In vivo modellering van de Morbid Human Genome behulp Danio rerio

Biology
 

Summary

Hier presenteren we een systematische aanpak voor het ontwikkelen van fysiologisch relevante, gevoelige en specifieke

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Niederriter, A. R., Davis, E. E., Golzio, C., Oh, E. C., Tsai, I. C., Katsanis, N. In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio. J. Vis. Exp. (78), e50338, doi:10.3791/50338 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hier presenteren we werkwijzen voor de ontwikkeling van assays voor potentieel klinisch significante veranderingen nonsynonymous gebruik in vivo complementatie in zebravis opvragen. Zebravis (Danio rerio) een goed diersysteem vanwege hun experimentele volgzaamheid, embryo's transparant zijn gemakkelijke weergave kunnen ondergaan snelle ontwikkeling ex vivo, en kunnen genetisch worden gemanipuleerd 1 Deze overwegingen hebben geleid tot significante vooruitgang in de analyse van embryogenese. moleculaire processen en morfogenetisch signaal. Samengevat, de voordelen van dit vertebrate modellen maken zebravis zeer ontvankelijk voor modelleren ontwikkelingsstoornissen in pediatrische ziekte, en in sommige gevallen, adult-onset aandoeningen. Omdat de zebravis genoom sterk geconserveerd met die van mensen (~ 70% orthologe), is het mogelijk om menselijke ziektetoestanden zebravis recapituleren. Dit wordt bereikt hetzij door injectie van menselijk mutant mRNA te dominant negatieve of gain of function allelen, of het gebruik van morfolino (MO) antisense oligonucleotiden om genen te onderdrukken tot verlies van functie varianten nabootsen veroorzaken. Door complementatie mo-geïnduceerde fenotypen met menselijke capped mRNA, onze aanpak kan de interpretatie van het schadelijke effect van deze mutaties op humaan eiwit sequentie gebaseerd op het vermogen van mutant mRNA een meetbare, fysiologisch relevant fenotype te redden. Modellering van de menselijke ziekte allelen gebeurt door micro-injectie van de zebravis embryo's met CS en / of menselijk mRNA in de 1-4 cel stadium en fenotypering tot zeven dagen na de bevruchting (dpf). Deze algemene strategie kan worden uitgebreid tot een groot aantal ziekte fenotypes, zoals in het volgende protocol. We presenteren onze bestaande modellen voor morfogenetische signalering, craniofaciale, hart-, vaat-integriteit, de nierfunctie, en de skeletspieren wanorde fenotypes, evenals anderen.

Introduction

De functionele interpretatie van genetische informatie en toewijzing van de voorspellende klinische waarde van een genotype vormt een belangrijk probleem in de medische genetica en wordt steeds schrijnender met de versnelling van de technische en economische haalbaarheid van genoom-brede sequencing. Daarom is het noodzakelijk om nieuwe paradigma's opgezet en uitgevoerd om de pathogeniciteit van varianten van onbekende betekenis (VUS) waargenomen in patiënten te testen. Deze testen moeten dan nauwkeurig, tijd-en kosten-efficiënte, en de haven de potentie om een ​​overgang naar klinische bruikbaarheid katalyseren.

Terwijl de muis oudsher het middel bij uitstek op het gebied van menselijke ziekte modelleren is geweest, worden de zebravis in opkomst als een wetenschappelijk en economisch gunstige surrogaat. In tegenstelling tot de muis, zebravis biologie biedt gemakkelijke en geschikte toegang tot alle ontwikkelingsstadia, geholpen door optische helderheid van de embryo maakt real-time imaging ontwikkelen pathologieën. 1,38). Niet alleen genetische mutanten met knock-ins van specifieke mutaties moeizaam te bereiken, zijn ze ook niet vatbaar medium of hoge-doorvoer analyse voor het testen van een reeks van mutaties in een enkel gen. Belangrijk is dat een reeks toetsen informatie niet alleen de pathogene potentieel van allelen, maar ook de richting van effect op cellulair niveau (bv. verlies van functie versus gain of function), die essentieel is voor het informeren wijze van overerving in gezinnen, vooral bij kleine menselijke stambomen haven beperkte informatie over de wijze van genetische transmissie. Voor verdere vergelijking van het gebruik van beschikbare muis en zebravismodellen, zie Tabel 1.

We merken ook op dat dere zijn inherente beperkingen aan de zebravis modelsysteem. Hoewel D. rerio hebben snelle initiële ontwikkeling van orgaansystemen, seksuele rijpheid vereist ongeveer drie maanden. Hierdoor prenatale en pediatrische-onset aandoeningen zijn het meest vatbaar voor deze tijdelijke expressie model. Terwijl ideaal voor het uitvoeren van grote chemische verbinding schermen, het gebruik van genetische mutanten niet haalbaar voor het systematisch testen van duizenden nonsynonymous varianten die bij en verder bij pediatrische aandoeningen te detecteren.

De complementatie test beschreven profiteren van deze experimentele volgzaamheid, hoge mate van homologie, en het behoud van de functie tussen menselijke en zebravis eiwitten, met name voor moleculen noodzakelijk geconserveerde ontwikkelingsprocessen. Figuur 1 schetst het testen en identificatiestrategie voor diverse allele effecten. Beide verlies van functie (LOF) en dominante testen kunnen worden uitgevoerd. Voor LOF het experiment begint met de onderdrukking van het gen van belang met een morfolino knockdown en assayen voor fenotypes die de klinische fenotype onderzochte belang kunnen zijn. Onderdrukking kan worden bereikt door het blokkeren van translatie van een MO richten op of bij de translationele startplaats van het zebravis locus (vertaling blocker morfolino, tbMO) of door te interfereren met splicing door een MO op een splitsingsplaats, typisch induceren hetzij opneming van een intron of afwijkend exon skipping (splice blokkering morfolino; SBMO).

Vervolgens wordt capped mRNA van de orthologe menselijke transcript geïntroduceerd en kwantificeerbare redding van het fenotype wordt gemeten. Nadat de test is vastgesteld, kunnen kandidaat mutaties in de menselijke bericht geïntroduceerd en getest op hun vermogen om de MO-geïnduceerde fenotype te redden op dezelfde efficiëntie als WT menselijke mRNA. Omgekeerd, voor de kandidaat-dominante allelen, menselijk mRNA (maar niet MO) is invoeringed met de verwachting dat WT menselijke mRNA niet kennelijk invloed zebravis anatomie en fysiologie, dat invoering van de test mutaties die een dominant effect fenotypen analoog aan die waargenomen in de humane klinische conditie veroorzaken. Dit experiment kan fijnkorrelige verder te ontleden of het overheersende effect optreedt door een versterking van de functie (GOF) of een dominant-negatieve mechanisme mengen WT en mutante humane mRNA want GOF evenementen, toevoeging van WT menselijk mRNA naar verwachting irrelevant, terwijl voor dominant-negatieve allelen, het mengen van WT en mutant mRNA moet de ernst van het fenotype veroorzaakt door mutant-bericht te wijzigen. In alle gevallen adviseren wij dat alle combinaties van injecties (MO met WT menselijk mRNA vs morpholino met mutant menselijk mRNA enz. worden uitgevoerd, bij voorkeur binnen dezelfde koppeling van embryo's (zie figuur 1) De interpretatie is als volgt.:

Voor LOF testen:

  • Als de knock-downproduceert een fenotype dat equivalent van mutante en WT mRNA kunnen worden gered, het allel waarschijnlijk goedaardig.
  • Als de mutant redding van de knockdown fenotype niet te onderscheiden van de knockdown fenotype zelf, het allel een functionele waarschijnlijk null. Het experiment kan geen onderscheid maken tussen echte nullen (geen functioneel eiwit) en ultralage eiwitactiviteit niveaus dat er geen redding capaciteit hebben.
  • Als de mutant redding van de knockdown fenotype statistisch beter dan de MO, maar slechter dan de WT, de allel waarschijnlijk een hypomorph omdat dit resultaat toont gedeeltelijke functieverlies.

Voor dominante testen:

  • Als er geen knockdown fenotype, maar injectie van WT mRNA produceert een fenotype, een urgentieplan worden gebruikt als het experiment te gaan (zie hieronder).
  • Als er geen knockdown fenotype en injectie van WT mRNA produceert geen fenotype, het experiment verloopt zoals gebruikelijk.
  • Als injectieof mutant mRNA is gelijk aan die van wild-type mRNA, kan het allel zowel goedaardig of verlies van functie of de assay mislukt. Dit vereist verdere experimenten te maken tussen deze opties.
  • Als injectie van gemuteerd mRNA te onderscheiden van MO knockdown, de functie van het genproduct waarschijnlijk veranderd andere manier. Om de verandering in functie onderscheiden, zou een titratie van mutant mRNA met wild type mRNA uitgevoerd.
  • Indien het resultaat van deze titratie onderscheiden alleen wild type mRNA, is aangetoond dat het mutante eiwit product gebruikt het wildtype eiwit als substraat, als effect varieerde met de hoeveelheid titratie. Dit duidt op een dominante negatieve fenotype.
  • Indien het resultaat van deze titratie onderscheiden alleen mutant mRNA, is aangetoond dat het mutante eiwit product niet langer dezelfde functie als het wild-type, en wordt dus niet beïnvloed door de hoeveelheid van wildtype proteïne product preverzonden. Dit toont aan dat het allel waarschijnlijk gain of function.

Rampenplan:

  • Indien geen fenotype presenteert vanaf MO knockdown, maar aanwezig met WT mRNA doet, kan verder experimenteren optreden, hoewel we benadrukken dat deze situatie niet ideaal is. WT menselijke mRNA worden getitreerd om het fenotype te minimaliseren, en kan ook worden gebruikt als een nieuw instelpunt. Verdere co-injectie van WT en mutante humane mRNA kan worden geëvalueerd op basis van de reddings vermogen van de mutant.

Protocol

1. Bioinformatica-analyse

  1. Bepalen of het menselijke gen van belang heeft een zebravis orthologon, en zo ja, hoeveel exemplaren. Wij raden wederzijdse BLAST ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ ) van het menselijke eiwit tegen de zebravis genoom, en de daaropvolgende BLAST van de beste zebravis raakte tegen het menselijk genoom. True orthologa zal de beste hit in elk geval wel.
  2. Bepaal de grootte van het open leeskader (ORF) van het menselijke gen. Als meer dan 6 kb, dit model is onoplosbaar is aangezien beperkingen van hoge kwaliteit in vitro transcriptie van lange templates.
  3. Verkrijgen of het genereren van een construct die het humane ORF in de pCS2 + vector backbone (of gelijkwaardig vector met een 5 'SP6 transcriptieplaats en 3' polyA signaal).
  4. Ontwerp een MO aan splicing of vertaling van de beoogde zebravis gen te blokkeren. Als meerdere kopieën bestaan ​​in de zebravis genoom, there zijn twee opties: a) het ontwerp van aanvullende MO's, of b) de identificatie van een splicingplaats volledig geconserveerd tussen exemplaren waartegen een MO effectief kan zijn. Enkele gepubliceerde MO sequenties zijn beschikbaar op www.zfin.org .

2. Expressie analyse in de ontwikkelingslanden zebravis embryo

  1. Bepalen of de zebravis orthologon wordt uitgedrukt in een tijdruimtelijke context om de fenotypische uitlezing relevant. Als geen expressie beschikbaar zijn voor het gen van belang, voeren reverse transcriptie (RT)-PCR met behulp van cDNA geheel zebravis embryo's of in situ hybridisatie. (Zie 2,3).

3. Site-mutagenese

  1. Ontwerp mutagenese primers 25-45 basen in lengte, met de gewenste mutatie in het midden. De primer smelttemperatuur moet groter dan of gelijk aan 78 ° C zijn Ontwerp een voorwaartse en achterwaartse mutageneseprimer te hechten aan tegenoverliggendestrengen van het plasmide.
  2. Verkrijgen primers voor sequentie bevestiging van de ORF post-mutagenese, deze moet tegel over ~ 300 baseparen secties om de volledige ORF dekken.
  3. Monteer de mutagenesereactie met een high-fidelity polymerase en de cyclus als volgt (1: 95 ° C 30 sec, 2: 95 ° C 30 seconden, 3: 55 ° C 1 min, 4: 68 ° C 6 min, 5: Go tot 18x ​​2, 6: 4 ° C voor altijd, 7: end).
  4. Voeg 1 ul DpnI restrictie endonuclease per reactie dam gemethyleerd sjabloon verwijderen, incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur.
  5. Transformatie 2 ui mutagenese-reactie in 20 pi competente cellen volgens standaardprotocollen.
  6. Pick 3-4 kolonies en enten 5 ml LB-medium met geschikte antibiotica. Schudden bij 37 ° C gedurende de nacht bij 225 rpm.
  7. Miniprep DNA en bepalen concentratie.
  8. Sequentie de mutatieplaats op de aanwezigheid van de mutatie plaats te bevestigen.
  9. Sequence hele ORF om de sequentie integriteit bevestigen.

4. In vitro mRNA transcriptie

  1. Met behulp van een gelineariseerde pCS2 + sjabloon, genereren capped mRNA met behulp van de mMessage mMachine SP6 kit (Ambion). Wij raden u aan helft van de hoeveelheden component reactie.
  2. Zuiveren de RNA monster met LiCl precipitatie of fenol chloroform zoals beschreven in de kit instructies.
  3. Bepaal de concentratie van mRNA middels absorptie, de integriteit van het mRNA met gelelektroforese, en bewaar het monster in drie of meer porties bij -80 ° C tot aan gebruik. We hebben geen multiple vries-dooi cycli van mRNA monsters bevelen.

5. In vivo assay van Variant Verlies van functie

  1. Verkrijgen zebravis embryo's uit natuurlijke zebravis paringen, en hen te handhaven op 28 C in embryo water ° in 6 of 10 cm schotels.
  2. Voer een morpholino dosisresponscurve naar fenotype specificiteit, MO efficiëntie en MO toxiciteit evalueren. Injecteer een dosis curve tenminste drie verschillende concentraties tussen 1-10 ng MO in 50-100 (1-4 cel stadium) zebravis embryo / batch. Efficiënte MO's moeten leiden tot een dosisafhankelijke stijging van het aandeel van de aangedane embryo's in een batch.
  3. Fenotype embryo's in geschikte ontwikkelingsstadium gebaseerd op expressie van gerichte zebravis gen van belang en de fase waarin een relevante fenotype zal worden waargenomen. Dit kan ofwel kwantitatief (bijvoorbeeld een meting tussen anatomische structuren) of kwalitatief (op basis van gestandaardiseerde fenotypische criteria). Voor alle injecties score> 24 HPF: embryo's worden behandeld met PTU (0.003% 1-fenyl-2-thioureum in embryomedium) en 24 hpf maximale vermindering van melanocyten formatie.
  4. Voor splice-blocking MO's, testen MO efficiency door het extraheren van totaal RNA van hele embryo lysaten op het tijdstip van fenotypische scoren, het genereren van cDNA en gedrag RT-PCR van de target-gen met behulp van primers aan weerszijden van de MO doellocatie.
  5. De onderdrukking effic controlereniency van een tb-MO, oogst hele embryo eiwitlysaten en gedrag immunoblotting om het niveau van de beoogde eiwit versus controle vergelijken. Deze benadering is niet vatbaar voor alle doelgenen omdat er onvoldoende kruisreactiviteit voor vele commerciële antilichamen tegen eiwitten zebravis. Twee indirecte methoden tonen MO specificiteit bevatten: a) tonen dat er een dosis-afhankelijk effect op fenotype, en b) toont dat co-injectie van wildtype mRNA met tb-MO redt het fenotype efficiënt. Daarom wordt aanbevolen een splice blocker indien mogelijk, omdat efficiëntie direct kan worden gecontroleerd.
  6. Als een fenotype wordt waargenomen naar stap 5.7, indien geen fenotype wordt waargenomen door naar stap 6.1.
  7. Voor kwalitatieve fenotypes, selecteer een MO dosis waarbij 50-75% van de embryo's worden aangetast, want kwantitatieve fenotypes, selecteer een MO dosis waarbij de fenotypische maatregel is significant verschillend van wild-type (p <0,001). Injecteren nieuwe batches van zebravis EMBzelfgerolde sigaretten (1-4 cel stadium; n = 50-100/batch) met een cocktail met de "test" dosis van MO en een dosering curve van menselijke WT mRNA (variërend 10-200 pg mRNA; deze doses te garanderen aanzienlijke overexpressie boven de basislijn van een enkel transcript, wat neerkomt op 0,25-0,5% van de totale polyA mRNA in een zebravis embryo). 4
  8. Gedrag gemaskeerd scoren van injectie batches; kies de WT mRNA dosis met de belangrijkste redding in vergelijking met MO alleen, dit is de "test" dosis van mRNA.
  9. Injecteren nieuwe batches (1-4 cel stadium; n = 50-100/batch) met een test dosis van MO en test dosis mutant menselijk mRNA. Fenotype embryo's in de juiste fase en de resultaten vergelijken met WT menselijk mRNA te redden met behulp van een geschikte statistische test (t-test of een chi-kwadraat). Zie Figuur 1 voor de resultaten en ga verder met stap 7. Spuit de test doses van WT en mutant mRNA alleen te controleren voor mRNA toxiciteitseffecten.

6. In vivo assay van Variant Dominant Negatieve of Gain van Function Effects

  1. Indien geen functieverlies fenotype waargenomen (stap 5,5) of mutant mRNA ontstaat fenotypen niet significant verschillend van MO alleen (stap 5.7), Injecteer dosering curve variërend 10-200 pg WT menselijke mRNA (aanbevolen 25, 50 , en 100 pg als een eerste test) in embryo batches (1-4 cel stadium; 50-100 embryo / batch).
  2. In de juiste fase (zie 5.3 hierboven), uit te voeren fenotypische scoren, en het bepalen van de hoogste dosis waarbij er geen statistisch significant aantal doden en / of aangetaste embryo's in vergelijking met niet-geïnjecteerde controles. Dit is de "test" dosis.
  3. Injecteer de test dosis mutant menselijk mRNA (1-4 cel stadium; 50-100 embryo / batch). Fenotype embryo's en de resultaten te vergelijken met het noteren van de test dosis van WT mRNA injectie mens of de assay MO concentratie. Zie Figuur 1 voor de uitkomsten.
  4. Als de resultaten niet te onderscheiden van MO, titreren humaan mutant mRNA met WT mRNAen vergeleken menselijke WT en mutant mRNA injecties. Verbetering van fenotypes met mutant plus WT mRNA-geïnjecteerde batches geeft een dominant negatief. Geen verbetering geeft een winst van functie.

7. Reproduceren in vivo testen Resultaten

  1. Herhaal in vivo assays minimaal drie keer.

8. Integreren zebravis in vivo Pathogeniciteitstoets gegevens met andere Lines of Evidence

  1. Vergelijk pathogeniciteit gegevens van zebravis experimenten: genetische gegevens binnen een familie (indien van toepassing), controlepopulatie frequentiegegevens in vitro studies (celgebaseerde proeven van eiwitstabiliteit, cellulaire lokalisatie, signaaluitgang of enzymatische activiteit).

Representative Results

Recessief en Pseudorecessive Disorders

Primaire cilia zijn bijna-alomtegenwoordige structuren op de gewervelde lichaam plan dat cellulaire signalerende rol spelen in verschillende celtypes, waaronder proliferatie, polariteit, differentiatie en weefsel onderhoud spelen. 5 disfunctie van deze organellen leidt tot een breed scala van menselijke genetische aandoeningen aangeduid als collectief ciliopathies. 6,7 Een dergelijke klinische entiteit Bardet-Biedl (BBS), een multisystemic pediatrische aandoening gekenmerkt door retinale degeneratie, obesitas, hypogonadisme, polydactylie, en nierfunctiestoornissen. 7 De ontwikkeling van in vivo testen van allel pathogeniteit noodzakelijk was BBS omdat a) het is een genetisch heterogene aandoening veroorzaakt door hoofdzakelijk particuliere nonsynonymous veranderingen bij minstens 17 genen 7-10, en b) oligogenic erfenis bij> 25% van de BBS families, waarin de aanwezigheid van heterozygote veranderingen in een tweedeBBS-gen (naast recessieve primaire causale mutaties) kunnen klinische penetrantie en expressiviteit moduleren. Typisch, deze derde allelen zijn nonsynonymous heterozygoot veranderingen van, vanuit genetisch oogpunt, onduidelijk pathogeen potentieel, waardoor nauwkeurige interpretatie van hun biologische effect op proteïne functie noodzakelijk is. 11-13

Om het potentieel pathogene mutaties dragen aan mutatie belasting in BBS onderzoeken we eerst alle geteste missense veranderingen die in BBS1 - BBS14. Zowel wij en anderen hebben aangetoond dat het verlies van basale lichaamstemperatuur eiwitten leidt tot ontregeling van vlakke celpolariteit (PCP, niet-canonieke Wnt-signalering). Manifesteren als convergente extensie gebreken medio somitic zebravis embryo 14 Met deze fysiologisch relevante fenotypische uitlezing, we hebben geconstateerd dat de onderdrukking van BBS genen resulteerde in verkorte lichaam assen, breder en dunner somieten, en brede, geknikte notochords. 15 </ Sup> (figuur 2) MO-geïnduceerde suppressie geproduceerd gastrulatie defecten, en co-injectie met humaan mRNA gered significant (en reproduceerbare) deze fenotypen zoals gescoord door drie verschillende in vivo. Eerst werden embryo levend gescoord op basis van kwalitatieve criteria fenotypische (Normal, klasse I en klasse II, voor gedetailleerde definities van fenotypische klassen zie 15). Vervolgens hebben we gekwantificeerd celmigratie tijdens epiboly (vroegtijdig ontwikkelingsstoornissen gekenmerkt door het dunner worden en de verspreiding van de cel lagen over de dooier cel 16) door het gebruik van een fluoresceïne tracer om migrerende cellen te visualiseren. Ten slotte hebben we gemeten somite lengte van de trunk in negen-somiet embryo's in situ gehybridiseerd met een cocktail van krox20, pax2 en MyoD riboprobes, die vlak werden gemonteerd voor morfologische analyse.

Deze methode werd gebruikt voor het testen van meer dan 500 allelen in de ciliaire mutatie ruimte. In eenstudie alleen in vivo testen van> 130 allelen produceerden en fenotypische scores, zoals door ons protocol (figuur 1) volledige redt werden geclassificeerd als benigne (niet significant verschillend van WT rescue), partiële redt werden geclassificeerd als hypomorphs (aanzienlijk verbeterd van MO, maar ernstiger dan WT redding), werden niet-rescue geclassificeerd als functionele nul (niet significant verschillend van MO) en fenotypes geïnduceerd door mutant mRNA alleen versus MO werden als dominant negatieve.

Wij hebben tevens sensitiviteit en specificiteit van de in vivo complementatie test bij zebravis. Specificiteit werd bevestigd door co-injectie gemeenschappelijke SNPs (> 5% minor allele frequentie in gezonde populaties), bleken de goedaardige fenotypen geven 14/17 getest (> 82%) en gevoeligheid bleek 98% te zijn zoals aangegeven door overeenstemming tussen in vivo data en genetische argumenten voldoende to attribuut een allel als oorzakelijke in een BBS pedigree. 17 Bovendien fenotypische effecten waargenomen met behulp van de drie in vivo maatregelen (live-scoring, epiboly bijhouden, en ISH morfometrie) werden gevalideerd in vitro met behulp van immunoblotting en cellulaire lokalisatie studies. Terwijl de interpretatie van deze resultaten vereist voorkennis ten minste een mechanisme van de ziekte pathogenese, dit voorbeeld levert het bewijs voor het nut en de robuustheid van ons protocol onderbouwen. We hebben sindsdien bevestigd onze in vivo scoren met meerdere andere lijnen van experimenteel bewijs in een onpartijdige mutatie screening en functionele analyse studie van TTC21B, een retrograde intraflagellar transporteiwit. 18

Dominante aandoeningen

Limb girdle spierdystrofieën (LGMD) zijn een autosomaal klasse van spierdystrofie, waardoor langzaam voortschrijdende spierzwakte in de heupen en schouders. Dit genetisch en mijchanistically heterogene groep van aandoeningen die veroorzaakt wordt door zowel de dominante en recessieve mutaties in meerdere sarcolemmale, sarcomerische, cytoplasmatische en nucleaire proteïnen. Op basis van de presentatie van de klinische fenotypes en bewijzen van de spier betrokkenheid van magnetic resonance imaging, onderzochten we de oorzaak van een dominante LGMD gevonden in de Finse, de VS, en Italiaanse families 19. Sequencing van positionele kandidaten binnen de toegewezen locus bleek mutaties in DNAJB6, een gen dat codeert voor een co-chaperonne van HSP70 familie uitgedrukt ten minste twee splice isovormen (kern en cytoplasma) bij mensen. Om verder inzicht in DNAJB6 functioneren en haar relevantie voor LGMD krijgen, onderzochten we haar rol in de spieren integriteit in de zebravis. RT-PCR van de zebravis ortholoog (dnajb6b) gedetecteerde expressie al de vijf-somiet fase, gevolgd door injectie van embryo's met een splice-blokkerende morfolino. Op 48 uur na de bevruchting, gemaskerde scoren toonde detachement van tragevezels uit hun invoegpunten. De specificiteit van dit fenotype werd vervolgens getest met een tweede niet overlappende MO gered en vervolgens met WT menselijke DNAJB6 mRNA.

Te vragen hoe het verlies van DNAJB6 functie leidt tot defecten in musculaire integriteit, we missense mutaties gevonden bij patiënten in de menselijke transcripties van beide isovormen geïntroduceerd en geïnjecteerd ze in zebravis embryo's. Terwijl injectie van WT menselijke mRNA vertoonden geen noemenswaardige fenotype, deze veranderingen phenocopied het functieverlies effecten van de MO als ontworpen in het cytoplasmatische, maar niet nucleair isovorm. Dit werd gevolgd door co-injectie van equimolaire hoeveelheden van mutante en WT mRNA, waardoor versterkte ernst van de spier fenotype vertoonden, suggereert een dominant effect. Om dit idee te testen, werden verdere injecties met het veranderen molaire verhoudingen van mutant en WT mRNA uitgevoerd. Consistent met de voorspelling, een overmaat mutant mRNA opzichte van WT geïnduceerde letaliteit in embryo's, terwijl eenn overmaat aan WT produceerde een progressief toe redding. Dit werd gevolgd door in vitro experimenten om oligimerization eigenschappen en mogelijke eiwitinteracties bepalen. Hieruit bleek dat de mutaties beïnvloeden de activiteit van antiaggregation cytoplasmatische DNAJB6 en interfereren met een omzet van zowel WT en mutant, en interageren met andere molecule, BAG3, waarnaar ook het pathomechanisme van LGMD relevant is, aangezien LOF BAG3 veroorzaakt een pediatrische vorm van spierdystrofie 20. Vervolgens hebben we gevraagd of BAG3 het fenotype veroorzaakt door mutant DNAJB6b in de zebravis kan moduleren. Terwijl injectie van WT BAG3 alleen leverden geen fenotype, co-injectie met DNAJB6 mutanten aanzienlijk toegenomen fenotypische strengheid, suggereert dat BAG3 speelt een rol in het mediëren van de pathogeniciteit van deze mutanten 19.

<td> Mutant zebravis Line
Voorbijgaande zebravis model Transgene muis Line
Leeftijd bij het ​​begin van de menselijke fenotype in onderzoek
  • prenataal
  • neonatale
  • pediatrische
  • prenataal
  • neonatale
  • pediatrische
  • prenataal
  • neonatale
  • pediatrische
  • volwassene
Haalbaar Fenotypes
  • craniofaciale
  • gespierd
  • signalering
  • hart-
  • nier-
  • vaat-
  • craniofaciale
  • gespierd
  • signalering
  • hart-
  • nier-
  • vaat-
  • craniofaciale
  • gespierd
  • signalering
  • hart-
  • nier-
  • vaat-
  • zintuiglijk
  • skelet-
  • visceraal
  • gedragsmatige
  • ademhalings
  • voortplantings-
  • endocriene
  • stofwisselings-
Tijd tot gebruik (vanaf de geboorte) 1-7 dagen > 3 maanden > 6 maanden
Throughput middelhoge laag laag
Voordelen
  • Mogelijkheid om specifieke mutaties te testen
  • Mogelijkheid om knock-in modellen te genereren
  • Mogelijkheid om morpholino knockdowns gebruiken
  • Low-cost onderhoud
  • Minder experimentele variabiliteit
  • Dichter evolutionaire relatie
  • Behoud van orgel structuren
  • Vermogen om genentarief knock-in modellen

Tabel 1. Vergelijking van in vivo modellen.

Tabel 2
Tabel 2. Voorbeelden van in vivo modellering van menselijke dysmorphologies. Verschillende fenotypes getest onder de gepresenteerde protocol. Een aantal fenotypische uitlezingen en visualisatietechnieken worden toegepast gebaseerd op het type stoornis. hier grotere tafel bekijken.

Figuur 1
Figuur 1. In vivo functioneel testen van nonsynonymous varianten. Een systematische aanpak van functionele testen van alleeles van onbekende of hypothese betekenis. Gene morfolino knockdown via micro-injectie wordt gevolgd door een reeks van (co) injecties van zowel WT en mutante humane mRNA. Statistische analyses van fenotypische uitkomsten informeren de allel pathogeniteit en moleculaire functie. In het kort, voor het verlies van de functie testen: Als de knock-down produceert een fenotype die gelijkwaardig door mutant en WT mRNA kunnen worden gered, het allel waarschijnlijk benigne (groene doos). Als de mutant redding van de knockdown fenotype niet te onderscheiden van de knockdown fenotype, het allel een functionele waarschijnlijk null (gele vakje). Als de mutant redding van de knockdown fenotype statistisch beter dan de MO, maar slechter dan de WT, de allel waarschijnlijk een hypomorph (groene box) Voor dominante proeven:. Als injectie van gemuteerd mRNA gelijk is aan die van wildtype mRNA , het allel kan zowel goedaardig of verlies van functie, of de test kan hebben gefaald (groene doos). Als injectie van mutant mRNA is onmisbaar tinguishable van MO knockdown, de functie van het genproduct waarschijnlijk veranderd andere manier. Om de verandering in functie onderscheiden, titreren mutant mRNA met wildtype mRNA. Indien het resultaat van deze titratie onderscheiden alleen wild type mRNA, het mutant proteïne product gebruikt het wildtype eiwit als een substraat, waardoor aangegeven een dominant negatief fenotype (blue box). Indien het resultaat van deze titratie onderscheiden alleen mutant mRNA, het mutant proteïne product niet langer dezelfde functie als het wild-type, en is dus waarschijnlijk een overexpressie-(blue box). Indien geen fenotype presenteert van MO knockdown maar komen met WT mRNA doet, kan het verder experimenteren optreden dient WT menselijke mRNA worden getitreerd om het fenotype te minimaliseren, en kan ook worden gebruikt als een nieuw instelpunt. Verdere coinjection van WT en mutant mens mRNA kan worden geëvalueerd op basis van de redding vermogen van de mutant (roze doos).et = "_blank"> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Kwantitatieve en kwalitatieve evaluatie van MKS1 mutaties bij mensen geconstateerd. Developmental defecten in mks1 morphant embryo. Op basis van de ernst, fenotypes werden in drie groepen. Voorbeelden van elke klasse worden getoond (a), en hun prevalentie binnen hun embryo cohort (n = 100-160 embryo's) werd in tabelvorm (niet getoond). MO geïnjecteerde embryo's met klasse I fenotypes had schromelijk normale morfologie maar waren korter, met overmatige embryonaal weefsel op de dooier in vergelijking met geïnjecteerde embryo's op hetzelfde somitic leeftijd (8-9 somieten) beheersen. Klasse II morphants werden uitgedund, korte en had slecht ontwikkelde kop en staart structuren, en bovendien miste somitic definitieen symmetrie. Klasse III embryo's werden ernstig vertraagd met slecht ontwikkeld en misvormde somieten, undulated notochords, en meestal niet overleven voorbij de 10-somiet podium. Co-injectie van menselijke MKS1 mRNA gered elk van deze gebreken, waaruit de specificiteit van de fenotypes te mks1 onderdrukking. In situ hybridisatie van embryo's in de 11-somiet fase (± 1 somiet) gekleurd met krox20, pax2 en MyoD riboprobes (b, c ). Fenotypes werden gekwantificeerd door metingen van het eerste tot het laatste noemenswaardige somiet van elk embryo (pijlen), gekwantificeerd in c. Figuur aangepast met toestemming van 15.

Figuur 3
Figuur 3. Voorbeelden van in vivo modellering van menselijke dysmorfologie. (A) Craniofacial dysmorfologie. Controle mRNA geïnjecteerd embryo (links) en mutant geïnjecteerd embryo (rechts) gekleurd met alcianblauw op 5 dpf. Mutanten mRNA-geïnjecteerde embryo's weer te geven met name kleine en misvormde hoofden met een algemene desorganisatie van de kraakbeenvissen craniofaciale skelet inclusief splayed kieuwbogen en ontbrekende of misvormde structuren. (B) Micro / macrocephaly. Controle-geïnjecteerde embryo (links) en kctd13 MO-geïnjecteerde embryo (rechts) op 5 DPF. Morphants weergeven verbreding van het hoofd, zoals gezien door de ruimte tussen de ogen. 21 (c) Verminderde vasculaire integriteit. Controle-geïnjecteerde embryo (boven) en eng MO-geïnjecteerde embryo (onderaan) afgebeeld met behulp van fluorescentie microscopie op 2 dpf in een FLI1: eGFP transgene reporter lijn. Morphants weer aangetast kiemen van intersegmentele schepen en andere vasculaire structuren. 41 (d) Altered hart looping. In situ hybridisatie van uninjected wildtype embryo's (links) tonen spaw expressie in de linker laterale plaat mesoderm, terwijl ccdc39 morphant embryo toonde bilateraal (rechts) of, in de meeste gevallen, niet op te sporen spaw expressie (niet getoond). 43 (e) Nier cysten. Uninjected WT embryo (boven) en ift80 morphant (onderaan). Morphants weergegeven grote cystes (pijl), pericardiale oedeem (pijlpunt) en een gekrulde staart. 44 (f) verminderde glomerulaire filtratie. Fluorescent visualisatie van een controle geïnjecteerde embryo (boven) en ift80 morphant (onder) 24 uur na injectie van rhodamine dextran in het hart. Fluorescentie verspreidt door de bloedsomloop en is bijna volledig af door de nieren gezien de volledige afwezigheid van fluorescentie in de controle. De morphant toont aanhoudende fluorescerende dextran, suggereert verminderde glomerulaire filtratie. 46 (g) Spierdystrofie. WT DNAJB6 mRNA geïnjecteerde embryo's (boven) vertonen een normale langzame myovezels verspreid over de somieten normaal tussen aangrenzende myosepta zoals bepaald door immunokleuring met behulp van anti-slow myosine antilichaam. Mutant DNAJBb (onderaan) toonde gedeeltelijke bij detachering van myovezels voltooien van myosepta in een of meerdere somieten. 19 (h) Somiet hoek. Vergrote levende zijdelings uitzicht op controle uninjected (boven) of kif7 morphants (bodem) afgebeeld op 30 hpf. Morphants weer abnormaal gevormde somieten, toerekenbaar aan buitenbaarmoederlijke Hedgehog signaling in de zebravis myotoom. 47

Alle cijfers aangepast met toestemming.

Discussion

De hier beschreven methoden vormen een algemeen protocol voor de bepaling van nonsynonymous veranderingen geassocieerd met een verscheidenheid van menselijke genetische ziekte fenotypes (tabel 2, figuur 3). Onze benaderingen nuttig gebleken om de mogelijke impact van de variatie op de ziekte fenotypes te evalueren, en om te helpen ontleden ziektemechanismen (zoals de bijdrage van de dominante negatieve mutaties te Bardet-Biedl Syndroom, een voornamelijk autosomaal recessieve aandoening 17). Tot op heden, door de ontwikkeling van de gepresenteerde beslissingsboom, hebben we gemodelleerd tegen redelijke kosten en tijd dan 200 genen causaal verband met genetische afwijkingen, een overmaat 1000 allelen.

Hoewel hier niet in detail besproken hebben we aangetoond dat deze methoden geschikt voor andere soorten genetische letsels, zoals copy number varianten (CNV) en en genetische interacties modelleren. Analyses van dergelijke gebeurtenissen buiten het bereik vande onderhavige werkwijze beschrijving, hoewel ze fundamenteel gebaseerd op hetzelfde principe van systematisch testen van kandidaatgenen (inclusief paren genen gelijktijdig geïnjecteerd) op inductie of verergering van klinisch geschikte fenotypes bepalen. Bijvoorbeeld, op te helderen welke genen 29 in het 16p11.2 CNV het microcefalie waargenomen bij patiënten met verdubbelingen een 660 kb genomisch segment mRNA overeenkomend met elk van de 29 genen in het segment relevant kunnen worden geïnjecteerd en head grootte metingen werden uitgevoerd bij 2 dpf en 5 dpf, onthullen een belangrijke bijdrage van een transcript, KCTD13. 21 Daarnaast hebben we dit model gebruikt voor het testen van genetische interactie van genomische lesies in patiënten met zowel Bardet-Biedl syndroom en de ziekte van Hirschsprung. 22 Door vergelijking van MO onderdrukking van de causale genen van de twee klinische identiteiten afzonderlijk als tegelijkertijd, konden we de resulterende fenotype identificeren being een synergetische interactie in plaats van alleen additief ernst.

Ondanks het feit dat gevestigde hoge sensitiviteit (98%) en specificiteit (> 82%) voor de varianten die bijdragen tot ciliopathies 17, hebben we nog niet over voldoende gegevens om te bepalen of deze zijn generaliseerbaar naar alle fenotypische uitlezingen in zebravis modellen. Hiertoe een groot aantal allelen voorspelde genetisch om ofwel goedaardig of pathogene moet binnen elke categorie fenotypische testen. Dit zal bijzonder belangrijk zijn voor de uitvoering van dergelijke testen in de klinische setting, waarin de functionele interpretatie van VUSs kan diagnostiek en behandeling alleen als een robuuste begrip van valse positieven en vals negatieven kan begeleiden de levering van deze resultaten aan artsen en patiënten te informeren. Niettemin kunnen deze werkwijzen aanzienlijke bijdragen aan een beter begrip van het landschap van menselijke genetische ziekten. We verwachten dat deze modellen zal niet alleen dienen als een founling voor een betere interpretatie van klinische genetische informatie, maar ook worden toegepast als bruikbare modellen voor therapeutische schermen voeren. In vivo gegevens kunnen ook worden vergeleken met in silico computersimulaties uit bronnen zoals PolyPhen 23 Zeef 24, SNPs en GO 25 of MutPred 26 naar concordantie tonen. Merk op dat in een eerdere studie van de voorspelling databases SNPs & GO en MutPred bleken de meest accurate, met nauwkeurigheden slechts 0,82 en 0,81 te bereiken, respectievelijk. 27

Hoewel we de robuustheid van deze methoden geformuleerd voor een subgroep van pediatrische anatomische defecten (tabel 2, figuur 3), bepaalde fenotypen minder handelbaar met deze werkwijzen. Sommige uitzonderingen daargelaten, zijn er drie belangrijke klassen van stoornissen niet vatbaar ons protocol. Adult-onset aandoeningen (zoals de ziekte van Parkinson) vormen een uitdaging model in een embryonale systeem. Langzaam progression degeneratieve fenotypes (zoals frontotemporale dementie) kunnen meer tijd dan de zeven dpf raam van MO activiteit aan een fenotype te produceren vereisen. Andere gen knockdown technologieën zoals RNAi en siRNA zijn te interfereren met of degraderen het gen doelwit, maar het is aangetoond dat geen specifiek zijn, stabiel, niet-toxisch of langdurige zoals MO 28, waardoor ook het beperken van de periode voor fenotypering. Ten derde, sommige gewervelde structuren, zoals de longen van zoogdieren, niet voldoende orthologe structuur in de zebravisembryo. We hebben ook een voorgesteld rampenplan voor het onderzoek van die gevallen waarin WT menselijk mRNA injectie leidt tot een fenotype, hoewel we voorzichtig dit is een ongewone en ongewenste situatie.

Bepaalde ziekte fenotypes kan dan vragen om een ​​grotere mate van abstractie en draagmoederschap. Het is mogelijk dat genfunctie er uiteenlopen voldoende om de fenotypische gelijkenis tussen model en tr verzwakkenue fenotype, of dat zebravis fysiologie inherent compliceert de effecten van de ziekte veroorzaakt. In dergelijke gevallen raden we verdere dissectie van de geproduceerde fenotype voorafgaande aan het ontslag. We hebben een aantal succesvolle voorbeelden waarin problematisch fenotypes voor deze test zijn gemodelleerd in zebravis embryo's. Bijvoorbeeld, mutaties in TCF8 een gen geassocieerd met Fuchs corneale dystrofie (FCD), werden getest met behulp van ons protocol met gastrulatie gebreken vertonen als surrogaat fenotypische uitlezing gebaseerd op de bekende rol van het transcript in de vroege ontwikkeling. 29 In andere gevallen, zoals als adult-onset spierdystrofie veroorzaakt door mutaties in DNAJB6, waren we in staat om myofiber fenotypes in 5dpf embryo's te genereren, ondanks het feit dat mensen zijn beroofd van aanzienlijke spier pathologie in hun eerste drie tot vier decennia van het leven. 19

Naast de voorbijgaande mutant modellen gepresenteerde hebben anderen ook rekening Advantage van deze voorbijgaande systeem menselijke ziekte model in verschillende orgaansystemen. In een voorbeeld werd retinitis pigmentosa in zebravis gemodelleerd door de knockdown van het gen RP2, resulteert in retinale celdood en verminderde retinale lamineren. Redding met humane wildtype mRNA resulteerde in de ontwikkeling van alle drie lagen van retinale lamineren, terwijl vier van de vijf mutante mRNA niet redden. 30 Hoewel dit model van een menselijke zintuiglijke aandoening is gebaseerd op morfologische fenotype is het ook mogelijk assay reactie op prikkels, zoals akoestische schrikreactie of prepulse remming. 47

Onlangs werd een zebravis model gebruikt om Alzheimer pathogenese onderzoeken via amyloid precursor eiwit. 31 De auteurs toonden aan dat gen knockdown veroorzaakt verminderde axonale uitgroei motorneuronen die gered kon worden met menselijke mRNA. Dit model heeft zich bewezen als bijzonder informatief, als muismodellen tonen slechts subtiele phenotYpes (een knock-down) of postnatale letaliteit (dubbele knockdown). De mogelijkheid om de zebravis embryo's in vivo evaluatie in ontwikkeling bijgedragen tot het pathogene effect van verminderde amyloïde precursor eiwit en ontvangen directe bewijs dat het eiwit vereist zowel een extracellulair en intracellulair domein op werking onderscheiden. Andere opvallende modellen zijn die van aanvullende spierdystrofieën 32, Diamond Blackfan bloedarmoede 33, Axenfeld-Reiger syndroom (oculair en craniofaciale ontwikkeling) 34, inflammatoire darmziekten 35 (antibacteriële activiteit), de ziekte van Parkinson 36 (neuron en motoriek verlies), en inbeslagneming 37 (waterhoofd en hyperactiviteit).

Vaker zijn mutante zebravis lijnen die ook aangetoond dat een menselijke ziekte fenotype recapituleren. Beoordeeld in 1,38, modellen zijn voorzien van leukemie, melanoom, gedilateerde cardiomyopathie, Duchenne spierdystrofie,en vele anderen.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgements

Wij erkennen de steun van een Duke University Dean's Summer Research Fellowship (AN), American Heart Association (AHA) fellowship 11POST7160006 (CG), National Institutes of Health (NIH) subsidies R01-EY021872 van het National Eye Institute (EED), R01HD04260 uit de National Institute of Child Health and Development (NK), R01DK072301 en R01DK075972 van het National Institute of Diabetes spijsvertering en Kidney Disorders (NK), en de Europese Unie (Gefinancierd door EU 7e kaderprogramma onder GA nr 241955, project SYSCILIA;. EED, NK) NK is een Distinguished Jean en George W. Brumley Professor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530S, M0530L
DpnI restriction endonuclease NEB R0176L, R0176S
Max Efficiency DH5α competent cells Invitrogen 18258-012
Big Dye Terminator Applied Biosystems 4337455
mMESSAGE mMACHINE Kit Invitrogen AM1340, AM1344, AM1348
Morpholino Gene-Tools n/a
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma Aldrich P7629 Prepare as 0.003% PTU in embryo media
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich P6148 For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4%
Tricaine methane sulfonate Western Chemical N/A For anesthetization and euthanasia
Equipment
PTC-225 Tetrad Thermal Cycler BioRad Any equivalent thermal cycler
Nano Drop 2000 spectrophotometer Thermo Scientific
SMZ 745T Stereomicroscope Nikon
AZ100 Stereomicroscope Nikon
DS Fi1 Digital Camera Nikon For color/fluorescent imaging
DS QiMC Digital Camera Nikon For black/white imaging
Advanced Resarch 3.2 Imaging Software NIS- Elements

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
  2. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1, 1559-1582 (2006).
  3. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).
  4. Detrich, H. W., Westerfield, M. 3rd, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
  5. Gerdes, J. M., Davis, E. E., Katsanis, N. The vertebrate primary cilium in development, homeostasis, and disease. Cell. 137, 32-45 (2009).
  6. Hildebrandt, F., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N. Engl. J. Med. 364, 1533-1543 (2011).
  7. Zaghloul, N. A., Katsanis, N. Mechanistic insights into Bardet-Biedl syndrome, a model ciliopathy. J. Clin. Invest. 119, 428-437 (2009).
  8. Marion, V. Exome sequencing identifies mutations in LZTFL1, a BBSome and smoothened trafficking regulator, in a family with Bardet-Biedl syndrome with situs inversus and insertional polydactyly. J. Med. Genet. 49, 317-321 (2012).
  9. Otto, E. A. Candidate exome capture identifies mutation of SDCCAG8 as the cause of a retinal-renal ciliopathy. Nat. Genet. 42, 840-850 (2010).
  10. Schaefer, E. Molecular diagnosis reveals genetic heterogeneity for the overlapping MKKS and BBS phenotypes. Eur. J. Med. Genet. 54, 157-160 (2011).
  11. Katsanis, N. The oligogenic properties of Bardet-Biedl syndrome. Hum. Mol. Genet. 13 Spec No 1, R65-R71 (2004).
  12. Badano, J. L. Dissection of epistasis in oligogenic Bardet-Biedl syndrome. Nature. 439, 326-330 (1038).
  13. Badano, J. L. Heterozygous mutations in BBS1, BBS2 and BBS6 have a potential epistatic effect on Bardet-Biedl patients with two mutations at a second BBS locus. Hum. Mol. Genet. 12, 1651-1659 (2003).
  14. Gerdes, J. M. Disruption of the basal body compromises proteasomal function and perturbs intracellular Wnt response. Nat. Genet. 39, 1350-1360 (2007).
  15. Leitch, C. C. Hypomorphic mutations in syndromic encephalocele genes are associated with Bardet-Biedl syndrome. Nat. Genet. 40, 443-448 (2008).
  16. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).
  17. Zaghloul, N. A., et al. Functional analyses of variants reveal a significant role for dominant negative and common alleles in oligogenic Bardet-Biedl syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10602-10607 (2010).
  18. Davis, E. E. TTC21B contributes both causal and modifying alleles across the ciliopathy spectrum. Nat. Genet. 43, 189-196 (2011).
  19. Sarparanta, J., et al. Mutations affecting the cytoplasmic functions of the co-chaperone DNAJB6 cause limb-girdle muscular dystrophy. Nat. Genet. 44, 450-455 (2012).
  20. Selcen, D. Mutation in BAG3 causes severe dominant childhood muscular dystrophy. Annals of neurology. 65, 83-89 (2009).
  21. Golzio, C., et al. KCTD13 is a major driver of mirrored neuroanatomical phenotypes of the 16p11.2 copy number variant. Nature. 485, 363-367 (2012).
  22. de Pontual, L., et al. Epistasis between RET and BBS mutations modulates enteric innervation and causes syndromic Hirschsprung disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13921-13926 (2009).
  23. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7, 248-249 (2010).
  24. Kumar, P., Henikoff, S., Ng, P. C. Predicting the effects of coding non-synonymous variants on protein function using the SIFT algorithm. Nat. Protoc. 4, 1073-1081 (2009).
  25. Calabrese, R., Capriotti, E., Fariselli, P., Martelli, P. L., Casadio, R. Functional annotations improve the predictive score of human disease-related mutations in proteins. Hum. Mutat. 30, 1237-1244 (2009).
  26. Li, B., et al. Automated inference of molecular mechanisms of disease from amino acid substitutions. Bioinformatics. 25, 2744-2750 (2009).
  27. Thusberg, J., Olatubosun, A., Vihinen, M. Performance of mutation pathogenicity prediction methods on missense variants. Hum. Mutat. 32, 358-368 (2011).
  28. Summerton, J. E. Morpholino, siRNA, and S-DNA compared: impact of structure and mechanism of action on off-target effects and sequence specificity. Curr. Top. Med. Chem. 7, 651-660 (2007).
  29. Riazuddin, S. A., et al. Missense mutations in TCF8 cause late-onset Fuchs corneal dystrophy and interact with FCD4 on chromosome 9p. Am. J. Hum. Genet. 86, 45-53 (2010).
  30. Shu, X., et al. Knockdown of the zebrafish ortholog of the retinitis pigmentosa 2 (RP2) gene results in retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 2960-2966 (2011).
  31. Song, P., Pimplikar, S. W. Knockdown of amyloid precursor protein in zebrafish causes defects in motor axon outgrowth. PloS one. 7, e34209 (2012).
  32. Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum. Mol. Genet. 19, 623-633 (2010).
  33. Danilova, N., Sakamoto, K. M., Lin, S. Ribosomal protein S19 deficiency in zebrafish leads to developmental abnormalities and defective erythropoiesis through activation of p53 protein family. Blood. 112, 5228-5237 (2008).
  34. Bohnsack, B. L., Kasprick, D. S., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. A zebrafish model of axenfeld-rieger syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 7-22 (2012).
  35. Oehlers, S. H., et al. The inflammatory bowel disease (IBD) susceptibility genes NOD1 and NOD2 have conserved anti-bacterial roles in zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4, 832-841 (2011).
  36. Sheng, D., et al. Deletion of the WD40 domain of LRRK2 in Zebrafish causes Parkinsonism-like loss of neurons and locomotive defect. PLoS genetics. 6, e1000914 (2010).
  37. Teng, Y., et al. Loss of zebrafish lgi1b leads to hydrocephalus and sensitization to pentylenetetrazol induced seizure-like behavior. PloS one. 6, e24596 (2011).
  38. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J. Clin. Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  39. Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods Cell Biol. 76, 415-436 (2004).
  40. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, 307-318 (2002).
  41. Lee, N. Y. Endoglin regulates PI3-kinase/Akt trafficking and signaling to alter endothelial capillary stability during angiogenesis. Molecular Biology of the Cell. 23, 2412-2423 (2012).
  42. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 228, 30-40 (2003).
  43. Merveille, A. C., et al. CCDC39 is required for assembly of inner dynein arms and the dynein regulatory complex and for normal ciliary motility in humans and dogs. Nat. Genet. 43, 72-78 (2011).
  44. Beales, P. L. IFT80, which encodes a conserved intraflagellar transport protein, is mutated in Jeune asphyxiating thoracic dystrophy. Nat. Genet. 39, 727-729 (2007).
  45. Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish kidney development. Methods Cell Biol. 100, 233-260 (2010).
  46. Tobin, J. L., Beales, P. L. Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies. Pediatr. Nephrol. 23, 2095-2099 (2008).
  47. Putoux, A. KIF7 mutations cause fetal hydrolethalus and acrocallosal syndromes. Nat. Genet. 43, 601-606 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics