Geliştirme, Genişleme ve * These authors contributed equally

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu protokol, geliştirme, genişleme ve hESC ve iPSCs türetilen NK hücreleri, in vivo görüntüleme açıklar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bock, A. M., Knorr, D., Kaufman, D. S. Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs). J. Vis. Exp. (74), e50337, doi:10.3791/50337 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Biz bir besleyici içermeyen bir yaklaşım kullanarak farklılaşmamış hESC ve iPSCs doğal öldürücü (NK) hücreleri türetmek için bir yöntem mevcut. Bu yöntem, 4 hafta kültürden sonra NK hücreleri, yüksek düzeyde sebebiyet verir ve yapay antijen sunan hücreler ile daha fazla 2-Geçmiş genişleme tabi olabilir. Bu sistemde geliştirilmiş hESC ve iPSC türetilmiş NK hücreleri, olgun fenotip ve fonksiyona sahiptir. Genetik olarak değiştirilebilir, NK hücreleri çok sayıda üretim hem temel hem mekanistik hem de anti-tümör çalışmaları için de geçerlidir. HESC kaynaklı NK hücrelerinde ateşböceği lusiferaz ifade non-invaziv bir yaklaşım NK hücre nakli, dağıtım, ve fonksiyon izlemenizi sağlar. Ayrıca, iki farklı hücre popülasyonlarının ayrı izleme daha belirgin bir biçimde in vivo etkileşimlerini karakterize sağlayan bir çift görüntüleme düzeni açıklanmaktadır. In vivo görüntüleme türetme, genişleme, ve çift bu yöntem güvenilir bir NK hücreleri üretmek için bir yaklaşım ve değerlen sağlarMevcut NK hücre evlatlık tedaviler geliştirmek için gereklidir tirme.

Introduction

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) sınırsız kendini yenileme ve çok soy farklılaşma yeteneğine sahip farklılaşmamış, pluripotent hücrelerdir. hESC başarıyla 1-3 hematopoetik sistem hücreleri dahil olmak üzere her germ tabakasının olgun ve işlevsel alt, içine ayırt edilmiştir. Doğal öldürücü (NK) hücreleri, stromal hücre hatları 1,2,6-8 ile embriyoid cisimlerin formasyonu (EBS) 4,5 ya da ko-kültür ile hESC elde edilebilir doğuştan gelen bağışıklık sistemi lenfositlerdir. NK hücreleri, anti-viral ve anti-tümör özellikleri sahiptir ve önceden antijen stimülasyonu bunların efektör fonksiyonları gerçekleştirmek için gerekli olmayacağı için, maligniteler geniş bir yelpazesine karşı etkili olma potansiyeline sahiptir. Bu nedenle, hESC elde edilen NK hücreleri immünoterapi için bir hücre için cazip bir kaynak bulunmaktadır. Ayrıca, hESC NK hücrelerinin türetme normal gelişimini incelemek için bir genetik mükellef sistemi sağlar <em> in vitro.

Bir genetik uysal sistemi sağlamak için, hESC elde edilen NK hücreleri deneysel olarak in vitro ve in vivo olarak NK hücre efektör fonksiyonlarını incelemek için bir optimal model sağlayan flüoresan ve biyolüminesans muhabir ifade için modifiye edilebilir. hESC elde edilen NK hücreleri, HIV 9, lösemi (K562) ve diğer kanser türlerinde 7,8 dahil olmak üzere hedef bir dizi karşı etkinliğe sahiptir. Bununla birlikte, bu verimli bir şekilde daha az bir ölçüde, NK hücre gelişimi ve anti-kanser fonksiyonları in vivo çalışmalarda geniş bir klinik öncesi için bir sınırlama, hastaların tedavisinde kapasitesine kadar NK hücreleri klinik çeviri için önemli bir engel olmaya devam etmektedir ve bir edilmesidir. Burada, hESC 4,5,10 gelen hematopoetik atalarıdır elde etmek için bir spin EB yaklaşım kullanın. 11 gün sonra sıkma EBS 28 gün boyunca besleyiciler olan veya olmayan NK hücre kültürü aktarılır. NK hücre kültür ortamı içinde 4 hafta sonra, NK hücrelerinin tran vardıryapay antijen sunan hücreler (aAPCs) olarak görev yapar, membrana bağlı, interlökin 21 (IL-21) ifade etmek için modifiye K562 hücreleri ile birlikte-kültür sferred. Bu yapay APC 11,12 ile periferik kan NK hücrelerinin genişlemesi için bir protokol uyarlanması, biz olgun bir fenotip ve sitotoksik özellikleri koruyarak NK hücreleri 2-günlükleri genişletmek edebiliyoruz.

Gelişme ve genişleme süreci vivo karakterizasyonu geniş için yeterli hESC elde edilen NK hücreleri sağlar. In vivo çalışmalar için, ifade non-invaziv enjekte ateşböceği lusiferaz uzun vadeli uyumunu ve kinetik takip edebiliyoruz (Fluc +), biyolüminesans görüntüleme kullanarak hESC kaynaklı NK hücreleri. Ayrıca, bir çift, biyolüminesans veya floresan görüntüleme düzeni kullanarak tümör hücreleri ile NK hücre etkileşimleri takip edebiliyoruz. Grubumuz tarafından önceki bir çalışmada tümör ilerlemesi ve cle takip için bir anti-tümör modelinde biyoparlaklık görüntüleme kullanılanin vivo 7 Fluc + K562 hücrelerinin arance. Şimdi, ifade ateşböceği lusiferaz 13,14 için hESC mühendislik tarafından biz son zamanlarda karakterize floresan proteini, turboFP650 15 ifade K562 tümör hücrelerine NK hücrelerinin biodistribution ve ticareti takip edebilirsiniz. Biz aynı anda in vivo iki hücre popülasyonlarının (Şekil 1) takip etmek için bu ikili muhabir sistemi seçtiniz. En çift görüntüleme modelleri çift lusiferaz sistemleri olmuştur, ancak bu sistemlerin teknik nedeniyle coelenterazine teslim ihtiyaçlarına zor olabilir, yüzey en Renilla ve Gaussia lusiferaz gazetecilere 16-18 ifadesi için gerekli. Floresan gazetecilere birçok hücre hatları ve in vitro yapıları kolay izleme izin, ama nedeniyle doku ve kürk otofloresans ve birçok işbirliği emisyon spektrumları arasındaki örtüşme in vivo görüntüleme için sınırlı başarı elde ettimmonly GFP, DsRed ve tdTomato 15,19 dahil olmak üzere floresan gazetecilere kullanılır. Bu endişe daha iyi doku penetrans ve arka plan 15,19 göre daha yüksek belirli bir sinyal için izin uzak-kırmızı floresan proteinleri, gelişimini teşvik etmiştir. TurboFP650, bu sistem gösterilen floresan proteini, uzak-kırmızı değiştirdi ve yaşayan hayvanlarda görüntüleme floresan proteinleri ile ilgili sorunların çoğu üstesinden gelir.

HESC elde edilen NK hücreleri geliştirmek ve genişletmek için bu yöntem bize daha fazla in vitro ve daha iyi mevcut NK hücre evlatlık tedaviler geliştirmek için NK hücre fonksiyonu ve klinik olarak önemli anlamak için gerekli in vivo, in hESC elde edilen NK hücreleri karakterize etmek için izin verdi. Ayrıca türetme ve iPSC kökenli NK hücrelerinin genişlemesi için müsait. Çift Floresan ve biyolüminesans görüntüleme düzeni burada göstermiştir anti-tümör modeli başka sistemlere genel olarak uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Spin EB Kültürler TrypLE içinde hESC veya iPSCs uyarlanması

  1. Kollajenaz-geçişli kültürlerden ES / iPS koloniler nispeten küçük ise TrypLE ile ilk ayrışma iyi çalışır. / IPS nüfus hücreleri olmalıdır başlangıç ​​ES 4-5 gün önceki daha uzun geçti. TrypLE geçiş başlamadan önce 4-5 gün sonra, hücreler, 4 gün süre ile ~% 70 konfluent sağlayacak bir yoğunlukta ES hücreleri geçmektedir. TrypLE-geçişli ES hücre kültürü için düzenli ES ortamı kullanın. Burada, stabil bir lusiferaz muhabiri yapı (Malzeme Tablo) ile modifiye hESC kullanıyorsunuz. Protokol ayrıca hematopoetik progenitör hücre ve NK hücre gelişimi karşılaştırılması için değiştirilmemiş iPSCs kullanarak, iPSCs ile çalışır.
  2. TrypLE geçiş başlamadan önce dört gün, normal bir geçit protokolü takip, kollajenaz IV ES / iPS hücreleri geçmektedir. Biz genellikle TrypLE ile ilk geçiş 1:1 geçmek. Buna göre önceden ES / iPS hücreleri genişletin.
  3. 5 hücre / kuyu da 6-kuyucuğu TrypLE geçit plakası MEFS başlatılmadan önce bir gün. TrypLE ile ilk geçit (sabit-uyum hücre hatları için veya daha az yoğun kültürleri ya da 2:1), 01:01 geçirin. Bu nedenle, TrypLE kültürüne koyarak planlıyoruz her ES / iPS plaka için 1 MEF tabak hazırlamak.
  4. Dikkatli TrypLE ayrışma geçmeden önce farklı koloniler (bir sınırlı sınır eksikliği veya fibroblastik / epitel özelliklere sahip olanlar) koparmak. Farklılaşmış hücre TrypLE geçişi ile nispeten kolay kültürü üzerinden alabilir, bu nedenle başlangıç ​​nüfus çok temiz olduğundan emin olmak önemlidir.
  5. Kuyulardan medya aspire ve 1.0 ml önceden ısıtılmış TrypLE başına iyi seçin ekleyin.
  6. 37 ° C inkübatör 5 dakika TrypLE içinde inkübe ES / iPS hücreleri. 5 dakika sonra, kuyunun dibinde kapalı hafifçe pipet ES hücrelerinin.
  7. Kuyulardan TrypLE hücre süspansiyonu toplayın ve bir konik tüp transferi. Ge aşağı Pipet vently 2-3 kez en büyük kümeleri bozmaya teşvik etmek. En az 1 eşit miktarda ES medya ve 1 eşit hacmi DPBS ile TrypLE sulandırmak. TrypLE kültür ortamı ile söndürüldü, bu nedenle levha hücreleri kaldırdıktan sonra ortam ve DPBS ile TrypLE sulandırmak için önemli değildir. Biz ES medya kaydetmek için yıkama için DPBS + ortam kullanın.
  8. Soğutmalı santrifüj 5 dakika (8 ° C) için 1.500 rpm hücreleri aşağı doğru döndürün.
  9. TrypLE kaldırmak için kadar süpernatant mümkün kapalı aspire.
  10. 4 ml ES medya artı 4 ml DPBS ve TrypLE kalan izleri kurtulmak için dönüş tekrar içinde süspanse edin hücreleri.
  11. Kaplama için uygun hacim ES medyada süpernatant ve tekrar süspansiyon kapalı aspire.
  12. Plaka ES hücrelerinin 01:01 ES medyada düşük yoğunluklu MEFS üzerine (yada 2:1 gerekirse).
  13. 24 saat sonra, taze bir ortam ile ES hücreleri beslemek. Büyük olasılıkla eklemek değil birçok tek hücre olacak. ES medya ile günlük ES hücrelerinin besleyin.
  14. Taze MEFS (0,9-1 x 10 üzerine TrypLE ile geçmek (örneğin Salı ve Cuma) yukarıdaki gibi aynı temel prosedürü kullanarak. Normalde, TrypLE geçti hücreleri almak zorunda olmamalıdır.
  15. Ilk birkaç geçişleri için (en fazla 5-10 geçit), hücreler 1:1 'geçen gerektirir. Bu hücrelerin genişlemesi zorlaştırır. Bizim tecrübelerimize göre, ES hücrelerinin verimliliği kaplama 4-5 geçişleri etrafında ciddi anlamda düşüyor ve daha sonra geçişleri birkaç içinde geri gelir. Pasajlar 5-7 sonra, sonunda 1:3 1:2 de hücreleri geçen başlamak mümkün olabilir ve. Geçit 20 ötesinde, 1:5, veya 01:06 de hücreleri geçen başlamak gerekebilir. Levha, yüksek yoğunluklu bir ilk 5-10 pasajlara ES hücreleri emin olun. Bir kez bir noktaya nereden aşağı verimli yeterli onlar geçtikten sonra, 1:2 sizin de geçen başlatmak için deneyebilirsiniz, ve sonunda ya da 01:03 da geçmek gerekir iki gün içinde ~ 70% izdiham ulaşabilirsiniz hücreleri plaka 01:04. iPSCs, özellikle, bir tam olarak daha önce yoğun yeterli geçişli değilsedapted, ayırt etmek eğilimindedir.

2. Spin EB Kültürler Kurma için Stok Çözümler hazırlayın

  1. IMDM% 10 BSA çözeltisi: 35 ml IMDM (50 ml konik olarak) BSA, 4 g askıya alınması. BSA tam olarak çözünmesi için 1-2 saat boyunca oda sıcaklığında kalması çözeltisi izin verin. % 10 nihai konsantrasyon elde etmek için IMDM ile 40 ml toplam hacmi ayarlayın. Ticari olarak temin edilebilen BSA ES hücrelerine sitotoksik olabilir. Çözüm Deiyonizasyon sitotoksisite potansiyelini azaltabilir. , Deiyonize BSA çözüm 40 ml ~ 1.3 g reçine boncuk eklemek ve karıştırmak için de sallamak.
  2. 4 yer BSA çözüm (reçine boncuk ile) ° C mavi-yeşil (değişim kapasitesi tükendiğini belirten) sarı boncuk renk değiştirir kadar.
  3. Çözüm alışverişini kolaylaştırmak için her 20-30 dakika çalkalayın
  4. Her değişim 2 saat kadar sürebilir. Değişimi tamamlandığında, tüpün alt pelet boncuklar ile 1000 rpm'de 2 dakika için çözüm santrifüj.
  5. Ölmekyeni bir 50 ml'lik konik içine ette BSA çözeltisi boncuk atılır bırakır.
  6. Tekrar üç veya daha fazla değişim toplam 2.2-2.5 en az iki kez daha adım. Son değişimi sırasında, boncuklar kapasitesinin tam olarak boncuklar ile daha sonra iki saatlik inkübasyon tükenmiş olabilir.
  7. BSA çözüm ve kalan boncuk kaldırmak steril filtre.
  8. BSA çözeltisi, en az 2 ay boyunca 4 ° C'de kararlı olmalıdır.
  9. % 5 PVA çözüm: Tedbir 100 ml Millipore H 2 O 125 ​​ml cam şişe içine.
  10. Su 5 g PVA ekleyin. Bu, tam olarak PVA alır böylece su PVA eklemek için önemlidir "ıslak". Eğer PVA için su eklerseniz PVA çözüm gitmek için, bu çok uzun bir zaman alacaktır.
  11. PVA hemen çözülür DEĞIL. 4 ° C gecede yer PVA / su çözeltisi.
  12. 37 Ertesi sabah, yer PVA / su çözeltisi 4-8 saat için ° C su banyosunda. PVA sonunda çözelti içinde daha çok olmalıdırinkübasyon.
  13. Ek bir 24-48 saat için geri 4 ° C yerleştirin şişe, ya da tamamen eriyene kadar. Çözüm biraz yapışkan olabilir.
  14. PVA çözümler en az 6 hafta boyunca 4 ° C sıcaklıkta sabit olmalıdır.
  15. Linoleik ve linolenik asit (10,000 x çözümler): 200 geçirmez etanol içinde seyreltmek için 1 mg / ml arasındadır. 10 ml etanol için 10 ml saf yağ ekleyin. -20 ° C'de kısım ve mağaza
  16. α-MTG stok solüsyonu: 1 ml IMDM Seyreltik 13 ul α-MTG.
  17. Askorbik asit 2-fosfat çözeltisi (100 x): 5 mg / ml çözelti yapmak. 250 mg askorbik asit 2-fosfat 50 ml steril, doku kültürü sınıf H 2 O. Kolayca çözünür.

3. BPEL Medya Meclisi (~ 200 ml Toplam Hacim)

  1. Bir PVA-lipid karışımı (bu adımı filtre alacağı ortamda çözünmez damlacıkları oluşturmalarına PVA engeller) olun.
  2. 50-20 ml IMDM ve 20 ml K-12 besin karışımı ekleyinml konik bir tüp.
  3. % 5 PVA stoklar 10 ml, 0.4 ml synthechol, 20 ul linolenik asit ve 200 ml BPEL ortam boyunca 20 ul linoleik asit. Karıştırmak için iyi tüp çalkalayın. Diğer ortam bileşenleri monte edilir ise koyun.
  4. 250 ml Stericup filtrasyon ünitesi başına kalan tüm medya bileşenleri ekleyin. Gerekli IMDM ve F-12 hacimleri dengesi (66 ml her biri), BSA, bir-MTG, 100X ITS, Glutamax ben, Kalem / Strep, Protein-ücretsiz hibridoma karışımı II, ve askorbik asit ekleyin. 1. adımda Stericup en üstüne PVA-lipidler karışımı ekleyin. Orta filtre. Orta en az 2 hafta boyunca 4 ° C sıcaklıkta sabit olmalıdır. Yıkama adımları için eski orta kullanın.

4. Sahne içine TrypLE-geçişli ES Hücreler ayarlama Ben EBS Spin

Düşük yoğunluklu MEFS (en 5-7 kez az TrypLE ile geçişli olan yani ES / iPS hücreleri) üzerinde geçit TrypLE uyarlanmıştır ES / iPS hücreleri kullanın. Hücreleri ~ 01:03 de geçti ve 3-4 gün içinde% 70-80 konfluent hale edilebilir ise, Hücreleri kullanmak iyi olmalıdır.

  1. İki gün Spin EB farklılaşma (gün -2) kurmadan önce: onları farklılaşma kurulum yapıldığı gün birleşik% 70-80 olmasını sağlayan bir yoğunlukta taze MEFS üzerine TrypLE-adapte ES / iPS hücreleri Min. Biz genellikle EB kurulum Spin önce 48 saat geçmesi.
  2. Spin EB kaplama için hazırlamak için, pipet 150 ul steril su her 96-plaka 36 dış kuyulara buharlaşmasını en aza indirmek için: Sahne içine Spin EB Kurulum Ben Farklılaşma (gün 0) Günü. Sadece yuvarlak alt, düşük ek 96 tabak kullanın.
  3. ES / iPS hücrelerinin kültür ortamı kapalı aspire ve 1.0 ml önceden ısıtılmış TrypLE her iyi seçin ekleyin.
  4. 5 dakika boyunca inkübatör içinde yer plakaları (37 ° C). Yavaşça plaka hücrelerini pipetle.
  5. Konik bir tüp içinde ayrışmış hücreleri toplayın ve kümeleri bozmaya ve aşağı yukarı pipetle. 1 eşit miktarda BPEL medya ve en az 1 eşit hacmi DPBS ile TrypLE sulandırmak.
  6. Süpernatantı ve tekrar süspansiyon5 ml BPEL ortam artı 5 ml DPBS hücreleri. Spin tekrarlayın.
  7. Beklenen hücre sayısına bağlı olarak, 5-10 ml BPEL medyada süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. 70 mikron filtre (BD Falcon # 352.350) ile kümeleri (hangi EB oluşumu engelleyebilir) kaldırmak için konik yeni bir 50 ml içine hücreleri geçmektedir.
  8. Filtre hücreleri saymak. 50 ml konik bir döndürme ve kaplama için kullanılacak kısım hücreleri. Kaplama için: 3000 ES hücre /, 60 kuyu / plaka = 1.8x10 5 ES hücre / plaka.
  9. Santrifüj işleminden sonra, hücreler 4 3x10 hücre / ml (100 ul hacim / oyuk, 3000 ES hücre / çukur) ile yeniden süspanse edilmesi gerekir.
  10. BPEL ortamının bir bölümünün + hücreleri (bu 6 ml / plaka olacak) resuspending için yeterli sitokinler hazırlayın. Evre I farklılaşması için, hematopoietik progenitör hücrelerin türetilmesi için SCF (40 ng / ml), BMP4 (20 ng / ml), ve VEGF (20 ng / ml) kullanın.
  11. Plaka 100 ul hücre / çukur (= 3,000 hücre / çukur) prepar iç 60 oyuğun her birineed 96 oyuklu plakalar. Bir çok kanallı pipet ve steril çukur kullanırken bu en kolay yoldur. Hücreleri yerleşmek için bir şans yok hızlı bir şekilde çukur koymadan önce pipetleme hücreleri karıştırmak ve çalışmak için emin olun.
  12. ~ 4 dakika 1.500 rpm'de, 8 ° C'de soğutmalı santrifüj içinde 96 oyuklu plakalar Spin
  13. Santrifüj 37 ° C inkübatör plakaları dikkatlice aktarın. Mümkün olduğu kadar plakalar bozmamak. Hücrelerin kuyu alt tip granüller meydana emin olmak için kontrol plakaları.
  14. EBS bir daha dayanıklı dış tabaka oluşturdular kadar EBS gün 3-4 farklılaşma ile beslenen ya da rahatsız olmamalıdır dönmeye sahne. EBS 10-12 gün ötesinde evre I olarak kalacak, biz bazen her bir kuyunun sitokinler ile 50 ul taze BPEL medya (önce her kuyudan eski medya 50 ul almak) ile EBS beslenirler. 24 saat içinde, hücreler bir 3-D EB yapısı oluşturmak için başlamalı ve gün 3-5 ayrı bir dış tabaka olmalıdır ve deve başlarkistik yapılar loping.

5. FACS Analiz dissociating Evre I EBS

FACS analizi için around18-36 döndürme EB toplayın. Gün 6 önce hücreleri analiz, daha fazla kuyu yeterli hücre sayıları elde etmek için ihtiyaç vardır.

  1. % 2 tavuk serumu ile tripsin gerekli hacmi hazırlayın. 37 yerleştirin kullanana kadar ° C su banyosunda.
  2. 15 ml konik tüp, 96 oyuklu plakalar gelen spin EBS ve medya aktarın.
  3. EBS konik tüplerin altına yerleşmek için izin verin. 5 ml pipet ile, dikkatle süpernatant ve ayrı bir tüp (bir 15 ml veya 50 ml konik tüp içine havuzu süpernatant tüm can), transfer pipetle. Bazı hematopoetik hücreler zaten ayıran, gün 9 ve 11 arasındaki dönüş EB serbest edilmiş olarak bu hücreleri içeren süpernatant aşırı trypsinization önler.
  4. Tripsin içinde süspanse edin EBS + serum% 2 tavuk: Her 15 ml konik tüp 3-4 ml. 37 tripsin ile EBS yerleştirin ° C Su sağlama3-7 dakika boyunca rbath. Her 1-2 dakika çalkalayın ya da hafifçe girdap. Daha önce timepoints (gün önce 8), EBS daha kolay kırılır ve az 3 olarak dakika alabilir. Daha sonra timepoints (gün 8 +) EBS ayırmak daha uzun sürebilir. Biz genellikle 37 onları fazla 5 dakika trypsinize izin vermeyin ° C Not, bu kez sadece bir rehber vardır. Herhangi bir hücre hattı veya EB farklılaşma için, EBS ayırmak için daha fazla veya daha az zaman alabilir. Yakından ayrışma izlemek. Bu çok uzun süre tripsin hücreleri bırakmamaya önemlidir. Bu tripsin sadece birkaç küçük öbekler görünür kalmasını ayrışma yerine tüm kümeleri ortadan kaldırmak için denemek durdurmak için daha iyidir.
  5. FBS içeren ortam, en az 1 eşit hacimde tripsin soğutun. Hücreleri (1.500 rpm, 5 dakika, 8 ° C) aşağı doğru döndürün.
  6. (Genellikle 3-5 mi) sayımı için ortamın uygun bir hacim içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
  7. 100 mikron hücre süzgecinden Filtre hücreleri. Sayım için bir hücre porsiyonunun çıkarın. Hücreleri ile devamStandart laboratuar FACS protokollere.

6. HPSC kaynaklı Progenitör Hücreler NK Hücreleri Gelişimi, Genişleme ve Karakterizasyonu

Spin EBS hematopoietik progenitör hücreler, yüksek bir oranda içerir, çünkü doğrudan 11. günde NK hücre kültürüne aktarılabilir. Spin EBS besleyiciler olan veya olmayan 24 kuyucuğu devredilebilir. Her durumda elde edilen NK hücreleri arasında fenotip veya fonksiyon açısından bir fark göstermiştir. Bu nedenle, genellikle NK hücre gelişimi için tamamen tanımlanmış sistemine sahip besleyiciler olmadan kültürler transfer. Optimal hematopoetik farklılaşma ile bir hESC / iPSC hat kullanıyorsanız besleyici katmanları kullanımı 7,8 önerilir.

  1. 100 ul, 24 plaka her kuyuya transferi 6 dönüş EBS için ayarlanmış bir çok kanallı pipet kullanarak.
  2. Transferi dönüş EBS ışınlanmış 100.000 (3000 cGY) EL08-1D2 (bir fare embryoni içeren 24 kuyucuğu: Besleyicilerc karaciğer hücre hattı) hücre başına iyi. Besleyiciler olmadan: transferi EBS doğrudan, 24 kuyucuğu kaplanmamış için.
  3. Sitokinler ihtiva eden 400 ul ortam NK farklılaşma (IL-3, IL-15, IL-7, SCF, Flt3L, Peprotech tüm) ekleyin her kuyuda toplam hacmi yaklaşık 1 ml kadar.
  4. Yeri inkübatör hücreleri ve IL-3 dışında adım 6.3 'de tüm sitokinler içeren NK farklılaşma medya ile her 5-7 günde beslemek.
  5. NK hücreleri NK hücre farklılaşması kültürüne gün 28 aşağıdaki transferi (Şekil 2) de olgun bir fenotip ifade edecektir.
  6. NK hücre sitotoksisite test etmek için, 4 saat krom salınım tahlili 8 gerçekleştirilebilir.
  7. Hücrelerinin çok sayıda in vivo çalışmalar için gerekli ise, yapay antijen sunan hücreler (aAPCs) sahip ortak-kültür, 2 günlük veya daha fazla genleşme verebilir. Ayrıntılı bir protokol için, ziyaret http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood 11,12.

7. Bağışık yetmezliği olan farelere de hESC elde edilen NK Hücreleri ve Tümör Hücreleri Monitör in vivo Floresan ve Bioluminescent Görüntüleme olarak

Deneyler tüm 6 ila 8 hafta eski fareler. Biz obez olmayan diyabetik / şiddetli gama-zinciri nakavt (- - / NOD / SCID / γC) ile immün yetmezlik kombine kullanımı Biz aynı anda tümör ilerlemesi (turboFP650 muhabiri) ve in vivo hESC-NK hücreleri kinetik (Fluc muhabiri ana ES hücrelerinin ifade) izlemek için bir çift görüntüleme modeli kullanın. Bu görüntüleme düzeni burada gösterilen anti-tümör modeli başka sistemlere genel olarak uygulanabilir. IVIS Spektrum (Kaliper Yaşam Bilimleri) eşzamanlı in vivo floresan ve bioluminescent görüntüleme için en uygunudur.

  1. Tümör hücre enjeksiyonu öncesinde 24 saat, saçmak fareler (225-250 cGY).
  2. Bir süspanse istenilen sayıda200 ul Iscove tümör hücreleri (1 x 10 6 K562 hücreleri gösterilmektedir),% 20 FBS ile takviye edilmiş Dulbecco ortamı (IMDM) değiştirilmiştir. Tümör hücre miktarı, kullanılan modeline bağlı olarak çeşitli olabilir. TurboFP650 da olmayan tümör tiplerinde ifade edilebilir. Bu en iyi tek bir anatomik konuma lokalize hücreleri ile görüntülü.
  3. , 27 ya da 28 ölçek iğne kullanılarak farenin sol üst göğüs tümör hücrelerinin deri altından enjekte edilir ve 4 gün boyunca yerleştirmek için izin verir. Hücreler, bir fare deri altında bir kabarcık oluşturmalıdır. Fareler daha enjeksiyon görselleştirmek için vücudun bu bölümü içinde traş edilebilir. Aynı zamanda, in vivo flüoresan görüntüleme için daha iyi alanı ortaya koyar. Fare yatar iken ip enjekte NK hücreleri, en iyi görüldüğü çünkü farelerin göğüs etrafına enjeksiyon Bu modeli kullanılmıştır. Arka veya yan dahil olmak üzere deri altı teslimat alternatif yöntemler, hayvan daha az stresli ve düşünülmelidir.
  4. HESC-deri istenilen sayıda tekrar süspansiyon300 ul içinde Iscove ved NK hücreleri (10 x 10 6 NK hücreleri gösterilmektedir) antibiyotikler olmadan% 20 FBS ile takviye edilmiş Dulbecco ortamı (IMDM) yapılması.
  5. , 27 ya da 28 ölçek iğne kullanılarak, her bir fare intraperitoneal (İP) olarak hESC elde edilen NK hücreleri enjekte edilir. Tüm deneyler için, bir negatif kontrol olarak tümör ve NK hücre infüzyonu alan farelerin içerir.
  6. Ardından, ilk 7 gün boyunca her gün, in vivo olarak NK hücre popülasyonları sürdürmek için, fare IL-2, bir 250 ul IP enjeksiyonu (1x10 4 U / fare) vermek ve steril DPBS içinde IL-15 (10 ng / fare), IL- kurban saatine kadar 2 sadece her 2 ila 3 gün.
  7. Bioluminescent görüntüleme ile hESC edilen NK hücreleri engraftman izleyin. 120 ul D-luciferase (150 mg / kg) ile, her bir fare IP enjekte edilir. D-luciferase enjeksiyondan sonra fareler 10 dakika görüntü.
  8. 0,8 l / dk kutuya izofluran giriş sağlayan bir oda ile fareler anestezi. Odasına oksijen akışı da olduğundan emin olun.
  9. Anestezi yerleştirinsırtlarında IVIS Spektrum ve güvenli farelerde fareler bant veya Velcro kullanarak ve 0,5 l / anestezi korumak için min kutuya izofluran girişine izin.
  10. Orta, f / 1 durdurmak ve 1 dakika görüntü elde etmek için binning ayarlayın (4-5 fareler için D, 3 veya daha az fareler için C) görüntüleme platformu düzeltmek için IVIS makine ayarlayın.
  11. TurboFP650 + hücreler için floresan görüntüleme gerçekleştirmek için, faiz yanı sıra arka plan sinyal prob ölçüm emisyon tarama kurmak için görüntüleme sihirbazını kullanın. Prob listesinden Giriş Em / Ex seçin ve doğru uyarma ve emisyon girin. TurboFP650 için, tümör sinyal ve 570 uyarılma ve arka plan sinyal ölçmek için 640-720 emisyonu ölçmek için 605 uyarma ve 660-720 emisyon kullanın. Otomatik pozlama ayarları kullanın ve istenen görüntüleme platformu seçin. Tüm görüntüleme sırası genellikle elde etmek için 3-5 dakika sürer.
  12. Fareler tamamen görüntüleme sisteminden taşımadan önce anestezi kurtarmak için izin verin. Li kullanarak görüntüleri analizResim yazılım paketi sürüm 4.2 (Kaliper Yaşam Bilimleri) Ving.
  13. Toplam akı (fotonlar / sn) veya (fotonlar / sn / cm 2 / sr) ve aynı ölçekte (Şekil 3) tüm görüntüleri ayarlamak için ayarlanmış bir ilgi bölgesi (ROI) kullanarak bioluminescent sinyali sayısal. Burada, her bir fare için temsili görüntüleri hem de hücre popülasyonları (Şekil 3) göstermek için kullanılır. Bizim laboratuvar Diğer çalışmalar bu tekniği kullanarak 20 ko göstermiştir. Ko zamanlama kullanılan deneysel modeline göre optimize edilmesi gerekir.
  14. Emisyon tarama dizisi floresan sinyal ölçmek için "Spektral Karışmama" özelliği Yaşam Resim kullanın. Analiz dahil ve bu durumda, üst toraks içinde, ilgi sinyal içeren fare alana bir maske çizmek için görüntüleri seçin. Karışmamış olması doku otoflöresans ve bilinmeyen prob seçin. Fareler yonca içeren gıda verilirse, gıda sinyali de u olabilirilgi ve doku otofloresans prob nmixed.
  15. Ortaya çıkan görüntüler doku otofloresans (sinyal bulunduğu alan dahil olmak üzere) eşit dağılımını göstermek yoksa kısıtlamaları tutarlı dağıtım ve karışmamış edilen parçaların daha iyi ayrılması için ayarlanabilir. Bu tipik ve belirli sinyal düşük, ya da yakın arka plan sinyal olduğunda yazılım değildir ve problar için genellikle gereklidir. TurboFP650 için emisyon eğrisinin alt ucuna karşılık gelen 640 nm için güncelleştirme sekmesi altında bulunan bir yüksek geçiş filtresi,,, ayarlayın. Düşük geçiş filtresi kısıtlama da ayarlamak, ama burada gösterilen görüntüleme analizi için gereksiz olabilir.
  16. Radyant verimlilik (fotonlar / sn / cm 2 / sr) / μW ayarlanmış ilgi bölgesi (ROI) kullanarak karıştırılmamış görüntüden floresan sinyal sayısal) ve aynı ölçekte (Şekil 3) tüm görüntüleri ayarlayın.
  17. İstediğiniz zaman noktasında, fare tr için kurban ve analiz edilebilirflow sitometri ile hESC kaynaklı hücrelerin graftment. Intraperitoneal enjekte NK hücreleri için biz genellikle periferik kan (yüz damar kanaması), dalak, ve periton analiz. Periton yıkar sadece periton zarı açığa ve bir cam Pasteur pipeti periton boşluğuna erişim sağlamak için yeterli bir medial kesi auta yaparak yapılabilir. Steril PBS kullanarak, fare çevirerek iyice çözüm karıştırmak için emin periton boşluğuna çeşitli yıkama gerçekleştirin. Eğer görünür bir pelet aşağıdaki santrifüj (yıkama genellikle 5-10 ml) elde edene kadar yeterli sıvı toplamak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Spin EB yaklaşım kullanarak hematopoetik progenitör hücrelerin üretimi hESC ve iPSCs optimal NK hücre gelişimi sağlar. Şekil 2 de gösterildiği gibi, 11 gün sıkma EBS yüksek CD34 ifade progenitör hücrelerin yüzdeleri, CD45, CD43 ve CD31 içerir. CD34 ve CD45 yüksek düzeyde stromal hücreler sıralama veya desteklemek için gerek kalmadan NK koşulları doğrudan transferi sağlar. Optimal sıkma EB farklılaşma var ise, bu tür EL08-1D2 olarak stromal hücrelerinin ikincil NK koşullarda kullanılması tavsiye edilir. Kültürünün 4 hafta sonra sıkma EBS NK hücreleri (24 kuyulu bir plakanın oyuk başına yaklaşık 1-2 x 10 hücre 6) çok sayıda yol açmaktadır. Kültürler ayrıca bu sistem 7 NK hücre gelişiminin kademeli ilerlemesini görmek için erken zaman noktalarında fenotiplenebilmektedir. NK hücreleri, bu nedenle ana ES / iPS hattı modifiye edildi ve haberci genlerin ifadesi daha sonra takip edilebilir korumak (Şekil 3), NK hücreleri ve tümör hücreleri hem de eş zamanlı görüntüleme göstermek için IVIS Spektrum kullandık. Spektral Karışmama özelliği Yaşam Image yazılımı kullanarak, doku otofloresans floresan etiketli hücrelerinden sinyal optimize etmek için çıkartılabilir.

Şekil 1
Şekil 1. Çift görüntüleme düzeni ve gelişimsel zaman çizelgesi. In vivo model A) şematik. Fareler luciferase IP enjekte ve uygun inkübasyon süresi takip ediyor, ateşböceği lusiferaz + hücreleri bioluminescent sinyali görüntülü. HESC-deriv geliştirilmesi ve test için bioluminescent görüntü, TurboFP650 + hücrelerden floresan sinyal alınmasının ardından görüntülenebilir. B) Zaman ÇizelgesiNK hücreleri, ed.

Şekil 2,
Şekil 2. HESC ve iPSCs elde edilen dönüş EBS ve NK hücre fenotipi. Spin EB kültür A) eden 11 gün, hücreler flow sitometri ile analiz edilebilir. 11. günde bir zaman noktasında, CD34 yüksek oranda, CD43, CD45 ve NK hücre farklılaşması için en uygun CD31 ifade eden hücreler sağlar. B) NK hücreleri, NK hücre kültürü 4 hafta sonra akış sitometrisi ile tespit edilebilir. Lenfosit kapısı (FSC / SSC arsa) içinde hücrelerin CD56 ifadesi için analiz edilir. CD56 + hücreleri, bu tür CD117 gibi işaretleri, CD94, NKp46, ya da başkalarının ortak ifadesi için analiz edilebilir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .


Şekil 3,. IVIS Spektrum kullanarak in vivo floresan ve bioluminescent görüntüleme. Vivo izleme Bu protokolün temel amaçtır. Bu nedenle, fareler tümör izni için dışarı takip değildir. Daha önceki raporu (200.000 K562 hücreleri kullanarak), tümör boşluk üç haftada 7 oluşur göstermektedir. A) Bioluminescent görüntüleme Fluc + hESC kaynaklı NK hücre enjeksiyonu üst satırda gösterilir gün sonra 0, 7, ve 14 NK hücreleri. TurboFP650 floresan görüntüleme + gün 0, 7, ve NK hücre enjeksiyonu sonrası 14 K562 hücreleri alt satırında gösterilmiştir. Floresan görüntüleri bioluminescent görüntü elde etme hemen ardından satın alındı. B) Sıra gösteren doku otofloresans ve turboFP6 floresan sinyal50 + hücreler, Yaşam Resim yazılımındaki spektral Karışmama özelliğini kullanarak oluşturulan. Kadar her görüntüde sola üzerinde fare olmayan bir enjeksiyon kontrol ve sadece arka sinyal gösterir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

hESC farklı hücre tipleri çalışma ve klinik çeviri için önemli potansiyel tutmak için ideal bir platform. Biz hematopoetik progenitör hücrelere hESC / iPSCs ayırt etmek için tanımlanmış bir, dönüş EB yaklaşım kullanın. Spin EB yaklaşım NK hücrelerine hematopoetik progenitör hücreler ve farklılaşma tutarlı türev vermiştir, ancak, değişim hala hücre hatları üzerinden farklılaşması verimliliği var ve diğer hematopoetik hücre soylarının üretimi için değiştirilmesi gerekebilir. Karşılaştırılabilir sonuçlar diğer EB veya stromal kültür yöntemleri derivasyon elde edilebilir olsa da, bu sistem serum ücretsizdir ve diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında hematopoietik öncü üretmek için daha tanımlı yaklaşımı temsil ediyor. Ayrıca klinik çeviri için önemli bir sorun üstesinden benzer bir besleyici-ücretsiz bir şekilde, bu hematopoietik öncü hücrelerden NK hücreleri kaynaklanan standardize etkili bir yöntem var. Ayrıca NK hücre developmen incelemek için tanımlanmış bir sistemi sağlarin vitro olarak T. Kapsamlı klinik öncesi, örneğin NK hücreleri, hematopoietik hücreler, in vivo karakterizasyonu, özellikle klinik çalışmalarda, bu deneysel olarak türetilmiş hücre tipleri ve bunların uygulanması tanımlamak için de gereklidir.

Görüntüleme ve mikroskopi teknikleri gelişmeler bioluminescent ve floresan gazetecilere 15-17,19,21 ifade hücrelerin in vivo izleme uzun süreli ve non-invaziv sağlamıştır. En kayda değer başlangıç ​​karakterizasyonu yana çeşitli hücre tipleri görselleştirmek için kullanılmıştır ateşböceği lusiferaz yapısı, en kullanılmasıdır. Bu, in vivo görüntüleme için ideal bir muhabir, ama sadece bir hücre popülasyonu izlenmesi ile sınırlıdır. Çift muhabiri sisteminin en büyük avantajı, iki ayrı hücre popülasyonlarının arasındaki etkileşimleri takip yeteneğidir. Ancak, birkaç gazetecilere her iki in vivo görüntü kolay ve üstü yeterli ve ölçülebilir sinyal olduğunu geliştirilmiştirarka plan.

TurboFP650, bizim çift görüntüleme düzeni kullanılan floresan protein, arka plan otofloresans ayrı sinyal veren, uzak-kırmızı kaydırılır. Ancak, Yaşam Image yazılımı (Kaliper Yaşam Bilimleri) spektral Karışmama yöntemlerin kullanımı sistemimizde zemin oranı için sinyal üst düzeye çıkarmak için gerekliydi. Floresan protein görüntüleme içsel sorunları ile yardımcı Yaşayan Image yazılımı birçok özellik vardır. Yine de, sinyal penetranslı bir sorun olmaya devam etmektedir. Tümör hücreleri IP enjekte olsaydı durum gibi sistem, küçük hücre popülasyonlarının veya dağınık hücre görüntüleme görüntüleme için daha fazla optimizasyon gerekiyor. Ancak, floresan görüntüleme tutarlılığı ve kolay kullanımı bir çift görüntüleme modeli kullanmak için ideal bir platform yapar. Hayvanlar daha az bir süre için anestezi altında olan ve en çok çift lusiferaz sistemleri ile ilgili olarak, bir ikinci substrat sunmak için bir ihtiyaç vardır.

Bu yöntem,türetme, in vivo genişlemesi ve çift görüntüleme hESC kaynaklı veya iPSC kökenli NK hücreleri ve güncel NK hücre evlatlık tedaviler geliştirmek için gereklidir değerlendirilmesi üretmek için tutarlı bir yaklaşım sağlar. Çift floresan ve bioluminescent görüntüleme modeli biz göstermiştir anti-tümör modeli dışında iki ayrı hücre popülasyonlarının uzun vadeli bir çalışma için geniş geçerlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Bu çalışma NIH / NHLBI R01-HL77923 (DSK) tarafından ve NIH MSTP hibe T32 GM008244 (DAK), Kök Hücre Biyolojisi Eğitim Grant T32 (DAK) (T32HD060536), Lisans Araştırma Olanakları Programı (UROP) Minnesota Grant, Üniversite tarafından desteklenmiştir (AMB), Minnesota Kanser Merkezi Üniversitesi ve William L ve Blanche Hughes Vakfı Lösemi Araştırma Fonu.

Acknowledgments

Yazarlar bizim laboratuar içinde spin EB protokolün başlatılması için Melinda Hexum teşekkür etmek istiyorum. Biz Laura E. Bendzick, Michael Lepley, ve bu çalışma ile teknik yardım için Zhenya Ni de dahil olmak üzere laboratuvar diğer üyeleri, teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar aynı zamanda onun uzman teknik danışmanlık için Kaliper Yaşam Bilimleri Brad Taylor teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Media
BPEL media for Spin EB generation
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Fisher Scientific SH3022801
F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I Invitrogen 31765035
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3311 Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity.
Poly(vinyl alcohol) Sigma-Aldrich P8136
Linoleic Acid Sigma-Aldrich L1012
Linolenic Acid Sigma-Aldrich L2376
Synthechol 500X solution Sigma-Aldrich S5442
a-monothioglycerol (a-MTG) Sigma-Aldrich S5442
Protein-free hybridoma mix II Invitrogen 12040077
Ascorbic Acid 2-phosphate Sigma-Aldrich A8960
Glutamax I Invitrogen 35050061
Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) Invitrogen 41400-045
Pen-Strep Invitrogen 15140122
NK Differentiation Media
Dubecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen 11965-118
F-12 Media Invitrogen CX30315
15% Human AB serum Valley Biomed HP1022HI
5 ng/ml Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261
50 uM ethanolamine Sigma-Aldrich E9508
20 ng/ml ascorbic acid Sigma-Aldrich A8960
25 uM 2-mercapt–thanol (BME) Gibco 21985
2 mM L-glutamine Gibco CX30310
1% Pen-Strep Invitrogen 15140122
Cytokines
(all cytokines used fresh from frozen aliquots)
SCF PeproTech, Inc. 300-07 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot.
rhBMP-4 R & D Systems 314-BP 20 ng/ml in BPEL media
rhVEGF R&D Systems 293-VE 20 ng/ml in BPEL media
IL-2 PeproTech, Inc. 200-02 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol
IL-15 PeproTech, Inc. 200-15 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only)
IL-3 PeproTech, Inc. 200-03 5 ng/ml in NK media
IL-7 PeproTech, Inc. 200-07 20 ng/ml in NK media
Flt-3-Ligand PeproTech, Inc. 300-19 10 ng/ml in NK media
In vivo Imaging
D-Luciferin Sodium Salt Gold BioTechnology Lucna-500
TurboFP650 plasmid Evrogen, Moscow, Russia FP731 Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab.
Equipment
IVIS Spectrum Imaging System Caliper Life Sciences
Cells
Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells MD Anderson, Houston, TX contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood
Firefly luciferase expressing hESCs University of Minnesota, Minneapolis, MN contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5' end of a GFP:zeocin fusion construct.
TurboFP650 expressing K562 cells University of Minnesota, Minneapolis, MN contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section

Materials Table.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7, 862-869 (1995).
  2. Kaufman, D. S. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 10716-10721 (2001).
  3. Kaufman, D. S. Toward clinical therapies using hematopoietic cells derived from human pluripotent stem cells. Blood. 114, 3513-3523 (2009).
  4. Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies. Nature Protocols. 3, 768-776 (2008).
  5. Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, 1601-1603 (2005).
  6. Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105, 617-626 (2005).
  7. Woll, P. S., et al. Human embryonic stem cells differentiate into a homogeneous population of natural killer cells with potent in vivo antitumor activity. Blood. 113, 6094-6101 (2009).
  8. Woll, P. S., Martin, C. H., Miller, J. S., Kaufman, D. S. Human embryonic stem cell-derived NK cells acquire functional receptors and cytolytic activity. Journal of Immunology. 175, 5095-5103 (2005).
  9. Ni, Z., et al. Human Pluripotent Stem Cells Produce Natural Killer Cells That Mediate Anti-HIV-1 Activity by Utilizing Diverse Cellular Mechanisms. Journal of Virology. 85, 43-50 (2011).
  10. Ng, E. S., Davis, R. P., Hatzistavrou, T., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Directed differentiation of human embryonic stem cells as spin embryoid bodies and a description of the hematopoietic blast colony forming assay. Current Protocols in Stem Cell Biology. Chapter 1, Unit 1D.3 (2008).
  11. Denman, C. J., et al. Membrane-Bound IL-21 Promotes Sustained Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells. PLoS ONE. 7, e30264 (2012).
  12. Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells. J. Vis. Exp. (48), e2540 (2011).
  13. Tian, X., et al. Bioluminescent imaging demonstrates that transplanted human embryonic stem cell-derived CD34+ cells preferentially develop into endothelial cells. Stem Cells. 27, 2675-2685 (2009).
  14. Wilber, A., et al. Efficient and stable transgene expression in human embryonic stem cells using transposon-mediated gene transfer. Stem Cells. 25, 2919-2927 (2007).
  15. Shcherbo, D., et al. Near-infrared fluorescent proteins. Nature Methods. 7, 827-829 (2010).
  16. Nguyen, V. T., Morange, M., Bensaude, O. Firefly luciferase luminescence assays using scintillation counters for quantitation in transfected mammalian cells. Analytical Biochemistry. 171, 404-408 (1988).
  17. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence Imaging. Proceedings of the American Thoracic Society. 2, 537-540 (2005).
  18. Santos, E. B., et al. Sensitive in vivo imaging of T cells using a membrane-bound Gaussia princeps luciferase. Nature Medicine. 15, 338-344 (2009).
  19. Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues. Physiological Reviews. 90, 1103-1163 (2010).
  20. Knorr, D. A., Bock, A., Brentjens, R. J., Kaufman, D. S. Engineered Human Embryonic Stem Cell-Derived Lymphocytes to Study In Vivo Trafficking and Immunotherapy. Stem Cells Dev. 28, 28 (2013).
  21. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336, 1676-1681 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics