小説

Published 5/24/2013
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Biology

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Summary

マウスの発達研究は妊娠中に胚の到達不能によって妨げられている。妊娠の後期段階で胚の心臓の長期培養を促進するために、我々は摘出心臓が半固体、希釈マトリゲルで培養されているプロトコルを開発しました。

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Dyer, L. A., Patterson, C. A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart. J. Vis. Exp. (75), e50359, doi:10.3791/50359 (2013).

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Abstract

マウスの発達研究は妊娠中に胚の到達不能によって妨げられている。したがって、プロトコルを分離し、関心のある個々の器官培養物は、両方の発展の変化を可視化することができると新規な治療戦略の方法を提供することが不可欠である。妊娠の後期段階で胚の心臓の長期培養を促進するために、我々は摘出心臓が半固体、希釈マトリゲルで培養されているプロトコルを開発しました。この基板は、三次元構造を維持するのに十分なサポートを提供するが、継続的な縮小を可能にするのに十分に柔軟である。簡単に言うと、心臓を胚から切除され、増殖培地で1:1に希釈したマトリゲル冷の混合物中に置いた。希釈したマトリゲルが固化した後、増殖培地を培養皿に添加される。胎生16.5限り遅く摘出ハーツは4日後に解剖のために生存していた。冠状動脈神経叢の分析は、このメソッドがないことを示してい冠状血管の開発を妨害。したがって、私たちは、胚の心の長期培養のための新たな方法を提示する。

Introduction

近年、トランスジェニックマウスは、開発心臓欠陥を研究するための支配的なモデルシステムとなっています。しかしながら、このようなゼブラフィッシュなどの他のモデル生物では、マウスに比べて大きな利点を有することが証明されている。心臓の開発を容易に可視化することができます胚の光透過性、、、ゼブラフィッシュの3つの主要な利点は、胚へのアクセスを容易にするために、卵の外部敷設され、に小分子治療法を適用することの容易さは、胚の発達を調節する1。したがって、胚器官の元の子宮内成長を許容培養技術の開発は、少なくとも部分的に制限が現在のトランスジェニックマウスの発達プロセスを研究者が経験する、バイパスだろう。

ex vivoで心臓の培養系がどのように差の小分子と分析による治療を可能ニワトリ、マウス胚の両方で開発されている心臓のferent領域は2-6を伝える。全体のマウス心臓の文化のために、心が胚に胚から取り上げ(E)年齢12.5ロッキング2,3,5の有無にかかわらず培地に配置することができます。この技術を用いて、胚の心臓が正常E13.5の均等にインキュベートされており、ロッキングと共に培養し心臓は限り三日(E10.5から始まる)3として維持されている。しかし、研究では、年上の胚から心臓の正常な文化を報告しなかった。同様に、レスキュー実験培地2にグローバルに治療剤を塗布に限定されている。

心が、摘出埋め込まれており、ビブラトームを使用して区分されているスライス培養システムは、また、E12.5マウスの心とハンバーガー·ハミルトンステージ36(約E16マウスで)ひよこの心のように両方の若い心、のために利用されている2,4,6、およびそのような産後および成体マウスhと年上の心、eartsと成人の心7,8。胚の分析が一般的に150μmの厚さのセクション2,4を活用ているが、セクションの厚さは酸素欠乏8の証拠なしで偉大な500μmとすることができます。これらのスライス培養物は、ほとんどのスライスが、この期間9を通じて収縮性を維持することで、文化の中で二ヶ月限り、維持されている。隔離された心筋細胞の研究に比べて、これらのスライス培養は、その隣接セル型と心筋細胞の共培養を可能にし、ex vivoでの解析ための有用な方法を提供します。しかし、これらの文化は単に培地中の心を( 例えばビブラトームで切片のライブの心臓を埋め込 ​​む)を置くよりも精巧なセットアップが必要であり、任意の分析が明らかにセクション内で心臓の一部に限定されています。

制限は培養マウス胎児心とトランスジェニックマウスAVAの富のために、上記を考える研究のためilable、我々はウィーバーによって開発されたex vivoでの肺培養系に似たex vivoでのマウス心臓培養システムを開発しました10私たちの培養系全体マウス胎児心内改造冠循環の長期培養と可視化を可能にします。また、マトリゲルの使用は、従って、治療剤と局所治療を提供し、ビーズを心臓周辺の所定の位置に保持することができる。これらの実験は、冠動脈形成などの工程上の所与の治療効果を比較するために異なる発生時点で行うことができる。小分子はマトリゲルを通って拡散することができるので、この培養系はまた、特異的な細胞 - 細胞接触が特定の発達プロセスのために、または1つの領域から他方の傍分泌シグナル伝達があるかどうかが必要であるかどうかを決定するために互いに近くに心臓の培養解剖した領域に使用することができる必要。

この培養系比較的単純であり、スライス培養系とは異なり、基本的な培養試薬は、ほとんど研究室で容易に入手可能であるセットアップを使用する。要するに、胚心臓を摘出した半固体支持体を提供する希釈マトリゲルで培養される。このサポートは、契約に心を可能にしながら、心臓の三次元形態を維持するのに十分である。このシステムを使用して、古いマウス胚(E14.5-E16.5)から、全体の心は、最大4日間の培養で維持することができます。全体冠状動脈神経叢が維持され、スライス培養とは異なり、心臓のさまざまな地域から発生したすべてのシグナリングキューが存在したままそう。また、生細胞の蛍光色素は、ライブ心臓の可視化を可能にするマトリゲルに浸透することができ、タンパク質 - 結合ビーズ、ローカライズされたシグナリング·ソースを提供するために、心臓の近くに配置することができる。一緒に、これらの利点は、この手法をembryonの発達過程を研究するための理想的な方法を作るICのマウス心臓。

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Protocol

1。胚ハーツを切除

  1. 承認された安楽死法を用いて、所望の胎生で時限妊娠マウスを安楽死させる。全ての実験は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校で制度動物実験委員会によって承認された。
  2. 自由に解剖する前に70%エタノールで女性をスプレー。子宮角を取得し、消費税に女性の腹腔を開きます。
  3. コー​​ルド1Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)表示し、必要に応じてすすぎを含むペトリ皿に子宮角に置きます。添付された胚嚢を露出する正中線を経由して子宮角を切り開く。
  4. 胚嚢を開いてカットし、胚を取り出す。冷PBSで二ペトリ皿に胚を置きます。氷に子宮角とペトリ皿を返します。
  5. 胸壁へのアクセスを改善するために胚の首。ジェノタイピングが必要な場合は、削除し、氷上に置いたエッペンドルフチュー​​ブ内の尾を保存する。
  6. ととも​​にその背中に胚、心臓や肺を可視化するために胸壁を開いてカット。段階に応じて、胸壁は、透明であってもよい。
  7. 慎重にピンセットを用いて心臓を持ち上げ、下に血管を切った。その後、心を解放するために大血管の上にカット。必要であれば、余分な組織を除去する。
  8. 冷PBSで満たされた24ウェルディッシュの1つのウェルに心を置き、氷の上にお皿を置きます。
  9. 心はすべての胚から摘出されるまで、上記の手順を繰り返します。

2。文化セットアップ

  1. 層流フードでは、1:1の割合で風邪マトリゲル希望培地(ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で例えば 、10%ウシ胎児血清(FBS))配合しています。プレ暖かい培地ない。
  2. 氷も、氷の上で維持されている24ウェル培養皿のウェルに希釈液のピペット500〜1,000μlの上希薄マトリゲルを保つ。
  3. フードでは、慎重にピックアップし、切除を配置マトリゲル含有培養皿のウェルにおける心臓氷の上で培養皿を保ちながら。
  4. 埋め込まれた心臓の向きが重要である場合:たっぷり70%エタノールで倒立顕微鏡と周囲の空間をスプレー。フードでは、まだ氷の上ながら、マトリゲル含有培養プレートのウェル中に摘出心臓を配置。その後、顕微鏡でプレートを配置し、素早く向きを摘出心臓をマトリゲルが固化し始めると。
  5. 加湿37℃インキュベーター(5%CO 2)で培養皿を置き、マトリゲルは、約30分間固化することができます。
  6. よく心臓を含む各1ミリリットル予め温めておいた培地を追加します。
  7. ハーツは、少なくとも4日間培養中に残ることができます。 2日ごとに培地を変更することをお勧めします。

3。固定と可視化

  1. 必要であれば、生きて心を可視化する蛍光生細胞色素( 例えば SYTO-16)を追加します。写真は次のようになりますそれが埋め込まれた位置に基づいて表示される心臓の側に限定。
  2. 培養後の解析( 例えば全体のマウントイメージングまたはセクショニング)が行われる場合には、培養培地を除去し、冷4%ホルムアルデヒドで置き換える。 30分間氷上で皿を置きます。
  3. 冷たいホルムアルデヒドや氷がマトリゲルの溶解を促進した後、新鮮なホルムアルデヒド(およびマトリゲル)固定液を交換して、一晩4℃の心を修正
  4. 4°Cまで、さらなる分析にバッファ( 例えば PBSまたはトリス)とストアと心を洗う。

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Representative Results

この技術を用いて、心臓の三次元形態を維持し、継続的な収縮( 映画1)で示されるように、実行可能なままである。これらの収縮は心室に比べ心房で一貫してより顕著である。文化に続いて、ハートは固定されており、処理された特定のマーカー発現や構造を調べるために免疫組織または組織学のどちらかのために、図1(a)は固定され、24時間培養したマウス胎児の心臓の心室や大血管のベースを示しており、ために処理することができます内皮細胞を標識する免疫組織化学。これらの共焦点顕微鏡写真は、冠状血管系は子宮図1B) 維持された比較的高齢胚から摘出した心臓のように表示されますことを実証している。しかし、心臓の培養のex vivoで冠状血管は、子宮内で維持された中心部に比べて小さく見えない。両方の心の中で、目心室の電子頂点は、組織に対する抗体の良好なアクセスを可能にするために除去した。

4日間E16.5、培養生体外での摘出心のヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)分析が示している偉大な動脈の壁( 図2A)、心室と心室中隔の心筋( 図2B)を含めた総合的な形態、心はそのまま残ります。循環の不足にもかかわらず、冠状動脈口( 図2A)明らかである。ただし、両方のH&E( 図2A、2B)及びDAPI(データは示さず)で観察されたDNAの断片化は、コンパクト心筋および大血管の周りに明らかである。 ex vivoで培養された心臓がまだ鼓動されたにもかかわらず、子宮( 図2C、2D)で開発されたE18.5胚から心臓と比較して、さらに、心筋はあまり密である。したがって、長さに制限がありますのための時間やステージのどちらでこれらの心を維持することができる。

この培養技術は、蛍光培養中に心を標識するために使用することができる。この場合には、心臓血管内皮固有の蛍光色素と一緒にインキュベートされた後、48時間培養する。この例では、可視化は、心臓組織の不透明度( 図3A、3B)の向きに基づいて制限される。しかし、心室心筋を通してその後の組織のセクションでは、この蛍光分子が心室( 図3C、3D)内のサブ心外膜血管を標識するために、外側の細胞層に浸透することができていることを確認し、この蛍光色素( 図3D)、ISO-レクチンと共局在。

図1
図1。開発は、ex vivoでの条件下で正常に表示されます。 G>()文化の中で24時間後、E14.5胚からex vivoでの心は、固定内皮マーカー(緑)で標識し、クリアし、共焦点顕微鏡で撮像した。肺動脈(PA)、大動脈(青)、および心臓の基部が示されている。(B) 子宮内で開発したE15.5胚から切り出しの中心を同様に処理した。スケールバーは、100μmである。

図2
図2。形態は著しくex vivoで培養中に維持される。(A、B)の中心を4日間E16.5胚培養しエキソビボから切除した。心はヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色した後、切片であった。大動脈(青)および肺動脈(PA)のアライメントを示す(A)横断面。冠状動脈口(矢印)のいずれかが見える。心筋シュール丸め大動脈は、コントロール(C)よりも低密度であり、いくつかの核の断片化(矢印)も存在しています(B)と心室中隔(IVS)のコンパクトな心筋の全体的な形態は、通常表示されますが、心筋は、コントロール(D)よりも低密度であり、いくつかの核の断片(矢印)IVSに明らかである。 (C、D)の比較については、正面H&E18.5心臓からE染色切片を示す。(C)冠動脈口が青(矢印)に隣接して観察される。(D)中隔が十分に定義されている。スケールバーは、70μmで。

図3
3。 エクスビボ心が蛍光培養中にラベルを付けることができます図。(A、B)培養で48時間後、からex vivoでの心この蛍光は凍結切片を介して保持し、心外膜下上皮細胞で観察することができるE16.5胚は、1時間16 SYTO(緑色)と共にインキュベートし、そして蛍光をインキュベートした後、48時間遅けれとして観察することができる。(C、D)心室心筋内。 Dにおいて、心室筋内部(赤)イソレクチンと同時標識した。 ISO-レクチン共同ラベル緑SYTO 16陽性細胞(矢印)ともSYTO 16で染色されていなかった心筋内のラベル船。 AB、4倍の倍率、CDでスケールバー、120μmで。

ムービー1。 30時間、ex vivoで培養した後、E14.5胚から摘出心臓は心房と心室の間で一貫性のある収縮とペーシングを示しています。 ムービーを表示するには、ここをクリック

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Discussion

現在の培養系は、胚マウス心臓研究のための重要な利点をもたらす。この培養系でも文化の中で4日後、壊死の限られた兆しで、心筋収縮と冠動脈叢を維持します。さらに、半固体マトリックスは、培養中の場所にコーティングされたビーズを保持するためにも契約に柔軟性を可能にしながら、発展途上心臓の三次元形態を維持するのに十分なサポートを提供。このサポートにもかかわらず、この行列は、ライブ心臓の蛍光分析を可能にする、などSYTO 16などの蛍光色素に対して透過性である。

スライス培養法は毛細管現象7を介して酸素を維持するために、気液界面における多孔質膜上に、冠状静脈叢のその部分を含む、心臓部を配置。これとは対照的に、以前の心臓全体の培養方法は、機能的冠動脈vasculat前胚の年齢にロッキングと制限された研究に頼るUREは2,3,5が必要である。冠状叢が気液界面のさらなる複雑させずに形成した後、現在の技術を使用して、しかし、心臓を容易に培養することができる。

後期胚の心( 例えば E16.5)が文化の中で、長期間後壊死になることを我々の懸念にもかかわらず、限られた壊死は、培養の4日間( すなわち出生後1日目、心臓に相当)後に観察された。オリジナルのプロトコルは、胚性肺芽を使用して行うように、10は壊死が報告されないが、それ以前からも利用肺は胚を上演した。したがって、壊死が早い胚時点に研究を制限することによって回避することができる。

このex vivoで培養系は制限があります。文化の中で2日後、心外膜は、行列に広がって開始され、4日以内に、心外膜は培養皿に付着する。心外膜伸長雌ためsは視覚化に影響を与えないが、この問題は、心外膜の研究に最も重要であり得る。 (E14.5-E16.5)ここに分析し、心外膜、心臓11を包含 、発展途上叢12に信号を提供してきた長いので、ステージで、したがって、その伸長は、冠状動脈神経叢に悪影響を及ぼすとは思われない。さらに、文化の中で心は彼らの子宮の対応のように大きく成長して停止しているように見える。別の制限は、マウス胎児心臓はゼブラフィッシュ胚のような透明ではないということです。すべてのライブ可視化は、このように、心臓の外側の層に観察することができるものに限られている。しかし、ライブ内皮マーカーは十分に冠状叢の一部にラベルを付ける心を浸透し、文化の中で表示されていることができます。

これらの制限にもかかわらず、我々はこのex vivoでの培養法では多くの用途に有用であることを期待しています。トランスジェニックマウスの多種多様な線その車リュー蛍光標識された細胞型を容易にタイムラプス撮影を使用して開発のさまざまな側面を評価するために使用することができる。さらに、低分子化合物を用いた胚の心のex vivoでの治療、臨床使用における新規または既にが、達成しやすいと薬物療法がヒトに適用される方法を模倣しているかどうかを指定します。

結論として、我々はマウス胎児心臓のためのex vivo培養法を適応している。この手法は、開発中に、このような肝臓や腎臓などの他の方法でアクセスできない器官に簡単にアクセスできるようになり、これらの器官の操作、ライブの分析が可能になります。

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Disclosures

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

Acknowledgements

我々は、重要な原稿の読み取りと資金支援のためのNIH(助成金#R01HL061656)用アンドレアPortburyのに感謝したいと思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Timed-pregnant mice To be dissected at the embryonic stage of interest
PBS (1x)
DMEM Cellgro
FBS Sigma-Aldrich F2442
Growth factor-reduced Matrigel BD Bioscience 356231
Syto-16 Invitrogen S7578 Used as directed in 13
24-well culture plate Fisher Scientific 07-200-84
EQUIPMENT
Stereoscopic microscope Nikon SMZ645
Cell culture incubator Thermo 3110

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References

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