Opprette dynamiske bilder av kortlivede Dopamin Svingninger med lp-ntPET: Dopamin Filmer av Sigarettrøyking

Behavior
 

Summary

Vi presenterer en ny PET billeddiagnostikk tilnærming for å fange dopamin svingninger forårsaket av sigarettrøyking. Emner røyke i PET-skanner. Dynamiske PET-bildene blir modellert voksel-by-voksel i tid av LP-ntPET, som omfatter en tidsvarierende dopamin sikt. Resultatene er 'filmer' av dopamin svingninger i striatum under røyking.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Morris, E. D., Kim, S. J., Sullivan, J. M., Wang, S., Normandin, M. D., Constantinescu, C. C., Cosgrove, K. P. Creating Dynamic Images of Short-lived Dopamine Fluctuations with lp-ntPET: Dopamine Movies of Cigarette Smoking. J. Vis. Exp. (78), e50358, doi:10.3791/50358 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vi beskriver eksperimentelle og statistiske trinnene for å opprette dopamin filmer av hjernen fra dynamiske PET data. Filmene representerer minutt-til-minutt svingninger av dopamin indusert ved å røyke en sigarett. Røyker er avbildet under en naturlig smoking opplevelse mens andre mulige konfunderende effekter (for eksempel hode bevegelse, forventning, nyhet, eller aversjon mot å røyke flere ganger) er minimert.

Vi presenterer detaljene i vår unike analyse. Konvensjonelle metoder for PET analyse estimat tidsinvariante kinetiske modellparametrene som ikke fanger opp kortsiktige svingninger i neurotransmitterfrigivning. Vår analyse - noe som gir en dopamin film - er basert på vårt arbeid med kinetiske modeller og andre nedbrytningsprodukter teknikker som gjør det mulig for tidsvarierende parametere 1-7. Dette aspektet av analysen - temporal-variant - er nøkkelen til vårt arbeid. Fordi vår modell er også lineær i parametrene, er det praktisk, beregningsmessig, å søke på the voxel nivå. Analysen teknikken består av fem hovedtrinn: pre-prosessering, modellering, statistisk sammenligning, maskering og visualisering. Forbehandling brukes til PET-data med en unik "HYPR 'romlig filter åtte som reduserer romlig støy, men bevarer kritisk temporal informasjon. Modellering identifiserer tidsvarierende funksjon som best beskriver dopamin effekt på 11 C-Raclopride opptak. Den statistiske trinnet sammenligner tilpasning av vår (lp-ntPET) modell 7 til en konvensjonell modell 9. Maskering begrenser behandling til disse voxels best beskrevet av den nye modellen. Visualisering kartlegger dopamin funksjon på hver voxel til en fargeskala og produserer en dopamin film. Foreløpige resultater og prøve dopamin filmer av sigarettrøyking presenteres.

Introduction

Til tross for overveldende bevis for medisinsk risiko, er tobakksrøyking fortsatt et stort helseproblem. Det er rett og slett veldig vanskelig å slutte å røyke. Over 20% av den voksne amerikanske befolkningen fortsetter å røyke, og de ​​fleste røykere som forsøker å slutte tilbakefall innen den første måneden 10. Dessverre, er det få tilgjengelige behandlinger for å hjelpe til ved røykeavvenning og / eller redusere nikotinavhengighet. I vårt laboratorium, er vi interessert i å bruke PET billeddiagnostikk å forstå avhengighet og avhengighet for å hjelpe til med utviklingen av nye medisiner for røykeslutt og andre narkotika-tar.

Den raske økningen av dopamin i striatum antas å kode vanedannende ansvar av narkotika og atferd 11 og den raske retur av dopamin til baseline kan være relatert til tilbaketrekking og påfølgende narkotika-søkende. For noen vanedannende stoffer og atferd som røyking, er heving av striatal dopamin svært kortvarig (minutter); the størrelsen av økningen ikke er stor (1-2X grunnlinje), og den romlige utstrekningen av disse reaksjoner kan være begrenset til små subregioner av striatum.

Dyreforsøk viser tydelig at nikotin forårsaker dopamin utgivelse i nucleus accumbens av rotter 12. Men tidlige forsøk som bruker konvensjonelle analyser - å estimere dopamin endringer hos mennesker under eller etter nikotin eller røyking har gitt upålitelige og motstridende resultater 13-18. Noen av disse studiene tillot røykere å røyke utenfor skanneren. Andre leveres bare nikotin til emnet. Til beste studie avhengighet til sigaretter, setter vi ut for å utvikle bedre bildebehandling protokoller og utfylle dem med avanserte analyser som ville tillate oss å fange hjernens respons på en kvasi-naturlig røykeatferd.

Positron emisjons tomografi (PET) er unik blant hjernen skanning teknikker i sin evne til å sondere neurochemistry av den menneskelige hjerne < em> in vivo. Mange PET sporstoff eksisterer for å spore dopamin-reseptorer og mange er utsatt for konkurranse med endogent dopamin. Dessverre er de konvensjonelle metoder for PET-bilde-analyse beregne den stabile tilstanden forholdet mellom bundet til fritt sporstoff, kjent som binding potensial (analogt med in vitro-metode), fra dynamiske PET-bildene. En tydelig endring i steady state-forhold (f.eks, fra grunnlinjen til røyking tilstand) er tatt for å indikere dopamin endring. Men dopamin endringer med betydning for avhengighet er iboende forbigående så estimater av en steady-state kvantitet er feil. Videre de typiske region-of-interesse analyse gjennomsnitt tracer konsentrasjon over store anatomisk definerte regioner og vil trolig gå glipp av svært lokaliserte hjernen svar - slik som de vi forventer av sigarettrøyking. Tidligere PET studier av røyking kan også ha lidd av bevegelse av røykernes hodet under røyking på skanneren.

jove_content "> Funksjonell MRI (fMRI) tilbyr den nødvendige romlig og tidsmessig oppløsning som ville være nødvendig for å fange opp hendelser i sub-regioner i striatum på minuttet tid-skala, men fMRI mangler molekylær spesifisitet av PET. Den BOLD signal stammer fra . endringer i blodstrømmen og er derfor neuronally og molekylært uspesifikke Dermed benyttet vi PET - men på en ny måte Målet med denne protokollen var å estimere de korte og lokalisert dopamin svar til røyking fordi de antas å ligge til grunn for den neurochemical manifestasjon av. craving og narkotika-søkende atferd.

Å anslå dopamin transienter som er tatt i dynamiske PET-bilder laget med dopamin-reseptorligander, vi tidligere innført en rekke kinetiske modeller, kollektivt referert til som "ntPET" for nevrotransmitter PET 1,5,6,19, som var basert på vanlig to-vev kupé modell, men ble forsterket av vilkår for tid-variasjon i dopamin og samspillet mellom dopamin og tracer (dvs. konkurranse). Disse modellene har blitt validert mot en gullstandard. Konkret har vi vist at våre modeller spår dopamin konsentrasjoner over tid fra PET data fra rotter som er i god overensstemmelse med samtidig ervervet Mikrodialyse målinger 4,7 Fordeler:. Den siste av våre modeller har vært enten lineære og ikke-parametrisk (np -ntPET) en eller lineær og parametrisk (lp-ntPET) 7. Den sistnevnte modell stammer fra en tidligere lineære modellen innført av Alpert et al. 20.. Linearisering er en viktig utvikling fordi det sikrer at bruk av modellene til dynamiske data på voxel nivå er beregningsmessig enkel. I en fersk proof-of-concept papir, var vi i stand til å skape dopamin filmer av et menneske utfører en motor oppgave 3 og vise at filmene var følsom for timing av motoren oppgave som ville være forventet. Movies er representasjoner av den tiden løpet av dopamin nivåer på hver voksel i et bilde. Voxel-by-Voxel metoder i PET generelt lider av lav signal til støy-forhold, så for å minimere støy som ligger i voxel-baserte tid-aktivitet kurver (totalkvoter), bruker vi en innovativ romlig filter, 'HYPR', 8 som en pre -prosessering trinn. Dette trinnet bevarer viktige timelige egenskapene til de responderer voxels mens man reduserer støy.

Røyking er mer enn nikotinavlevering. Sigaretter inneholder 4000 kjemikalier i tillegg til nikotin. Mens nikotin antas å være hovedansvarlig for den første vanedannende effekter, alle de andre signaler og sensoriske komponenter av røyking blir forsterkende til en vanlig røyker. Vi valgte å studere hele oppførselen til røyking som betydde at vi måtte være i stand til å ta bilder røykerne røykte, mens inne i PET-skanner. Dessverre, med røyking kommer hodet bevegelse. For å eliminere head bevegelsesfeil i bildene våre, bruker vi Vicra motion-tracking system (NDI Systems, Waterloo, Canada) og event-by-event bevegelse korreksjon som en del av en iterativ, oppløsning utvinning rekonstruksjon algoritme 21.

Våre nye skanning og analyse metoder er utviklet for å lokke fram og ta korte og lokalisert dopamin transienter som er de unike signaturer av hjernens respons på vanedannende legemidler og atferd. Fremført voxel-by-voxel, våre modeller produsere et dynamisk sett av bilder av striatum dopamin svingninger - dvs. "dopamin filmer". Disse filmene representerer en ny spatio-temporal biomarkør for avhengighet og kan tjene som en direkte, multidimensjonal indikator på risiko for avhengighet og / eller indikator på behandlingseffekt.

Protocol

Et omriss av hele fremgangsmåten, som er beskrevet nedenfor, for fremstilling av multi-skive dopamin-filmer er oppsummert i flytdiagrammet i figur 1..

  1. Pre-PET MR-skanning

    Erverve en strukturell MR-skanning på en egen dag fra PET scan. MR skanning vil gi en anatomisk referanse for PET-bilder. Typiske oppkjøp parametere for den strukturelle MRI er: 3D MPRAGE MR puls sekvens med TE = 3,3 ms, flip vinkel = 7 grader, slice tykkelse = 1,0 mm, 0,98 x 0,98 mm piksler.

    1. Praksis PET / Smoking Session

      Ordne for faget å praktisere røyking bevegelse i PET skanner enten før skanningen eller, ideelt sett, på et tidligere besøk til PET-senter. Dette vil unngå forvirring eller ubehag under selve PET scan. Det vil også eliminere nyheten av å være i skanneren for første gang. Fordi Siemens HRRT er en høy oppløsning hjerne skanner, er tunnelen smalog det er minimal klaring for de røyker for å bringe sigaretten til hans / hennes munn. Selv om vi har et avansert system for adressering hodet bevegelse, er det likevel lurt å ha de røyker praksis røyke mens du prøver ikke å flytte hans / hennes hode.

    2. Pasient Prep
      1. IV linjen

        En IV må settes inn ved en sykepleier og klargjort for senere festing til pumpen som leverer den tracer. Tracer vil bli injisert inn i pasienten gjennom en IV linje.

      2. Hode Motion Monitor

        Feste reflekterende kuler til toppen av hodet av faget. Den Vicra head-tracking system lasere meningsmåling posisjonen reflekterende kuler med en hastighet på 20 Hz. Kulene er festet til stive, korsformet "tool" og verktøyet er festet til et Lycra badehetten bæres av emnet. En sanntids visning av posisjonen av verktøyet skal brukes i undersøkelsen å overvåke driften av hodet bevegelse og for å være sikker på at laseren syste m har en uhindret utsikt over verktøyet og tar opp hode posisjon kontinuerlig for senere bruk i bilde gjenoppbygging.

    3. Forbered Injection Pump
      1. Program pumpen med riktig infusjon paradigme for Raclopride å maksimere følsomheten av PET-bilder til dopamin svingninger gjennom skanningen, administrere tracer, 11 C-Raclopride, som en innledende bolus etterfulgt av en kontinuerlig infusjon. For å finne den riktige relative mengder av tracer som skal leveres i den innledende bolus vs infusjon, følger vi metoden for Carson et al. 22. å beregne forholdet mellom dose i bolus til infusjonshastigheten ("Kbol" i enheter av minutter ) Når man kjenner posisjonen av pulsresponsen funksjon av 11 C-Raclopride hos mennesker. Leveringen av tracer i henhold til en gitt protokoll er styrt av en intern datamaskin-program som driver en programmerbar infusjonspumpe.
    4. Begynn luftfiltert "> For å eliminere secondhand røyk fra PET suite under røyking, plasserer inntak av en luft-filter (Movex Inc, Northampton, PA) foran på skanneren og over emnet hode. Forlate rommet for et emne å bringe sigarett til hans / hennes munn under røking. Filteret blir slått på før undersøkelsen, og brukes under alle forhold hvis flere skanninger utføres.

    5. Transmission skanning

      Erverve en 9 min overføring skanne før injeksjon av tracer og oppkjøpet av PET scan. Girkassen er anskaffet for å lage en 3D-kart av den lineære dempningskoeffisient i hele hjernen. Dempningen kart benyttes i gjenoppbyggingen av utslipp (PET)-bilder.

  2. PET Scan
    1. Starte injeksjon og PET scan

      En sertifisert nukleærmedisin teknolog må administrere tracer. Vanligvis starter et team av to teknologer tracer administrasjon og PET datainnsamling samtidig ly.

    2. Skåringsskalaer på tidspunktet for røyking

      Administrere enkle spørreskjemaer, muntlig, til faget umiddelbart før og etter røyking. De røyker må vurdere hans / hennes craving, tilfredsstillelse av begjær, nikotin høy, og følelser av avsky på en skala fra 1-100.

    3. Røyking

      For å fange opp dopamin svar på en naturalistisk smoking erfaring, instruere røyker til å røyke i sitt eget tempo, røyker sin egen merkevare av sigaretter, og viktigste, utføre røyking av seg selv, heller enn å ha nikotin eller sigaretten administreres av studiet personell. Røykere - som har vært rusfrie siden forrige midnatt - røyker to sigaretter på rad. De vanligvis tar ca 10 min å fullføre både sigaretter.

    4. Skåringsskalaer post-røyking (som nevnt ovenfor).
  3. Post-PET scan
    1. Komplett skanne, sende til gjenoppbygging via Molar hjelp Vicra dataontent "> Etter oppkjøpet er fullført, rekonstruere liste-modus data (en oversikt over hver enkelt forfall arrangementet med sin tid og sted) til utslipp bilder. Gjenoppbyggingen algoritmen som brukes i vårt senter er en iterativ algoritme (Carson, Barker et al . 21) som korrigerer for bevegelse på arrangementet nivå ved hjelp av høyfrekvente Vicra innspillinger. Korreksjoner for scatter, demping, dødtid, og normalisering, skanner geometri, og punkt-spread-funksjon er også inkludert i algoritmen. Gjenoppbyggingen produserer en dynamisk serie med 3D-PET-bilder på pre-utvalgte tidsrammer.

    2. MR pre-prosessering og MR-PET registrering

      Bruk standard algoritmer for å fjerne skallen fra motivets MR bilde 23. MR må være de-skulled før samkjøre med PET fordi de fleste sporstoffer ikke blir tatt opp av skallen.

  4. Filtrere dynamiske PET data med HYPR

    Påfør en variant avromlig filtrering metode, Highly Constrained Backprojection (HYPR-LR) til alle PET-bilder i en frame-by-frame måte å følge arbeidet til Christian et al. 8,24. Anken av HYPR-LR er at det reduserer romlig støy uten å svekke den timelige informasjon på hver voxel som vi vil bruke til å lage våre dopamin filmer.

  5. Juster PET data til MR mal

    Juster PET til fagets MR data og det ble oppnådd transformasjonsmatrisa en. (Dette gjøres vanligvis med et bilde fra tidlig i PET scan.) Registrer MR data til en standard MR mal for å gi transformasjonsmatrisa to. Kombiner transformasjoner 1 og 2 for å registrere HYPR-filtrerte PET data til standard mal plass. Dataene er nå i en standard anatomisk plass med isotrope voxels (2 mm x 2 mm x 2 mm).

  6. Påfør striatal Mask

    Raclopride har tilstrekkelig signal til bakgrunnsstøy motsetning til å bli brukt bare i striatum. Dette er området av hjernensom er innblandet i narkotikamisbruk. Etter Martinez et al. 25. bruke en maske av pre-commissural striatum (ventral striatum, dorsal caudatus, rygg putamen) til alle PET-data i malen plass.

  7. Voxel-baserte anfall av to modeller
    1. Velg dopamin respons funksjoner for lp-ntPET

      Velg respons funksjoner som er i samsvar med mulige dopamin svar på stimulans. Ved å velge et bestemt sett av respons funksjoner, kan man begrense form og timing av de estimerte dopamin svar på kurver som er forventet for vår bestemt stimulus. For røyking, forventer vi en unimodal stige og falle av dopamin konsentrasjon (en "gamma-variate" formet kurve). I tilfelle av røyking ved 45 min inn under skanningen, familier av respons-funksjoner med "take-off"-tider på 40 min (for å tillate en viss spenning) og senere er inkludert.

    2. Påfør lp-ntPET modell

      Monter lp-ntPET model til PET-kvoter ved hver enkelt voksel i det maskerte område i henhold til metoden av Normandin et al. 7.. Det operative ligning av modellen er vist i figur 3a. Integralet av produktet av det PET TAC med hver responsfunksjon blir et sett med lineære basis-funksjoner som bidrar til modellen (se siste leddet i den operative ligning). Fordi lp-ntPET er en lineær, basisfunksjon-basert metode for montering av de dynamiske PET-data, kan det settes i verk for å raskt estimere både (a) kinetiske parametre som styrer virkningen av tracer, og (b) en tid-profil av relativ dopamin konsentrasjon endring under skanningen økten, på hver voxel.

      1. Lag WSSR kart

        Registrere vektet sum av kvadrerte residualer (WSSR) kart over anfall av lp-ntPET til dataene på hver voxel (WSSR lp-ntPET) til bruk, nedenfor. Montering av modellen ved hver voxel produserer bilder av tracer parametere: 1 R, 2 k </ Sub>, k 2a, og γ. R1 er den relative strømningsverdi, k er 2 effluks satsen i referanse-regionen, er k 2a den tilsynelatende hastighet effluks i målområdet, og γ er omfanget av dopamin-signalet. Den vektede summen av kvadrerte residualer ved hver voxel kan betraktes som et bilde også.

    3. Påfør (konvensjonell) multilinear Reference Tissue Model (MRTM)

      Monter MRTM modell etter ni til PET-tid-aktivitet data på hvert enkelt voksel i den maskerte regionen. MRTM er en lineær modell - påføres typisk til dynamiske PET-data - som er identisk med lp-ntPET bortsett fra at den mangler en tidsvarierende dopamin sikt. Montering MRTM til voxel-messig data avkastning estimater av bare tre parametriske bilder: 1 R, k 2, k 2a. Registrere vektet sum av kvadrater kart over anfall av MRTM (WSSR MRTM) til dataene på hver voxel også.

  8. <li> Beregn en F-map

    Lag en F-kart fra summen av kvadrater maps ved å beregne F-statistikken ved hver voksel i masken. F-statistikken sammenligner WSSR lp-ntPET til WSSR MRTM, korrigert for forskjeller i grader av frihet i de respektive passer.

  9. Terskel F-kartet

    Terskel F-kart på en verdi som kan oversettes til en sannsynlighet på p <0,05 (basert på grader av frihet i modellen passer). Terskelen er den samme ved hver voksel. Binarize på kartet for å foreta en ny "Betydning Mask" som beholder bare de voxels i striatum som PET totalkvoter er passe (statistisk) bedre med lp-ntPET enn med MRTM.

  10. Filtrere Betydning Mask

    Utfør et morfologisk "åpning" (erosjon etterfulgt av dilatasjon) på betydningen Mask å eliminere små, isolerte klynger av voxels som vi antar å være på grunn av støy. En isotrop 2 x 2 x 2 voxel-kjernen blir brukt til å reflytte isolerte grupper av voxels med diameter på 2 voxels eller mindre. Vi har nå en Final Betydning Mask.

  11. Lag 4D dopamin film i farger

    Lagre verdien av den estimerte dopamin kurven normalisert ved k 2a ved hver voksel i finalen Signifcance Mask. Disse data utgjør "normalisert dopamin-bilder", og vil være fire-dimensjonal. De er, effektivt, fant den relative dopamin verdi ved hver tids-punkt for hver voksel å ha en betydelig dopamin respons på stimuli. Lag en fargekodet bildeserie ved å bruke en fargeoppslagstabellen til de normaliserte dopamin bilder. Overlappe de fargekodede dopamin bilder på tilsvarende MR mal image. Lagre rekken av fargekodede bilder som en *. Png-fil. Dette er en enkelt-slice "dopamin film". Ordne dopamin filmer for hver skive som inneholder ventral striatum til en film. Denne ordningen er en multi-slice dopamin film.

  12. Analyser røyking data og kontroll data similarly

    Utføre den samme analyse på data fra hver eksperimentell tilstand som skal undersøkes. For dette prosjektet, kjøpte vi inn og analysert data for hvert fag i to separate forhold: røyking og kontroll (ingen røyking).

  13. Sammenligne røyking å kontrollere ved å konstruere en sammensatt dopamin film

    Produsere dopamin filmer for samme fag i ulike forhold, for eksempel baseline eller humbug oppgave vs røyking. Produsere en "kompositt dopamin filmen" for ett fag for alle skiver av striatum for baseline og røyking.

  14. Kjør filmen

    Spille "multi-slice dopamin filmen" (vist i resultater) å avdekke romlige og tidsmessige mønstre som utgjør hjernens unike dopaminergic respons på røyke sigaretter.

Representative Results

Figur 2. Effekten av to ulike HYPR romlige filtre på glatthet av tid-aktivitetsdata på ett striatal voksel. Øverste rad: 11 C-Raclopride PET utslipp bilder fra en tre minutters ramme sentrert på 46,5 minutter (ikke filtrert, filtrert med en 3 x 3 x 3 voxel kernel, filtrert av en 5 x 5 x 5 voxel kjernen). Midterste rad: 11 C-Raclopride PET utslipp bilder fra en tre minutters ramme sentrert på 61,5 minutter (ikke filtrert, filtrert med en 3 x 3 x 3 voxel kernel, filtrert av en 5 x 5 x 5 voxel kjernen). Nederste rad: Tilsvarende gang aktivitet kurver fra samme singel voxel beliggenhet i venstre dorsal caudatus. Legg merke til at den tilsynelatende fall i den 11 C-Raclopride opptak (på grunn av frigjøring av dopamin) ved røyking blir bevart selv om støyen er redusert med større filter størrelse.

Figur 3. Et utvalg av representative dopamin respons funksjoner som var pre-computed for montering av lp-ntPET modellen til PET-tid-aktivitetsdata ved hver voxel ifølge Normandin et al. 7. I tilfelle av vår røyking paradigmet, løper sigarettrøyking 45 minutter etter injeksjonen begynner tracer. Selv om striatum dopamin svar kode påvente av å røyke - for eksempel på grunn av håndteringen av sigarett eller andre signaler som forutsier røyke - vi begrunnet at responsen funksjoner kan trygt være begrenset til kurver som tar av fra baseline tidligst fem minutter før røyking (a). Tilsvarende ble kurver begrenset til take-off ganger senest 15 minutter etter start av røyking. Kurver med take-off ganger på 40 minutter representerer mulige dopaminerge reaksjoner på grunn av forventning (b) Representative respons funksjoner alt tar av fra baseline på 45 minutter;. Tiden når røyking starter. 500 ulike plausible respons funksjonene er generert. For illustrasjon, tomter i <strong> (a) og (b) viser kun et utvalg av kurveformer og take-off tider.

Figur 4. (A) Det operative ligningen for lp-ntPET modell. Modellen er lineær i parametrene (en R, 2 k, k 2a, γ) som gir rask beregning av parameter estimater på hver voxel innenfor striatal maske. (B) parametriske bilder av (en R, 2 k, k 2a, γ ) for en enkelt koronale hjernen skive for et enkelt emne. Selv γ alene er parameteren som koder størrelsesordenen dopamin reaksjon, simultan beregning av alle fire parametere tracer er nødvendig å montere modellen til de tid-aktivitetsdata ved hver voksel.

Figur 5. Anfall av de konvensjonelle (MRTM) og nye (lp-ntPET) modeller til gang-aktivitetsdata fra en voksel i venstre caudatus. MRTM passform er i blått. lp-ntPET passform er i rødt.

Figur 6. (a) viser vektet sum av kvadrerte residualer (WSSR) fra MRTM og (b) fra lp-ntPET passer til dataene på hver striatal voksel. De to WSSR bilder produsert fra de samme data sammenliknes for å produsere et kart av den F-forhold ved hver voksel (dvs. en F-kartet), vist i (c). (D) F-kart er thresholded til p <0,05 å produsere en binær betydning kartet (se trinn 2.10 av protokollen). For n tidsrammer, og fire parametere for lp-ntPET modell, terskelen for F-statistikken som tilsvarer en sannsynlighet nivå, p <0.05 (for 90 minutter av data grupperte i tre-minutters rammer, er terskelen 4.23) (e ) Betydningen kart blir filtrert med et filter morfologisk (en "åpning") for å eliminere små klynger av voksler som er mest sannsynlig å representere støy. The Final Betydning Mask bevarer bare de voxels i striatum som totalkvoter er bedre plass (statistically) ved lp-ntPET modell i motsetning til den konvensjonelle MRTM modell og således er antatt å inneholde en dopaminerg respons til røyking. Denne terskelen ikke løser for multiple sammenligninger. I stedet for å beskytte mot falske positive funn, skaper vi Endelige Betydning Masker for en kontroll tilstand også (se Figur 7 og protokoll Steps 01.08 til 01.10).

Figur 7. (A) viser en koronale bit av Final betydning Mask for røyking tilstand i et enkelt fag. Figur (b) viser den endelige Betydning Mask for tilsvarende fag og skive i sin opprinnelige tilstand. Tilstedeværelsen av klynger av tilbakeholdt voxels i masken av røyking i motsetning til den nesten fullstendig fravær av klynger i masken av kontroll støtter påstanden om at dopamin-filmer (se nedenfor) er ikke bare tilfeldigheter eller hendelser knyttet til støy i data. (Merk: det injiserte aktivitet - end dermed signal til støyforhold - i referansebanen og røking var sammenlignbare).

Figur 8. Dopamin-film fra en enkelt stykke hjernen i koronale orientering viser frame-by-frame dopamin nivå i forhold til basal (hvile) dopamin nivå. (A) viser filmen med opprinnelige tilstand og (b) viser filmen av røyking tilstand. De dopamin-nivåene er kodet i farge. Nærmere bestemt fargene - vist i fargestolpen med tilsvarende tallverdier - representerer endringen i dopamin over den basale nivå som en prosent av basal. Igjen er dopamin nivåer vises bare for voxels i finalen Betydning Mask som overstiger p <0,05 signifikansnivå.

Figur 9. Den multi-slice, multi-condition dopamin film for samme fag som i figur 8 med alle skiver av ventrale striatum vises samtidig f eller baseline og røking.

Figur 1
Figur 1. Flytskjema av eksperiment og bildeanalyse prosedyrer (ac). Klikk her for å se større figur .

Figur 2
Figur 2. Effekter av HYPR filtre av forskjellig kernel størrelse på bilder (topp-og mellomledere) og i tide aktivitet kurver (nederst) på en enkelt voksel. Klikk her for å se større figur .

/ Files/ftp_upload/50358/50358fig3.jpg "/>
Figur 3. Eksempler på dopamin-respons-funksjoner som avgang ved (a) 40 min, eller (b) 45 min post-injeksjon tracer.

Figur 4
Figur 4. Parametriske bilde generert ved å montere lp-ntPET operativt ligning (a) til pet. Dataene (B) som svarer til de fire parametrene av modellen, en R, 2 k, k 2a, γ, ble evaluert for striatum og vist kledde på tilsvarende MR skive. Klikk her for å se større figur .

iles/ftp_upload/50358/50358fig5.jpg "/>
Figur 5. Anfall av MRTM (blå) og lp-ntPET (rød) modeller til annen-aktivitet data fra en enkelt voksel.

Figur 6
Figur 6. Parametriske bilder av WSSR for (a) MRTM og (b) lp-ntPET. WSSR De respektive baner sammenlignes for å skape F-kartet (c), som i sin tur er thresholded til en binær maske (d) og deretter filtrert for å produsere finalen Betydning Mask. Klikk her for å se større figur .

Figur 7
Figur 7. Sammenligning av Endelige Signifcance Masker for røyking (a) og kontroll

Figur 8.Single-slice dopamin film for enkelt emne i kontroll ('resten') og røking. Klikk her for å se Figur 8 .

Figur 9.Multi-slice dopamin film for enkelt fag i (øverst) røyking og (nederst) kontroll ('resten') forhold. Klikk her for å se Figur 9 .

Discussion

Funn i PET litteratur på dopamin respons til røyking er i strid 13-18. Det kan være mange grunner til dette. Ulike metodiske problemer oppstår med ethvert forsøk på å avbilde sigarettrøyking. I det minste må man kjempe med mulige bevegelsesfeil i dataene, passiv røyking eksponering for forskere, beskjedne og kortvarige endringer i dopamin som forårsaker kun minimale endringer til opptak og retensjon av tracer, 11 C-Raclopride .

Kunstig induksjon av en stor og vedvarende respons av dopamin kan være mulig ved administrering av en intravenøs injeksjon av en stor dose av nikotin. Dette ville imidlertid være i strid med våre underliggende mål å skape dopamin filmer av sigarettrøyking. Vår hensikt var å undersøke så nøye som mulig dopaminerge respons på hele oppførselen til røyking. I forskning på avhengighet, er et viktig skille mellom passiv forvaltningav narkotika til et emne og selvadministrering. Vårt mål var å image selvadministrering - en røyker røyke hans / hennes egen foretrukne merkevare av sigarett - for å fange og karakterisere den korte dopaminergic respons til røyking. PET analyser vanligvis anta at effekten av et medikament eller annen utfordring er langlivede forhold til varigheten til skanningen. Imaging røyking dermed nødvendig innovasjoner innen modellering og eksperimentering med PET.

Kritiske trinn i protokollen vår

Tilrettelegging røyking i skanneren

  1. For å image selvadministrering (dvs. røyking) måtte vi eliminere passiv røyking til tilfredsstillelse av vår Environmental Health and Safety avdeling. Dette ble oppnådd ved bruk av en bærbar luftfiltreringssystem som trekker luften som omgir den gjenstand gjennom et HEPA-filter for å fjerne partikler. Enheten er utstyrt med en klar kuppel-formet inntak hette som kan senkes over hele than motivets ansikt, men ikke hindre hans / hennes røyking.
  2. Røyking induserer hodet bevegelse - selv om røykerne blir bedt om å flytte sin hånd og holde hodet fortsatt. Bevegelse under en enkelt tidsramme forringer punkt-spredning funksjon av skanneren. Det er, bidrar den til å dimme i bildene. Hodet bevegelse under skanning betyr også at hodet er i forskjellige posisjoner under utslipp og overføring. Dette misforholdet kan føre til artefakter når sendingen skanningen er søkt å korrigere for demping. Den Vicra head-tracking system løser begge disse problemene, og er generelt ansett for å representere state-of-the-art løsning på problemet 26.

Maksimere følsomheten til 11 C-Raclopride opptak for små endringer i dopaminnivåer

  1. Forrige simulering arbeid av vår gruppe har indikert at følsomhet for endringer i dopamin nivåer er ikke ensartet i hele varigheten til skanningen hvis tracer er admintrert via en bolusinjeksjon 27. På den annen side, fulgt en initial bolus av tracer av en langsom infusjon ser ut til å i stor grad utjevne følsomheten av PET-data til å røyke når som helst under skanningen.
  2. Røyk-induserte endringer i dopamin er små i forhold til støy i pet data selv. Svært Constrained Backprojection Reconstruction (HYPR) 8,24 er en populær metode for utjevning av fMRI data som nylig har blitt brukt til PET. Denne romlige glatting teknikken reduserer støy uten å utslette de timelige egenskapene til dataene vi er interessert i. Det vil si at nedbøyninger i gang-aktivitet kurver som representerer konkurransen av tracer med endogent dopamin. Vår forarbeidet 28 indikerer at det er et optimalt valg av HYPR filter som maksimerer forskjellen i thresholded F-maps (dvs. forskjellen i antall opptjent voxels) mellom røyking og baseline Conditioner. Det optimale filter (valgt for dataene vist) avhenger sannsynligvis av riktig tilpasning av HYPR kjernen størrelsen til den omtrentlige størrelse av aktiveringen området (se figur 2).
  3. Smoking-induserte endringer i dopamin er kort. Konvensjonelle PET analysemetoder er ikke godt egnet til fangst av forbigående nevrotransmitter hendelser 25,29. Vi har preget manglene ved ulike konvensjonelle analyser ved bruk av simuleringer og menneskelige data 30. Av disse grunner har vårt laboratorium utviklet og validert en rekke matematiske teknikker for modellering av effekten av dopamin transienter på PET data 1-7. En fersk innovasjon ved Normandin et al. 7 var å linearize vår opprinnelige ntPET modellen slik at den kunne brukes på voxel nivå. Resultatet av å gjøre det er en dopamin film som de presenteres her. Viktige aspekter av våre metoder for å anslå dopamin transienter i PET-data har blitt validert previously: i rotter gjennomgikk samtidig PET og microdialysis 4 og i mennesker utfører en finger tappe oppgave 3,4.
  4. Noen form for statistisk test er nødvendig å isolere bonafide endringer i dopamin til forskjell fra tilfeldigheter. Vi har valgt å bruke F-statistikken (aka "F-ratio") for å identifisere regioner (dvs. de voxels) av bildet som er mest sannsynlig å inneholde påviselige og målbare dopamin svar. F-statistikken brukes til å sammenligne summen av kvadratene av anfall av to nestede modeller til samme tid-aktivitetsdata. I dette tilfellet, sammenligner vi passer på en vanlig modell-fraværende en tidsvarierende dopamin sikt-med vår nylig introdusert lp-ntPET modell som inneholder en tidsavhengig begrep for dopamin svingninger. Bare de for voksler som F-forholdet overskrider en gitt statistisk terskel beholdes i den endelige dopamin filmen.

Begrensninger i tolkningen av det presenterte resultatet

<ol>
  • Prøveresultatet presenteres her er selvfølgelig ikke en fullstendig undersøkelse. En grundig studie av røyking ville innebære en baseline tilstand, en smoking tilstand, og en humbug smoking betingelse for å kontrollere for motion-indusert dopamin utgivelse - til forskjell fra bevegelsesartefakt (se ovenfor). Disse studiene er pågående i vårt laboratorium.

    Det bør bemerkes at konstruere en passende sham røyking tilstand er langt fra enkle. For røykere, kan bare handle om å bringe en utent sigarett til munnen være givende og dermed frigjøre dopamin. Dermed vil en kontroll for bevegelse, men ikke for forventning sannsynligvis være en motor rettet bevegelse av tilsvarende krefter og frekvens som tar drag på en sigarett, men ikke en bevegelse som kunne ikke på noen måte være forbundet med røyking for eksempel å trykke knapp eller manuell manipulering objekt .

  • Det er velkjent at hvis nok sammenligninger er gjort, vil det være sjanse funn som overstiger en gitt statistisk terskel gamle 31. Sammenligningene vi gjør er mellom tilpasning av den konvensjonelle modellen og tilpasning av lp-ntPET modell på alle voxels i striatum. I dag er vi ikke korrigere formelt for flere-sammenligninger (for eksempel "Bonferronikorreksjon"). I stedet har vi søkt dopamin filmen analysen til en baseline tilstand i tillegg til en smoking tilstand. Hvis vår dopamin film av røyking var rett og slett et resultat av tilfeldigheter, ville vi forvente samme tetthet av aktivering områder (antall overnasjonale terskelverdier voxels) i referansebanen som i de rykende data. Det er helt klart ikke er tilfelle (se figur 7).
  • Riktignok er reproduserbarheten av teknikken vår en viktig relatert problem. Man skulle forvente at hjernen til en røyker bør reagere på samme måte som å røyke en sigarett i dag eller i morgen eller neste uke. Vi er i dag engasjert i å vurdere test-retest reproduserbarheten av våre dopamin filmer.
  • Future

    jove_content "> Vi har utviklet en ny modell av PET tracer opptak i nærvær av en kortvarig svingning i endogen neurotransmitter nivå. Fordi modellen er lineær i parametere, kan det beregnes hurtig og enkelt på mange voksler. Endepunktet for montering slike en modell til PET data på en voxel-by-voxel basis er en "film". For studier med D2 reseptor indikator, 11 C-Raclopride, er endepunktet en dopamin film. Dopamin er nøkkelen nevrotransmitter involvert i hjernens prosessering givende stimuli som fører til avhengighet. Fordi noen stimuli (særlig sigaretter og alkohol) produserer bare milde og sannsynligvis kortvarig dopamin endringer, kan filmene har sitt største potensial for å studere misbruk av disse to stimuli. Hvis vi kan bruke vår dopamin filmer å identifisere romlige og tidsmessige mønstre av dopamin utgivelse som er tegn på avhengighet eller risiko for misbruk, da disse mønstrene kan tjene som markører for sykdom, risiko for sykdom, og- Forutsatt at mønstrene er reversible - indikatorer på (farmakologisk-eller kognitiv-) behandling effekt.

    Det er ingenting om våre filmer som begrenser dem til dopamin systemet. Alt som trengs er en PET tracer for et mål av interesse som er følsom for (dvs., lett forskyves ved) svingninger i endogen ligand for samme mål. Til dags dato har det blitt stanse fremdrift for å identifisere PET sporstoff som er pålitelig følsomme for endogene nevrotransmittere andre enn dopamin. En gjennomgang av serotonin litteratur i 2010, for eksempel, malte tankevekkende bilde av vår nåværende begrensede evne til å oppdage serotonin utgivelse med PET 32. Nylig har det vært noen oppmuntrende utviklingstrekk. Et antall publikasjoner har rapportert følsomhet for serotonin sporstoff til forhøyet endogent serotonin i ikke-humane primater 33-36 men feltet venter lignende demonstrasjoner i mennesker. Som vi har diskutert andre steder <sup> 37, følsomhet overfor endringer i endogen neurotransmitter konsentrasjon synes å være sammensatt av en optimal hastighet av forskyvning fra reseptoren kombineres med en enkel av effluks av tracer fra vev til blod. Når serotonin ligander har blitt validert og vist seg å ha slike egenskaper, så serotonin filmer vil også være mulig.

    I dag, de fleste PET studier med reseptor-sporstoff føre til generering av parametriske bilder. En parametrisk bilde er et kart over en gitt tracer kinetisk modellparameter evaluert ved hver voksel i legemet (dvs. hjernen). Anvendelse av konvensjonelle modeller som SRTM 38,39 eller en-eller to-vev kupé-modellen gir parametriske bilder av Ri, den regionale flyt parameter, eller BP, den regionale bindende potensiell verdi. Begge disse parametrene er fysiologiske konstanter som antas å representere prosesser som er i steady state. Noen ganger kan imidlertid systemet og / eller prosessen interested er ustø. Det vil si, de er forbigående. Slik tilfellet er med det kortvarige reaksjon av dopamin til røyking. Under slike omstendigheter er det ikke mulig å karakterisere dopamin forbigående med et enkelt parametrisk bilde. Det er heller ikke hensiktsmessig å modellere data med en modell som er strengt tidsinvariante i parametrene. Det er behov for en modell med en tidsvariabel betegnelse på dopamin konsentrasjonsendringer i striatum i respons til røyking. Den naturlige produksjon av en slik modell ved bruk sammen med en dopamin tracer, er en film av dopamin. Dette er en ny form for funksjonell image-utgang som sannsynligvis vil anspore og krever nye former for analyse for å maksimere sin nytte.

    Disclosures

    Alle forfatterne oppgir at de har ingenting å avsløre.

    Acknowledgements

    Forfatterne takker medlemmene av Yale PET senter kjemi team for tracer syntese, bildebehandling team for tracer injeksjon og bildeopptak og Ms Sheila Huang for ekspert flytskjema design.

    Mye av utviklingen av ntPET teknikker ble støttet av R21 AA15077 til E. Morris. K. Cosgrove er støttet av K02 DA031750.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Vicra NDI Systems, Waterloo, Canada
    HRRT Siemens
    Air Filter Movex, Inc, Northampton, PA LFK 175 With extractor and clear hood
    11C-raclopride prepared at Yale PET Center from O-Desmethyl precursor
    O-Desmethylraclopride ABX advanced biochemical compounds, Radeberg, Germany Product #1510 Precursor of 11C-raclopride
    Table 1. Materials used.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Constantinescu, C. C., Bouman, C., Morris, E. D. Nonparametric extraction of transient changes in neurotransmitter concentration from dynamic PET data. IEEE Trans. Med. Imaging. 26, 359-373 (2007).
    2. Constantinescu, C. C., et al. Estimation from PET data of transient changes in dopamine concentration induced by alcohol: support for a non-parametric signal estimation method. Phys. Med Biol. 53, 1353-1367 (2008).
    3. Morris, E. D., Constantinescu, C. C., Sullivan, J. M., Normandin, M. D., Christopher, L. A. Noninvasive visualization of human dopamine dynamics from PET images. NeuroImage. 51, 135-144 (2010).
    4. Morris, E. D., Normandin, M. D., Schiffer, W. K. Initial comparison of ntPET with microdialysis measurements of methamphetamine-induced dopamine release in rats: support for estimation of dopamine curves from PET data. Molecular imaging and biology : MIB : the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 10, 67-73 (2008).
    5. Morris, E. D., et al. ntPET: a new application of PET imaging for characterizing the kinetics of endogenous neurotransmitter release. Molecular Imaging. 4, 473-489 (2005).
    6. Normandin, M. D., Morris, E. D. Estimating neurotransmitter kinetics with ntPET: A simulation study of temporal precision and effects of biased data. NeuroImage. 39, 1162-1179 (2008).
    7. Normandin, M. D., Schiffer, W. K., Morris, E. D. A linear model for estimation of neurotransmitter response profiles from dynamic PET data. NeuroImage. 59, 2689-2699 (2012).
    8. Christian, B. T., Vandehey, N. T., Floberg, J. M., Mistretta, C. A. Dynamic PET denoising with HYPR processing. Journal of Nuclear Medicine: Official publication, Society of Nuclear Medicine. 51, 1147-1154 (2010).
    9. Ichise, M., et al. Linearized reference tissue parametric imaging methods: application to [11C]DASB positron emission tomography studies of the serotonin transporter in human brain. Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 23, 1096-1112 (2003).
    10. Benowitz, N. L. Pharmacology of nicotine: addiction, smoking-induced disease, and therapeutics. Annual review of pharmacology and toxicology. 49, 57-71 (2009).
    11. Volkow, N. D., Swanson, J. M. Variables that affect the clinical use and abuse of methylphenidate in the treatment of ADHD. The American journal of psychiatry. 160-1918 (2003).
    12. Di Chiara, G., Imperato, A. Drugs abused by humans preferentially increase synaptic dopamine concentrations in the mesolimbic system of freely moving rats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5274-5278 (1988).
    13. Barrett, S. P., Boileau, I., Okker, J., Pihl, R. O., Dagher, A. The hedonic response to cigarette smoking is proportional to dopamine release in the human striatum as measured by positron emission tomography and [11C]raclopride. Synapse. 54, 65-71 (2004).
    14. Brody, A. L., et al. Gene variants of brain dopamine pathways and smoking-induced dopamine release in the ventral caudate/nucleus accumbens. Arch. Gen. Psychiatry. 63, 808-816 (2006).
    15. Brody, A. L., et al. Smoking-induced ventral striatum dopamine release. The American journal of psychiatry. 161, 1211-1218 (2004).
    16. Montgomery, A. J., Lingford-Hughes, A. R., Egerton, A., Nutt, D. J., Grasby, P. M. The effect of nicotine on striatal dopamine release in man: A [11C]raclopride PET study. Synapse. 61, 637-645 (2007).
    17. Scott, D. J., et al. Smoking modulation of mu-opioid and dopamine D2 receptor-mediated neurotransmission in humans. Neuropsychopharmacology: official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 32, 450-457 (2007).
    18. Takahashi, H., et al. Enhanced dopamine release by nicotine in cigarette smokers: a double-blind, randomized, placebo-controlled pilot study. Int. J. Neuropsychopharmacol. 11, 413-417 (2008).
    19. Morris, E. D., Fisher, R. E., Alpert, N. M., Rauch, S. L., Fischman, A. J. In vivo imaging of neuromodulation using positron emission tomography: Optimal ligand characteristics and task length for detection of activation. Human Brain Mapping. 3, 35-55 (1995).
    20. Alpert, N. M., Badgaiyan, R. D., Livni, E., Fischman, A. J. A novel method for noninvasive detection of neuromodulatory changes in specific neurotransmitter systems. NeuroImage. 19, 1049-1060 (2003).
    21. Carson, R. E., Barker, W. C., Jeih-San, L., Johnson, C. A. Nuclear Science Symposium Conference Record. 2003 IEEE. 3285, 3281-3285 (2003).
    22. Carson, R. E., et al. Comparison of bolus and infusion methods for receptor quantitation: application to [18F]cyclofoxy and positron emission tomography. Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 24-42 (1993).
    23. Smith, S. M. Fast robust automated brain extraction. Human brain mapping. 17, 143-155 (2002).
    24. Floberg, J. M., et al. Improved kinetic analysis of dynamic PET data with optimized HYPR-LR. Medical physics. 39, 3319-3331 (2012).
    25. Martinez, D., et al. Imaging human mesolimbic dopamine transmission with positron emission tomography. Part II: amphetamine-induced dopamine release in the functional subdivisions of the striatum. Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 23, 285-300 (2003).
    26. Montgomery, A. J., et al. Correction of head movement on PET studies: comparison of methods. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 47, 1936-1944 (2006).
    27. Yoder, K. K., Wang, C., Morris, E. D. Change in binding potential as a quantitative index of neurotransmitter release is highly sensitive to relative timing and kinetics of the tracer and the endogenous ligand. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 45, 903-911 (2004).
    28. Wang, S., et al. The 9th International Symposium on Functional Neuroreceptor Mapping of the Living Brain, (2012).
    29. Ginovart, N. Imaging the dopamine system with in vivo [11C]raclopride displacement studies: understanding the true mechanism. Molecular imaging and biology : MIB : the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 7, 45-52 (2005).
    30. Sullivan, J. M., Kim, S. J., Cosgrove, K. P., Morris, E. D. The 9th International Symposium on Functional Neuroreceptor Mapping of the Living Brain., NRM12, (2012).
    31. Miller, R. G. Simultaneous Statistical Inference. 2nd, (1981).
    32. Paterson, L. M., Tyacke, R. J., Nutt, D. J., Knudsen, G. M. Measuring endogenous 5-HT release by emission tomography: promises and pitfalls. Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 30, 1682-1706 (2010).
    33. Ridler, K., et al. Characterization of in vivo pharmacological properties and sensitivity to endogenous serotonin of [11C] P943: a positron emission tomography study in Papio anubis. Synapse. 65, 1119-1127 (2011).
    34. Cosgrove, K. P., et al. Assessing the sensitivity of [(1)(1)C]p943, a novel 5-HT1B radioligand, to endogenous serotonin release. Synapse. 65, (1), 1113-1117 (2011).
    35. Finnema, S. J., et al. Fenfluramine-induced serotonin release decreases [11C]AZ10419369 binding to 5-HT1B-receptors in the primate brain. Synapse. 64, 573-577 (2010).
    36. Finnema, S. J., Varrone, A., Hwang, T. J., Halldin, C., Farde, L. Confirmation of fenfluramine effect on 5-HT(1B) receptor binding of [(11)C]AZ10419369 using an equilibrium approach. Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32, (11), 685-695 (2012).
    37. Morris, E. D., Yoder, K. K. Positron emission tomography displacement sensitivity: predicting binding potential change for positron emission tomography tracers based on their kinetic characteristics. Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27, 606-617 (2007).
    38. Gunn, R. N., Lammertsma, A. A., Hume, S. P., Cunningham, V. J. Parametric imaging of ligand-receptor binding in PET using a simplified reference region model. NeuroImage. 6, 279-287 (1997).
    39. Lammertsma, A. A., et al. Comparison of methods for analysis of clinical [11C]raclopride studies. Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 16, 42-52 (1996).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics