4 mostra espianti coltivati ​​rappresentativi con 50 pl di 100% embrionale CSF per 24 ore. Gli espianti hanno dimostrato di sopravvivere e proliferare con 100% CSF e devono istologia tessuto simile a embrioni roditore alla stessa età gestazionale 9, come indicato dalla immunoreattività di fosfo-istone H3 (PH3), un marcatore di divisione cellulare, lungo la ventricolare superficie, BrdU, un marker della sintesi del DNA, incorporazione lungo la zona ventricolare, e Tuj1, un marcatore neuronale, nella piastra di sviluppo corticale.

Sprague Dawley Età lettiera embrionali Volume per parto CD1 Età lettiera embrionali Volume per parto
E13 30-50 microlitri E10.5 15-20 microlitri
E14 40-75 microlitri E12.5 15-20 microlitri
E16 50-90 microlitri E14.5 10-15 microlitri
E18 40-75 microlitri E16.5 Microlitri 5-10

Tabella 1. Volumi medi dei CSF ottenuti dagli standard Cucciolate Sized.

Figura 1
Figura 1. Schema Struttura cerebrale corticale Dissection Espianto.

Figura 2
Figura 2. Diagramma schematico di Preparazione piatto finale.


Figura 3. Argento macchia di mouse E14.5 CSF. Questa è una macchia di argento rappresentante 2UG topo E14.5 CSF proteina eseguito su 4-12% Bis-Tris NuPAGE gel gradiente da Invitrogen. Colorazione d'argento fatto con kit SilverQuest colorazione argento sviluppato per 5 min 40 sec.

Figura 4
Figura 4. E15 espianti corticali del ratto coltivati ​​per 24 ore. Queste sono le immagini rappresentative di espianti cerebrali corticali coltivate per 24 ore in 100% embrionale CSF. Tali espianti sono stati fissati con il metodo di Carnoy, paraffina sezionati, e preparati per immunostaining. PH3 (rosso), e Tuj1 (verde), BrdU (blu).

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Discussion

Il metodo descritto per la raccolta ventricolare CSF ha prodotto campioni relativamente puri embrionale CSF con composizione proteica stabile e consistente attività in un certo numero di saggi cellulari 9. Con una tecnica buona raccolta e la prole di dieci E14.5 topi, ci si può aspettare di raccogliere 10-15 ml di CSF, e da una cucciolata di ratti E16, si può aspettare di raccogliere circa 50-90 ml di liquido cerebrospinale. Questa tecnica di raccolta minimizza la contaminazione da sangue e dei tessuti, attraverso l'osservazione attenta, centrifugazione, e scartando dei campioni con qualsiasi evidenza di detriti cellulari o tinta di sangue. Abbiamo analizzato il liquido al microscopio per valutare per detriti cellulari o cellule all'interno del CSF dopo centrifugazione, e ha scoperto che i campioni che non hanno pellet dopo centrifugazione sono esenti da contaminazione cellulare. In contrasto con il proteoma del tessuto cerebrale di sviluppo o di campioni di CSF contaminati (dati non mostrati), utilizzando questo metodo di estrazione CSF,il proteoma CSF non contiene proteine ​​mitocondriali se analizzati con uno spettrometro di massa 6.

Sulla base della localizzazione fisica del QCS ventricolare all'interno delle vescicole telencefalici e il tubo neurale, l'unico metodo di isolamento è di perforare attraverso la pelle in via di sviluppo, cranio, e telencefalo. Pertanto, l'inserimento dell'ago attraverso questi tessuti è una fonte di contaminazione. La punta dell'ago deve essere il più sottile possibile, in modo tale che l'ago può essere agevolmente inserito attraverso il tessuto e nel ventricolo. Il micro-pipetta capillare può raccogliere tessuto all'interno del foro dell'ago durante l'inserimento dell'ago nel ventricolo. A seconda dell'età dell'embrione, e se del plesso coroide è sviluppato all'interno del ventricolo, è importante non aspirare contenuto del plesso coroide nella pipetta. Tuttavia, è importante creare sufficiente pressione negativa tale che il CSF raccoglie in tegli pipettare, senza disturbare il tessuto circostante cervello in via di sviluppo o plesso coroide. La presenza di contaminazione di tessuti possono essere visualizzate sotto il microscopio da dissezione, pipettando CSF ​​su un vetrino con un vetrino di vetro e la visualizzazione diretta di detriti cellulari.

I metodi che descrivono per l'isolamento CSF ​​fornire campioni relativamente puri della CSF come abbiamo determinato fino ad oggi. Quando noto campioni di CSF contaminati sono stati analizzati mediante spettrometria di massa, hanno rivelato la presenza di proteine ​​mitocondriali (dati non mostrati). Un difetto insito nella tecnica è che il CSF è ottenuto perforando il cranio sviluppo e corteccia, e quindi le cellule e tessuti possono essere presenti nel CSF. Mediante centrifugazione del CSF, saggiando per un pellet, e microscopicamente analizzando il CSF al microscopio, abbiamo ottimizzato un metodo per l'isolamento CSF ​​che produce campioni relativamente puri di CSF.

La tecnica fo ventricolare embrionale CSF raccolta e espianti cerebrali corticali è stato descritto ed illustrato nel film per un mouse embrionale. Tuttavia, questa tecnica può essere utilizzata per la raccolta ventricolare CSF e espianti cerebrali corticali embrionali da tutti i roditori ed è stato applicato a ratti e topi. Il metodo descritto in questo protocollo è stato progettato specificamente per l'isolamento di CSF ventricolare, e non è destinato per la raccolta del CSF nello spazio subaracnoideo.

La tecnica per espianti cerebrali corticali è stato creato per essere in grado di crescere espianti con un volume ridotto di supporto, date le limitate quantità di CSF embrionale disponibile per gli esperimenti individuali. Il più piccolo volume di terreno utilizzato per la coltivazione espianti affidabile per 24 ore era di 50 microlitri. Di tanto in tanto, espianti sono stati coltivati ​​per più di 24 ore, con il periodo più lungo di essere 72 ore. Con più lunghi esperimenti, si consiglia di integrare i mezzi di crescita ogni 24 h. Una volta che gli espianti are coltivate per il periodo di tempo desiderato, gli espianti possono essere utilizzati per una serie di vari metodi compresi immunofluorescenza, generando neurosfere, morte cellulare, o l'estrazione di RNA.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Acknowledgements

Siamo grati per il sostegno del NIH (numeri di aggiudicazione R00 NS072192 a MKL, HD029178 a AS.L., e 2 RO1 NS032457 a CAW). MKL è il destinatario l'Ospedale dei Bambini di Boston Career Development Fellowship / Harvard Fellowship Shore Medical School e membro della Alfred P. Sloan Foundation. CAW è un ricercatore del Howard Hughes Medical Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wiretrop II capillary needles Drummond Scientific #5-000-2020
Sylgard Ellsworth Adhesives #184 SIL ELAST kit
Aspirator tube assembly Sigma #A5177-5EA
Disposable filter Venturi or local pharmacy not available Standard cigarette filter
Roundstock opthalmic knife (15 degree stab knife) World Precision Instruments, Inc. #500250
35mm glass bottomed culture dish MatTek Corp. #P35G-1.5-14-C
Platinum-iridium wire Tritech Research #PT-9010-010-3FT
Nuclepore Track-Etch Membrane Whatman #09-300-57
Hanks Balanced Salt Solution Fisher Scientific #SH30031.FS
Iridectomy Scissors Fine Science Tools #15000-02

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References

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