Sviluppo, di espansione, e * These authors contributed equally

Bioengineering

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Summary

Questo protocollo descrive lo sviluppo, l'espansione e immagini in vivo di cellule NK derivate da hESCs e iPSCs.

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Bock, A. M., Knorr, D., Kaufman, D. S. Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs). J. Vis. Exp. (74), e50337, doi:10.3791/50337 (2013).

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Abstract

Vi presentiamo un metodo per derivare killer (NK) naturali da hESC indifferenziato e iPSCs utilizzando un approccio alimentatore-Free. Questo metodo comporta elevati livelli di NK dopo 4 settimane coltura e può subire un'ulteriore espansione 2-log con cellule presentanti l'antigene artificiali. hESC-e IPSC-derivato cellule NK sviluppati in questo sistema hanno un fenotipo e funzione maturo. La produzione di un gran numero di organismi geneticamente modificabili cellule NK è applicabile sia per meccanicistico di base così come gli studi anti-tumorali. Espressione di lucciola luciferasi in hESC-derivate cellule NK permette un approccio non invasivo per seguire l'attecchimento delle cellule NK, la distribuzione e la funzione. Abbiamo anche descrivono un sistema dual-imaging che consente il controllo separato di due diverse popolazioni cellulari di caratterizzare più nettamente le loro interazioni in vivo. Questo metodo di derivazione, espansione, e dual imaging in vivo fornisce un metodo affidabile per la produzione di cellule NK e loro valuzione che è necessario per migliorare attuali terapie adottive cellule NK.

Introduction

Cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs), sono cellule pluripotenti indifferenziate capaci di auto-rinnovamento e multi-lignaggio differenziazione illimitata. hESCs sono stati differenziati successo in sottoinsiemi maturi e funzionali di ogni strato di germe, comprese le cellule del sistema ematopoietico 1-3. Killer (NK) naturali sono linfociti del sistema immunitario innato, che può essere derivato da cellule staminali embrionali umane per la formazione di corpi embrionali (EBS) 4,5 o co-coltura con linee di cellule stromali 1,2,6-8. Cellule NK possedere capacità anti-virali e anti-tumorale e hanno il potenziale di essere efficace contro una vasta gamma di tumori maligni, in quanto non richiedono stimolazione antigenica prima a svolgere le loro funzioni effettrici. Così, le cellule hESC-derivato NK sono un'interessante fonte di cellule per l'immunoterapia. Ulteriormente, la derivazione di cellule NK da hESCs fornisce un sistema geneticamente suscettibili di studiare lo sviluppo normale <em> in vitro.

Perché forniscono un sistema geneticamente trattabili, cellule hESC-derivato NK possono essere sperimentalmente modificate per esprimere reporter fluorescenti e bioluminescenti fornendo un modello ottimale per studiare NK funzioni effettrici cellulari in vitro e in vivo. cellule NK hESC-derivati ​​possiedono attività contro una serie di obiettivi tra cui l'HIV 9, leucemia (K562) e altri tipi di cancro 7,8. Tuttavia, la capacità di ricavare in modo efficiente le cellule NK abbastanza capaci di curare i pazienti rimane un ostacolo importante per la traduzione clinica ed è, in misura minore, di una limitazione per la vasta pre-clinica in vivo dello sviluppo delle cellule NK e le funzioni anti-tumorali. Qui, usiamo un approccio EB selezione per derivare progenitori emopoietici dal hESCs 4,5,10. Following 11 giorni l'centrifuga EBs vengono trasferiti in coltura cellule NK con o senza alimentatori per 28 giorni. Dopo 4 settimane in coltura cellulare NK, cellule NK sono tran, trasferita a co-coltura con cellule K562 modificate per esprimere di membrana interleuchina 21 (IL-21), che servono come cellule presentanti l'antigene (aAPCs artificiali). Adattare un protocollo per l'espansione delle cellule NK nel sangue periferico utilizzando queste artificiale APCs 11,12, siamo in grado di espandere le cellule NK 2-log, pur mantenendo un fenotipo maturo e capacità citotossiche.

Questo processo di sviluppo e di espansione fornisce sufficienti cellule hESC-derivato NK vasta caratterizzazione in vivo. Per gli studi in vivo, siamo in grado di monitorare in modo non invasivo l'attecchimento a lungo termine e la cinetica di iniezione lucciola luciferasi che esprimono (Fluc +), le cellule NK hESC-derivate che utilizzano l'imaging bioluminescenza. Inoltre, siamo in grado di seguire le interazioni delle cellule NK con le cellule tumorali utilizzando uno schema di imaging doppio, bioluminescente o fluorescenti. Uno studio precedente dal nostro gruppo ha utilizzato l'imaging bioluminescenza in un modello anti-tumorale di seguire la progressione del tumore e CLEarance di Fluc + K562 in vivo 7. Ora, da Engineering nostri hESCs per esprimere lucciola luciferasi 13,14 siamo in grado di seguire la distribuzione biologica ed il traffico delle cellule NK per K562 cellule tumorali che esprimono la proteina fluorescente recentemente caratterizzata, turboFP650 15. Abbiamo scelto questo sistema duale giornalista per seguire simultaneamente le due popolazioni cellulari in vivo (Figura 1). La maggior parte dei modelli duali di imaging sono stati i sistemi dual-luciferasi, ma questi sistemi possono essere tecnicamente impegnativo a causa dei requisiti di consegna dei coelenterazine, il substrato necessario per l'espressione del più Renilla e Gaussia reporter luciferasi 16-18. Reporter fluorescenti hanno permesso un facile monitoraggio di molte linee cellulari e costrutti in vitro, ma ha avuto un successo limitato per imaging in vivo a causa della sovrapposizione tra il tessuto e autofluorescenza pelliccia e gli spettri di molti co emissionimmonly usato reporter fluorescenti tra GFP, DsRed e tdTomato 15,19. Questa preoccupazione ha favorito lo sviluppo di proteine ​​fluorescenti far-rossi, che consentono una migliore penetranza del tessuto e del segnale specifico superiore rispetto al fondo 15,19. TurboFP650, la proteina fluorescente mostrato in questo sistema, è lontano-rosso spostato e supera molti dei problemi connessi con proteine ​​fluorescenti di imaging in animali viventi.

Questo metodo per sviluppare ed espandere cellule NK derivate da hESCs ha permesso di caratterizzare ulteriormente hESC-derivato cellule NK in vitro e in vivo, che è necessario per comprendere meglio la funzione delle cellule NK e clinicamente importante migliorare attuali terapie adottive cellule NK. È anche suscettibile di derivazione e l'espansione delle cellule NK iPSC-derivati. Il sistema di imaging a fluorescenza e bioluminescenti duale è ampiamente applicabile a sistemi diversi dal modello anti-tumorale abbiamo mostrato qui.

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Protocol

1. Adattamento hESCs o iPSCs in TrypLE per Spin Culture EB

  1. La dissociazione iniziale con TrypLE funziona meglio se le ES / IPS colonie dalle culture collagenasi-diversi passaggi sono relativamente piccoli. L'ES partenza / IPS popolazioni dovrebbero essere cellule passato non più di 4-5 giorni precedenti. 4-5 giorni prima dell'inizio del passaggio TrypLE, passano cellule ES ad una densità che permettono alle cellule di essere ~ 70% confluenti in quattro giorni di tempo. Usare mezzi ES regolari per coltura di cellule ES TrypLE-diversi passaggi. Qui, stiamo usando hESCs stabilmente modificati con un costrutto reporter di luciferasi (Materiali Tabella). Il protocollo funziona anche con iPSCs, utilizzando iPSCs non modificate per il confronto delle cellule progenitrici ematopoietiche e lo sviluppo delle cellule NK.
  2. Quattro giorni prima dell'inizio del passaggio TrypLE, passano cellule ES / IPS con collagenasi IV, a seguito di un protocollo di passaggio normale. Noi di solito passiamo 01:01 nel primo passaggio con TrypLE. Espandi cellule ES / IPS di conseguenza in anticipo.
  3. 5 cellule / pozzetto. Passare 01:01 (o 02:01 per difficili da adattare linee cellulari o per le culture meno dense) nel primo passaggio con TrypLE. Quindi, preparare 1 piastra MEF per ogni piatto ES / IPS si ha intenzione di mettere in cultura TrypLE.
  4. Scegliere con cautela colonie differenziati (quelli che non hanno un confine circoscritto o avere caratteristiche fibroblastiche / epiteliale) prima di procedere alla TrypLE dissociazione. Cellule differenziate possono assumere la cultura relativa facilità con passaggio TrypLE, quindi è importante assicurarsi che la popolazione di partenza è molto pulito.
  5. Aspirare i media di pozzetti e aggiungere 1,0 ml TrypLE preriscaldata Seleziona per pozzetto.
  6. Incubare le cellule ES / IPS in TrypLE per 5 min a 37 ° C incubatore. Dopo 5 min, delicatamente pipetta cellule ES via il fondo del pozzo.
  7. Raccogliere la sospensione cellulare TrypLE da pozzi e trasferire in una provetta. Pipettare su e giù gente 2-3 volte a incoraggiare le grandi ciuffi di spezzare. Diluire TrypLE con almeno 1 volume uguale ES media e 1 DPBS parità di volume. TrypLE non si spegne da terreni di coltura, per cui è importante per diluire la TrypLE con DPBS media e dopo aver rimosso le cellule dalla piastra. Usiamo DPBS + supporto per i lavaggi per salvare i media ES.
  8. Centrifugare le cellule a 1500 rpm per 5 min in centrifuga refrigerata (8 ° C).
  9. Aspirare fuori tanto del surnatante possibile a rimuovere TrypLE.
  10. Risospendere le cellule in 4 ml supporti ES più 4 ml DPBS e ripetere giro per sbarazzarsi di residue tracce di TrypLE.
  11. Aspirare il surnatante e risospendere in appositi volumi ES media per la placcatura.
  12. Cellule ES Piastra 01:01 (o 02:01 se necessario) sul MEF a bassa densità in ES media.
  13. Dopo 24 ore, nutrire le cellule con i media ES freschi. Ci sarà molto probabilmente molte singole cellule che non si attaccano. Nutrire le cellule ES quotidiano con i media ES.
  14. Passare con TrypLE sul fresco MEF (0,9-1 x 10 (ad esempio, Martedì e Venerdì), utilizzando la stessa procedura di base come sopra. Normalmente, non si dovrebbe avere a raccogliere le cellule passati con TrypLE.
  15. Per i primi passaggi (fino a passaggio 5-10), le cellule richiedono passando a 1:1. Questo rende difficile espansione delle cellule. Nella nostra esperienza, placcando l'efficienza delle cellule ES scende drasticamente intorno passaggi 4-5 e poi è di nuovo pronto entro un paio di passaggi. Dopo i passaggi 5-7, si può essere in grado di iniziare a passare le cellule a 01:02, e alla fine, 1:03. Al di là di passaggio 20, potrebbe essere necessario per iniziare a passare le cellule a 1:05 o 1:06. Assicurati di targa delle cellule ES ad una ad alta densità i primi 5-10 passaggi. Una volta che si arriva a un punto in cui il piatto abbastanza efficiente da poter raggiungere il ~ 70% di confluenza entro due giorni dopo il passaggio, si può provare ad avviare il passaggio a 1:02, e, infine, dovrebbe essere in grado di passare a 1:3 o cellule 01:04. iPSCs, in particolare, se non diversi passaggi abbastanza densamente prima completamente undapted, tendono a differenziarsi.

2. Preparare soluzioni per la configurazione Spin Culture EB

  1. Soluzione al 10% di BSA in IMDM: Sospendere 4 g di BSA in 35 ml IMDM (in ml conica 50). Lasciare la soluzione di sedersi a temperatura ambiente per 1-2 ore per consentire BSA per sciogliere completamente. Regolare il volume totale di 40 ml con IMDM per ottenere una concentrazione finale del 10%. Disponibile in commercio BSA possono essere citotossici per le cellule ES. Deionizzante la soluzione può ridurre il potenziale di citotossicità. Per deionizzare, aggiungere ~ 1,3 g perle di resina di 40 ml di soluzione di BSA e agitare bene per mescolare.
  2. Soluzione luogo BSA (con perle di resina) a 4 ° C fino a quando perline cambiamento di colore dal blu-verde al giallo (che indica che la capacità di scambio è stato esaurito).
  3. Agitare la soluzione ogni 20-30 minuti per facilitare lo scambio
  4. Ogni scambio può durare fino a 2 ore. Quando lo scambio è completa, centrifugare la soluzione per 2 min a 1000 rpm a perline pellet sul fondo della provetta.
  5. PipSoluzione ette BSA in un fresco 50 ml conica, lasciando perline per essere scartati.
  6. Ripetere i passaggi 2,2-2,5 almeno altre due volte per un totale di tre o più borse. Durante l'ultimo scambio, la capacità delle perle non può essere completamente esaurito anche dopo due ore di incubazione con le perline.
  7. Filtro sterile la soluzione di BSA e rimuovere eventuali perline rimanenti.
  8. La soluzione BSA dovrebbe essere stabile a 4 ° C per almeno 2 mesi.
  9. Soluzione PVA 5%: Misura 100 ml Millipore H 2 O in 125 ml bottiglia di vetro.
  10. Aggiungere 5 g di PVA per l'acqua. È importante aggiungere il PVA per l'acqua in modo che il PVA viene completamente "wet". Se si aggiunge l'acqua alla PVA, ci vorrà molto tempo per il PVA per andare in soluzione.
  11. PVA non si dissolvono immediatamente. Soluzione posto PVA / acqua a 4 ° C durante la notte.
  12. La mattina dopo, luogo soluzione PVA / acqua a 37 ° C a bagno-maria per 4-8 ore. PVA dovrebbe essere per lo più in soluzione entro finel'incubazione.
  13. Luogo bottiglia torna a 4 ° C per altre 24-48 ore, o fino a quando completamente sciolto. Soluzione potrebbe essere leggermente viscoso.
  14. Soluzioni di PVA dovrebbe essere stabile a 4 ° C per almeno 6 settimane.
  15. Gli acidi linoleico e linolenico (10.000 soluzioni X): diluire a 1 mg / ml in 200 a prova di etanolo. Aggiungere 10 ml di olio puro a 10 ml di etanolo. Aliquota e conservare a -20 ° C.
  16. α-MTG soluzione madre: Diluire 13 ml α-MTG in 1 ml IMDM.
  17. Soluzione 2-fosfato acido ascorbico (100X): Fai un 5 mg / ml soluzione. 250 mg di acido ascorbico 2-fosfato in 50 ml sterile, grado coltura tissutale-H 2 O. Si scioglie facilmente.

3. Assemblea di BPEL media (per ~ 200 ml di volume totale)

  1. Fare una miscela PVA-lipidi (questo passaggio impedisce la formazione di goccioline PVA insolubili nel mezzo che otterrebbe filtrato).
  2. Aggiungere 20 ml e 20 ml IMDM miscela F-12 a 50 nutrientiml tubo conico.
  3. Aggiungere 10 ml di 5% PVA magazzino, 0,4 ml synthechol, 20 acido linolenico ml, e 20 ml di acido linoleico per 200 ml BPEL media. Agitare tubo bene per amalgamare. Mettere da parte, mentre gli altri componenti multimediali sono assemblati.
  4. Aggiungere tutti i componenti multimediali restanti a massima di 250 ml unità di filtrazione Stericup. Aggiungere l'equilibrio di IMDM richiesto e F-12 volumi (66 ml ciascuna), BSA, un-MTG, 100X ITS, Glutamax I, Pen / Strep, dieta priva dell'ibridoma miscela II, e acido ascorbico. Aggiungere la miscela PVA-lipidi dal punto 1 al top della Stericup. Filtrare il mezzo. Media dovrebbe essere stabile a 4 ° C per almeno 2 settimane. Usare vecchio medium per le fasi di lavaggio.

4. Impostazione di cellule ES TrypLE-diversi passaggi in fase I Spin EBs

Usare ES / IPS cellule che sono state adattate alle TrypLE passaggio sulla bassa densità MEF (cioè ES / IPS cellule che sono stato posto con TrypLE almeno 5-7 volte). Se le cellule possono essere passati a ~ 01:03 e diventano 70-80% confluenti in 3-4 giorni, Le cellule dovrebbero essere buono da utilizzare.

  1. Due giorni prima di impostare la differenziazione EB Spin (giorno -2): Pass-adattati TrypLE cellule ES / IPS sulla fresco MEF ad una densità consentendo loro di essere il 70-80% confluenti nel giorno della configurazione differenziazione. Noi di solito passiamo 48 ore prima di Spin installazione EB.
  2. Giorno di Spin Setup EB in stadio I Differenziazione (giorno 0): Per preparare Spin EB placcatura, pipetta 150 microlitri di acqua sterile nei 36 pozzi esterni di ogni piastra a 96 pozzetti per ridurre al minimo l'evaporazione. Usare solo, attaccamento piastre a 96 pozzetti bassi a fondo tondo.
  3. Aspirare il terreno di coltura fuori delle cellule ES / IPS e aggiungere 1,0 ml TrypLE preriscaldata Selezionare per ogni pozzetto.
  4. Posizionare le piastre in incubatore (37 ° C) per 5 min. Pipettare delicatamente le cellule dalla piastra.
  5. Raccogliere le cellule dissociate in una provetta e pipetta su e giù per spezzare grumi. Diluire TrypLE con 1 volume uguale BPEL media e almeno 1 DPBS parità di volume.
  6. Rimuovere il surnatante e risospendere ilcellule in 5 ml BPEL mezzi più 5 ml DPBS. Ripetere rotazione.
  7. Rimuovere le cellule surnatante e risospendere in 5-10 ml BPEL media, a seconda del numero di cellule previsto. Passare attraverso celle filtro 70 micron (BD Falcon # 352350) in un fresco 50 ml conica per eliminare grumi (che può interferire con la formazione EB).
  8. Contare le celle filtrate. Cellule aliquote da utilizzare per la placcatura in un ml conica 50 ed effetti. Per placcatura: 3.000 cellule ES / bene, 60 pozzi / piastra = 1.8x10 5 cellule ES / piastra.
  9. Dopo centrifugazione, le cellule dovranno essere risospeso in 3x10 4 cellule / ml (volume 100 l / pozzetto, 3.000 cellule ES / pozzetto).
  10. Preparare un volume di BPEL supporti + citochine sufficienti per risospendere le cellule (questo sarà il 6 ml / piastra). Per la fase I differenziazione, usiamo SCF (40 ng / ml), BMP4 (20 ng / ml), e VEGF (20 ng / ml) per la derivazione di cellule progenitrici ematopoietiche.
  11. Piastra 100 cellule microlitri / pozzetto (= 3,000 cellule / pozzetto) in ciascuno dei 60 pozzetti interni della prepaPuntatore ed piastre a 96 pozzetti. Questo è più facile quando si utilizza una pipetta multicanale e di valle sterile. Assicurarsi di mescolare le cellule con una pipetta prima di mettere in depressione e lavorare velocemente in modo che le cellule non hanno la possibilità di stabilirsi fuori.
  12. Girare le piastre a 96 pozzetti in centrifuga refrigerata per 4 min a ~ 1.500 rpm, 8 ° C.
  13. Trasferire accuratamente le piastre da centrifuga a 37 ° C incubatore. Evitare di interrompere le piastre il più possibile. Controllo del pacco per assicurarsi che le cellule formano pellet uniformi nel fondo dei pozzetti.
  14. STAGE ti filo EBs non deve essere alimentato o comunque disturbato tramite giorni 3-4 differenziazione fino alla EBs hanno formato uno strato esterno più resistente. Se EBs sarà lasciato in stadio I al di là di 10-12 giorni, a volte ci nutriamo EBS con 50 microlitri mezzi BPEL freschi con citochine ad ogni pozzetto (prima prendere 50 ml di vecchi media da ogni pozzetto). Entro 24 ore, le cellule dovrebbero cominciare a formare una struttura 3-D EB, e di giorno 3-5 dovrebbero avere uno strato esterno distinto, e iniziare a svisaltellante strutture cistiche.

5. Dissociandosi Stadio I EBs per FACS analisi

Raccogliere EB around18-36 di spin per analisi FACS. Se analizzando le cellule prima del giorno 6, sono necessari ulteriori pozzi di ottenere il numero di cellule sufficiente.

  1. Preparare necessario volume di tripsina con siero di pollo 2%. Posto nel 37 ° C a bagno-maria fino al momento dell'uso.
  2. Trasferimento di spin EBs e supporti da piastre a 96 pozzetti per provette coniche da 15 ml.
  3. Lasciare EBs di stabilirsi a fondo dei tubi conici. Con una pipetta da 5 ml, pipettare con attenzione il surnatante e trasferimento in un tubo separato (si possono mettere tutto il surnatante in una da 15 ml o 50 ml tubo conico). Come alcune cellule ematopoietiche sono già stati rilasciati dalla EB rotazione tra i giorni 9 e 11, che separa il surnatante contenente queste cellule previene eccessiva tripsinizzazione.
  4. Risospendere EBs in tripsina + 2% di siero di pollo: 3-4 ml per ogni 15 ml tubo conico. Posizionare EBS con tripsina nel 37 ° C acqurbath per 3-7 min. Agitare delicatamente o vortice ogni 1-2 min. A intervalli di tempo precedenti (prima del giorno 8), EBS si rompono più facilmente e può richiedere un minimo di 3 min. A intervalli di tempo dopo (giorno 8 +) EBS può richiedere più tempo a dissociarsi. Noi di solito non li lasciamo trypsinize per più di 5 minuti a 37 ° C. Nota, questi tempi sono solo una guida. Per ogni particolare linea cellulare o differenziazione EB, può richiedere più o meno tempo per dissociare l'EBS. Seguire da vicino la dissociazione. È importante non lasciare celle in tripsina per troppo tempo. E 'meglio interrompere la tripsina dissociazione quando solo pochi piccoli ciuffi rimangono visibili, piuttosto che cercare di eliminare tutti i grumi.
  5. Quench tripsina con almeno 1 uguale volume di supporti contenenti FBS. Spin down cellule (1.500 rpm, 5 min, 8 ° C).
  6. Risospendere le cellule in un volume adeguato di mezzi per il conteggio (di solito 3-5 ml).
  7. Cellule filtrare attraverso un colino cellula 100 micron. Rimuovere una aliquota di cellule per il conteggio. Procedere con le celluledi protocolli standard di laboratorio FACS.

6. Sviluppo, espansione e caratterizzazione di cellule NK da cellule progenitrici HPSC-derivati

Poiché lo spin EBs contiene una elevata percentuale di cellule progenitrici ematopoietiche, possono essere trasferiti direttamente coltura delle cellule NK il giorno 11. Lo spin EBs può essere trasferito piastre da 24 pozzetti con o senza alimentatori. Abbiamo mostrato alcuna differenza nella fenotipo o funzione tra cellule NK derivate in ogni condizione. Pertanto, generalmente trasferimento a culture senza alimentatori di avere un sistema completamente definito per lo sviluppo delle cellule NK. Se si utilizza una linea di cellule staminali embrionali umane / IPSC con non ottimale differenziazione ematopoietiche l'uso di strati di alimentazione è consigliata 7,8.

  1. Usando una pipetta multicanale impostato a 100 pl, trasferimento 6 centrifuga EBs a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.
  2. Con alimentatori: trasferimento di spin EBS per piastre da 24 pozzetti contenenti 100.000 irradiato (3.000 cGy) EL08-1D2 (un embryoni murinoc linea di cellule del fegato), le cellule per pozzetto. Senza alimentatori: trasferimento EBs direttamente a non patinata, piastre da 24 pozzetti.
  3. Aggiungere 400 microlitri mezzi di differenziazione NK contenenti citochine (IL-3, IL-15, IL-7, SCF, Flt3L, tutto da Peprotech) in modo che il volume totale in ciascun pozzetto è ~ 1 ml.
  4. Cellule posto in incubatrice e sfamare ogni 5-7 giorni con i media differenziazione NK contenenti tutte le citochine nel passo 6.3 eccetto IL-3.
  5. Le cellule NK esprimono un fenotipo maturo al giorno 28 dopo il trasferimento a NK cultura differenziazione cellulare (Figura 2).
  6. Per eseguire il test di citotossicità delle cellule NK, un hr cromo saggio 4 rilascio può essere eseguita 8.
  7. Se sono richieste grandi quantità di cellule per studi in vivo, co-coltura con cellule presentanti l'antigene (aAPCs artificiali) può produrre una espansione 2-log o maggiore. Per un protocollo dettagliato, visitare http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood 11,12.

7. Nel Imaging fluorescente e Bioluminescente vivo per il monitoraggio hESC-derivati ​​cellule NK e cellule tumorali in topi immunodeficienti

Usiamo diabetici non obesi / immunodeficienza combinata grave con eliminazione diretta gamma-catena (NOD / SCID / γC - / -) topi che sono da 6 a 8 settimane di vita in tutti i nostri esperimenti. Usiamo un modello dual imaging per monitorare contemporaneamente la progressione del tumore (turboFP650 giornalista) e hESC-NK cellule cinetica (Fluc giornalista espresso in cellule ES genitore) in vivo. Questo schema di imaging è ampiamente applicabile a sistemi diversi dal modello antitumorale mostrato qui. La Spectrum IVIS (Caliper Life Sciences) è ottimale per l'imaging a fluorescenza e bioluminescenza in vivo simultanea.

  1. 24 ore prima dell'iniezione delle cellule del tumore, i topi irradiate (225-250 cGy).
  2. Risospendere il numero desiderato dicellule tumorali (1 x 10 6 cellule K562 sono visualizzate) in 200 microlitri Iscove Dulbecco modificato medio (IMDM) supplementato con 20% FBS. Dose di cellule tumorali può essere variata a seconda del modello utilizzato. TurboFP650 potrebbe anche essere espressa in tipi non-tumorali. La cosa migliore è ripreso con cellule localizzate a una singola posizione anatomica.
  3. Iniettare cellule tumorali per via sottocutanea nel torace superiore sinistro dei topi utilizzando un ago calibro 27 o 28 e lasciare engraft per 4 giorni. Le celle dovrebbero formare una bolla sotto la pelle del topo. Topi possono essere rasata in questa porzione del corpo per visualizzare meglio iniezione. Si espone anche l'area per una migliore nell'imaging fluorescente vivo. Iniezione intorno al torace dei topi è stato utilizzato in questo modello, perché gli ip iniettate cellule NK sono visualizzati al meglio, mentre il mouse è in posizione supina. Metodi alternativi di consegna sottocutanea, compresa la schiena o fianco, sono meno stressante per l'animale e devono essere considerati.
  4. Risospendere il numero desiderato di hESC-dericellule NK md (10 x 10 6 cellule NK sono visualizzate) in 300 microlitri Iscove Dulbecco modificato medio (IMDM) supplementato con 20% FBS senza antibiotici.
  5. Iniettare hESC derivate cellule NK in ogni topo per via intraperitoneale (IP) utilizzando un ago calibro 27 o 28. Per tutti gli esperimenti, includere topi ricevere alcuna infusione di cellule tumorali o NK come controllo negativo.
  6. Per sostenere popolazioni di cellule NK in vivo, topi dare una iniezione IP 250 microlitri di IL-2 (1x10 4 U / topo) e IL-15 (10 ng / topo) in DPBS sterile ogni giorno per i primi 7 giorni, seguita da IL- 2 solo ogni 2 o 3 giorni fino al momento del sacrificio.
  7. Monitorare l'attecchimento di hESC-derivate cellule NK da imaging bioluminescente. Iniettare ogni IP mouse con 120 microlitri D-luciferina (150 mg / kg). Immagine del topo 10 minuti dopo l'iniezione D-luciferina.
  8. Anestetizzare topo, utilizzando una camera che consente l'ingresso isoflurano in area a 0,8 l / min. Assicurarsi che ci sia anche il flusso di ossigeno nella camera.
  9. Posizionare anestetizzatotopi in IVIS Spectrum e topi sicuri sulla schiena con del nastro o velcro e consentire l'ingresso isoflurano in area a 0,5 l / min per mantenere l'anestesia.
  10. Impostare macchina IVIS per correggere piattaforma di imaging (D per 4-5 topi, C per 3 o meno topi), impostare binning a medio, f / stop a 1 e acquisire un'immagine per 1 min.
  11. Per eseguire l'imaging a fluorescenza per turboFP650 cellule +, utilizzare la procedura guidata di imaging per creare una scansione di emissione di misura della sonda di interesse così come segnale di fondo. Dall'elenco delle sonde scelgono Em input / Ex, ed entrano in corretta eccitazione e di emissione. Per turboFP650, utilizzare 605 di eccitazione e di emissione di 660-720 per misurare il segnale del tumore e 570 di eccitazione e di emissione di 640-720 per misurare segnale di fondo. Utilizzare le impostazioni di esposizione automatica e selezionare la piattaforma di imaging desiderato. L'intera sequenza di imaging assumerà generalmente 3-5 min per acquisire.
  12. Consentire topi di recuperare completamente da anestesia prima di trasportare dal sistema di imaging. Analizzare le immagini utilizzando la Living software Immagine versione del pacchetto 4.2 (Caliper Life Sciences).
  13. Quantificare segnale bioluminescente utilizzando una regione di interesse (ROI) impostato a flusso totale (fotoni / sec) o radianza media (fotoni / sec / cm 2 / sr) e impostare tutte le immagini alla stessa scala (Figura 3). Qui, immagini rappresentative sono usati per dimostrare entrambe le popolazioni cellulari in ciascun topo (Figura 3). Altri studi del nostro laboratorio hanno dimostrato la co-localizzazione con questa tecnica 20. Cinghia colocalizzazione dovrà essere ottimizzato basato sul modello sperimentale utilizzato.
  14. Per quantificare segnale fluorescente dalla sequenza di scansione emissione utilizzare la funzione "spettrale unmixing" In Living immagine. Selezionare le immagini da includere nell'analisi e disegnare una maschera sopra l'area del topo contenente il segnale di interesse, in questo caso, la parte superiore del torace. Selezionare autofluorescense tessuto e sonda sconosciuta da non miscelati. Se i topi sono date alimenti contenenti erba medica, segnale di cibo può anche essere unmixed dalla sonda di interesse e autofluorescenza tissutale.
  15. Se le immagini risultanti non mostrano una distribuzione uniforme di autofluorescenza tissutale (compresa la zona dove si trova il segnale) vincoli possono essere impostati per ottenere la distribuzione uniforme e una migliore separazione delle componenti che vengono mescolate. Questo è tipico e spesso necessario che le sonde non nel software e quando segnale specifico è basso, o vicino al segnale di fondo. Impostare un filtro passa alto, sotto il tassello aggiornamento, per 640 nm, che corrisponde alla estremità inferiore della curva di emissione per turboFP650. Un filtro passa-basso vincolo può anche essere impostato, ma non era necessario per l'analisi di imaging mostrato qui.
  16. Quantificare segnale fluorescente della immagine unmixed utilizzando una regione di interesse (ROI) impostato efficienza radiante (fotoni / sec / cm 2 / sr) / μW) e impostare tutte le immagini alla stessa scala (figura 3).
  17. In un punto temporale desiderato, i topi sono sacrificati e analizzati per engraftment di hESC cellule derivate mediante citometria di flusso. Per iniettato per via intraperitoneale cellule NK abbiamo in genere analizziamo il sangue periferico (spurgo vena facciale), la milza, e del peritoneo. Lavaggi peritoneali possono essere eseguite solo esponendo la membrana peritoneale e facendo un'incisione mediale ampio abbastanza da permettere una pipetta Pasteur di vetro per accedere alla cavità peritoneale. Utilizzando PBS sterile, eseguire diversi lavaggi della cavità peritoneale avendo cura di mescolare completamente la soluzione ruotando il mouse. Raccogliere abbastanza fluido fino ad avere un visibile pellet seguente centrifugazione (in genere 5-10 ml di lavaggio).

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Representative Results

La generazione di cellule progenitrici ematopoietiche che utilizzano il metodo EB rotazione consente una ottimale sviluppo delle cellule NK da hESCs e iPSCs. Come mostrato nella Figura 2, il giorno 11 di spin EBs contiene alte percentuali di cellule progenitrici che esprimono CD34, CD45, CD43, e CD31. Alti livelli di CD34 e CD45 consente il trasferimento diretto alle condizioni NK senza necessità di cernita o di supporto cellule stromali. Se vi è subottimale rotazione differenziazione EB, si raccomanda che le cellule stromali come EL08-1D2 sono utilizzate nelle condizioni NK secondarie. Dopo 4 settimane di coltura spin EBs danno luogo a grandi numeri di cellule NK (circa 1-2 x 10 6 cellule per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti). Le culture possono anche essere fenotipizzati a precedenti punti di tempo per vedere la progressione graduale di sviluppo delle cellule NK in questo sistema 7. Cellule NK mantengono l'espressione di geni reporter che sono state modificate in ES genitore / linea iPS e pertanto può essere seguita (Figura 3). Utilizzando la funzione unmixing spettrale in Living software di immagine, autofluorescenza dei tessuti può essere sottratto per ottimizzare il segnale dalle cellule fluorescente.

Figura 1
Figura 1. Sistema di imaging Dual e temporale dello sviluppo. A) Schema del modello in vivo. I topi sono iniettati IP con luciferina, e seguendo una corretta tempo di incubazione, lucciola luciferasi + cellule vengono esposte per il segnale bioluminescente. A seguito dell'acquisizione dell'immagine bioluminescente, segnale fluorescente da TurboFP650 cellule + può essere ripreso. B) Timeline per lo sviluppo e la sperimentazione di hESC-derivndr cellule NK.

Figura 2
Figura 2. Fenotipo di rotazione EBs e cellule NK derivate da hESC e iPSCs. A) seguenti 11 giorni di cultura EB rotazione, le cellule possono essere analizzati mediante citometria di flusso. Il punto 11 di giorno dà alte percentuali di CD34, CD43, CD45, CD31 e cellule esprimenti ottimali per la differenziazione delle cellule NK. B) cellule NK possono essere rilevati usando citofluorimetria dopo 4 settimane di coltura delle cellule NK. Cellule all'interno del gate linfocitario (FSC / SSC plot) vengono analizzati per l'espressione di CD56. Cellule CD56 + possono essere ulteriormente analizzati per la co-espressione di marcatori quali CD117, CD94, NKp46, o altri. Clicca qui per ingrandire la figura .


Figura 3. L'imaging fluorescente e bioluminescenti in vivo utilizzando la Spectrum IVIS. Monitoraggio in vivo è l'obiettivo primario di questo protocollo. Pertanto, i topi non sono seguiti fuori per la liquidazione del tumore. Il nostro rapporto precedente (con 200.000 K562) dimostra che la clearance del tumore avviene a tre settimane 7. A) di imaging bioluminescente di Fluc + hESC-derivato cellule NK nei giorni 0, 7, e 14 dopo l'iniezione delle cellule NK è indicato nella riga superiore. L'imaging di fluorescenza TurboFP650 + K562 nei giorni 0, 7, e 14 dopo l'iniezione delle cellule NK è mostrato nella riga in basso. Immagini fluorescenti sono state acquisite immediatamente dopo l'acquisizione di immagini bioluminescente. B) Sequenza che mostra autofluorescenza dei tessuti e segnale fluorescente da turboFP650 + cellule, generate mediante la funzione unmixing spettrale nel software Living immagine. Il mouse all'estrema sinistra in ogni immagine è un controllo non-iniezione e mostra solo il segnale di fondo. Clicca qui per ingrandire la figura .

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Discussion

hESCs sono una piattaforma ideale per studiare diversi tipi di cellule e mantenere un notevole potenziale per la traduzione clinica. Usiamo un, giro approccio EB definito per differenziare hESC / iPSCs di cellule progenitrici ematopoietiche. L'approccio EB giro ha dato derivazione consistente di cellule progenitrici ematopoietiche e la differenziazione di cellule NK, ma, variazione esiste ancora in efficienza differenziazione tra linee di cellule e può avere bisogno di essere modificati per la generazione di altre linee cellulari ematopoietiche. Mentre risultati comparabili possono essere ottenuti da derivazione in altre EB o metodi di coltura stromali, questo sistema è esente da siero e rappresenta un approccio più definito per la produzione di progenitori emopoietici rispetto ad altri metodi. Inoltre abbiamo standardizzato un metodo efficiente di derivare cellule NK da questi progenitori emopoietici in maniera simile alimentatore-free, che supera una delle principali preoccupazioni per la traduzione clinica. Esso fornisce anche un sistema definito per studiare SVILUPPO cellule NKt in vitro. Ampia pre-clinico, caratterizzazione in vivo di cellule ematopoietiche, come le cellule NK, è anche necessario definire specificamente questi tipi di cellule derivate sperimentalmente e la loro attuazione per le sperimentazioni cliniche.

I progressi nella diagnostica per immagini e di tecniche di microscopia hanno permesso di lungo periodo e non invasivi per il monitoraggio in vivo di cellule che esprimono i reporter bioluminescenti e fluorescenti 15-17,19,21. Più notevole è l'uso della lucciola luciferasi costrutto, che è stato utilizzato per visualizzare diversi tipi cellulari dalla sua prima caratterizzazione. Questo è un reporter ideale per imaging in vivo, ma è limitato a uno solo di monitorare popolazione cellulare. Il più grande vantaggio di un sistema dual-reporter è la capacità di seguire le interazioni tra due distinte popolazioni cellulari. Tuttavia, alcuni giornalisti sono stati sviluppati che sono entrambi facili da immagini in vivo ed avere segnale sufficiente e quantificabile soprasfondo.

TurboFP650, la proteina fluorescente utilizzata nel nostro sistema dual-imaging è lontano-rosso spostato, che dà il segnale distinto da sfondo autofluorescenza. Tuttavia, era necessario per massimizzare il rapporto segnale-fondo nel nostro sistema l'utilizzo di metodi unmixing spettrali nel software immagine vivente (Caliper Life Sciences). Ci sono molte caratteristiche del software di immagine vivente in grado di aiutare con i problemi intrinseci di fluorescente di imaging di proteine. Eppure, segnale penetranza rimane una sfida. Il sistema necessita di ulteriore ottimizzazione per l'imaging di piccole popolazioni cellulari o di imaging di cellule disperse, come sarebbe il caso se le cellule tumorali sono state iniettate IP. Tuttavia, la consistenza e la facilità di formazione immagine fluorescente ne complica l'utilizzo di una piattaforma ideale da utilizzare in un modello dual imaging. Gli animali sono sotto anestesia per meno tempo e non vi è alcuna necessità di fornire un secondo substrato, come con la maggior parte dei sistemi dual-luciferasi.

Questo metododi derivazione, l'espansione e doppio di imaging in vivo fornisce un approccio coerente per la produzione di cellule NK hESC-derivati ​​o IPSC di derivazione e la loro valutazione, che è necessario per migliorare attuali terapie adottive cellule NK. Il modello di imaging fluorescente ed bioluminescente duale è largamente applicabile per studio a lungo termine di due distinte popolazioni cellulari diverse da modello antitumorale abbiamo dimostrato.

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Disclosures

Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NHLBI R01-HL77923 (DSK) e dal NIH MSTP concessione T32 GM008244 (DAK), Stem Cell Biology formazione di Grant T32 (DAK) (T32HD060536), Undergraduate Research Opportunities Program (UROP) Grant, University of Minnesota (AMB), il Fondo Leukemia Research della University of Minnesota Cancer Center, e il William L e Blanche Hughes Foundation.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare Melinda Hexum per l'inizio del protocollo EB rotazione all'interno del nostro laboratorio. Vorremmo ringraziare gli altri membri del laboratorio, tra cui Laura E. Bendzick, Michael Lepley, e Zhenya Ni per la loro assistenza tecnica con questo lavoro. Gli autori desiderano inoltre ringraziare Brad Taylor al Caliper Life Sciences per la sua consulenza tecnica di esperti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Media
BPEL media for Spin EB generation
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Fisher Scientific SH3022801
F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I Invitrogen 31765035
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3311 Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity.
Poly(vinyl alcohol) Sigma-Aldrich P8136
Linoleic Acid Sigma-Aldrich L1012
Linolenic Acid Sigma-Aldrich L2376
Synthechol 500X solution Sigma-Aldrich S5442
a-monothioglycerol (a-MTG) Sigma-Aldrich S5442
Protein-free hybridoma mix II Invitrogen 12040077
Ascorbic Acid 2-phosphate Sigma-Aldrich A8960
Glutamax I Invitrogen 35050061
Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) Invitrogen 41400-045
Pen-Strep Invitrogen 15140122
NK Differentiation Media
Dubecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen 11965-118
F-12 Media Invitrogen CX30315
15% Human AB serum Valley Biomed HP1022HI
5 ng/ml Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261
50 uM ethanolamine Sigma-Aldrich E9508
20 ng/ml ascorbic acid Sigma-Aldrich A8960
25 uM 2-mercapt–thanol (BME) Gibco 21985
2 mM L-glutamine Gibco CX30310
1% Pen-Strep Invitrogen 15140122
Cytokines
(all cytokines used fresh from frozen aliquots)
SCF PeproTech, Inc. 300-07 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot.
rhBMP-4 R & D Systems 314-BP 20 ng/ml in BPEL media
rhVEGF R&D Systems 293-VE 20 ng/ml in BPEL media
IL-2 PeproTech, Inc. 200-02 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol
IL-15 PeproTech, Inc. 200-15 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only)
IL-3 PeproTech, Inc. 200-03 5 ng/ml in NK media
IL-7 PeproTech, Inc. 200-07 20 ng/ml in NK media
Flt-3-Ligand PeproTech, Inc. 300-19 10 ng/ml in NK media
In vivo Imaging
D-Luciferin Sodium Salt Gold BioTechnology Lucna-500
TurboFP650 plasmid Evrogen, Moscow, Russia FP731 Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab.
Equipment
IVIS Spectrum Imaging System Caliper Life Sciences
Cells
Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells MD Anderson, Houston, TX contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood
Firefly luciferase expressing hESCs University of Minnesota, Minneapolis, MN contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5' end of a GFP:zeocin fusion construct.
TurboFP650 expressing K562 cells University of Minnesota, Minneapolis, MN contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section

Materials Table.

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References

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