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Summary

Studi di sviluppo nel topo sono ostacolati dalla inaccessibilità dell'embrione durante la gestazione. Per promuovere la cultura a lungo termine del cuore embrionale in fase avanzata di gestazione, abbiamo sviluppato un protocollo in cui il cuore asportato è colto in un semi-solido, Matrigel diluito.

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Dyer, L. A., Patterson, C. A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart. J. Vis. Exp. (75), e50359, doi:10.3791/50359 (2013).

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Abstract

Studi di sviluppo nel topo sono ostacolati dalla inaccessibilità dell'embrione durante la gestazione. Così, protocolli di isolare e cultura singoli organi di interesse sono essenziali per fornire un metodo di entrambe visualizzando cambiamenti nello sviluppo e consentendo nuove strategie terapeutiche. Per promuovere la cultura a lungo termine del cuore embrionale in fase avanzata di gestazione, abbiamo sviluppato un protocollo in cui il cuore asportato è colto in un semi-solido, Matrigel diluito. Questo substrato fornisce supporto sufficiente per mantenere la struttura tridimensionale, ma è sufficientemente flessibile per consentire una continua contrazione. In breve, i cuori sono tagliate dal embrione e collocate in una miscela di Matrigel freddo diluito 1:1 con terreno di crescita. Dopo la Matrigel diluito solidifica, è aggiunto terreno di crescita al piatto cultura. Cuori asportati il ​​più tardi giorno embrionale 16,5 erano vitali per quattro giorni dopo la dissezione. Analisi del plesso coronarico dimostra che questo metodo noninterrompere lo sviluppo vascolare coronarico. Così, presentiamo un nuovo metodo per coltura a lungo termine di cuori embrionali.

Introduction

Negli ultimi anni, il topo transgenico è stato il sistema modello per lo studio predominante difetti cardiaci sviluppo. Tuttavia, altri organismi modello, come il pesce zebra, hanno dimostrato di avere vantaggi significativi rispetto al mouse. Tre vantaggi principali del zebrafish sono la posa esterna delle uova, per facilità di accesso alle embrioni; la trasparenza ottica degli embrioni, che permette una facile visualizzazione di sviluppo cardiaco, e la facilità di applicazione piccole trattamenti molecolari per modulare sviluppo dell'embrione 1. Pertanto, lo sviluppo di una cultura tecnica che ha permesso ex crescita in utero di un organo embrionale sarebbe bypassare, almeno in parte, le limitazioni attualmente sperimentato dai ricercatori che studiano i processi dello sviluppo in topi transgenici.

Sistemi di coltura ex vivo cardiaci sono stati sviluppati sia nella pulcino ed embrione di topo che permettono il trattamento con piccole molecole e analisi di come differenti regioni del cuore comunicano 2-6. Per tutta la cultura del cuore del mouse, cuori prelevati da embrioni fino a embrionale (E) 12,5 di età può essere posizionato in terreno di coltura con o senza dondolo 2,3,5. Usando questa tecnica, cuori embrionali sono state incubate con successo per l'equivalenza di E13.5 e cuori coltura con dondolo sono stati mantenuti fino a tre giorni (partendo E10.5) 3. Tuttavia, nessuno studio ha riportato la cultura di successo di cuori da embrioni anziani. Allo stesso modo, gli esperimenti di salvataggio è stata limitata ad applicare l'agente terapeutico globalmente al mezzo di coltura 2.

Un sistema di coltura fetta, in cui i cuori sono asportati, incorporati e sezionato con un vibratome, è stato anche utilizzato per entrambi i cuori più giovani, come E12.5 i cuori del mouse e Hamburger-Hamilton stadio 36 (circa E16 nel topo) pulcino cuori 2,4,6, e più cuori, come il post-natale e di topo adulto hearts e cuori umani adulti 7,8. Mentre le analisi embrionali sono tipicamente utilizzate sezioni spesse 150 micron 2,4, spessore della sezione può essere un grande come 500 micron senza evidenza di privazione di ossigeno 8. Queste culture fetta sono state mantenute fino a due mesi di cultura, con la maggior parte delle fette mantenendo contrattilità in tutto questo periodo 9. Rispetto agli studi in cardiomiociti isolati questi culture fetta consentono il co-coltura di cardiomiociti con i loro tipi di cellule adiacenti e forniscono un metodo utile per l'analisi ex vivo. Tuttavia, queste colture richiedono più elaborato set-up che semplicemente posizionando un cuore in mezzo di coltura (per es incorporamento cuore vivo per il sezionamento su un vibratome), e ogni analisi è ovviamente limitata alla porzione del cuore all'interno della sezione.

Date le limitazioni sopra descritte per la coltura di embrioni cuori del mouse e la ricchezza di topi transgenici available per lo studio, abbiamo sviluppato un sistema di coltura del mouse cuore ex vivo simile a un sistema di coltura polmone ex vivo sviluppato da Weaver, et 10 Il nostro sistema di cultura al. permette cultura a lungo termine e la visualizzazione della circolazione coronarica rimodellamento all'interno interi embrionali cuori del mouse. Inoltre, l'utilizzo di Matrigel permette perline per essere tenute in posizione vicina al cuore, fornendo così un trattamento localizzato con agenti terapeutici. Questi esperimenti possono essere eseguiti a differenti tempi di sviluppo per confrontare l'effetto di un dato trattamento su un processo come la formazione di arteria coronaria. Perché le piccole molecole possono diffondere attraverso Matrigel, questo sistema di coltura può essere utilizzato anche per la cultura regioni sezionati del cuore vicino all'altro per determinare se specifici contatti cellula-cellula sono necessarie per alcuni processi di sviluppo o se segnalazione paracrina da una regione all'altra è necessario.

Questo sistema di colturaè relativamente semplice e, a differenza del sistema di coltura fetta, fa uso di reagenti cultura di base e set-up che sono facilmente reperibili nella maggior parte dei laboratori. In breve, cuori embrionali escisse sono coltivate in Matrigel diluito, che fornisce un semi-solido supporto. Questo supporto è sufficiente a mantenere la morfologia tridimensionale del cuore permettendo anche la contrazione del cuore. Utilizzando questo sistema, cuori interi da anziani embrioni di topo (E14.5-E16.5) possono essere mantenute in coltura per un massimo di quattro giorni. L'intero plesso coronario è mantenuto, a differenza delle culture fetta, quindi eventuali spunti di segnalazione che si verificano da diverse regioni del cuore rimangono presenti. Inoltre, coloranti fluorescenti live-cellulari possono permeare la Matrigel per permettere la visualizzazione del cuore in diretta, e perle di proteine ​​coniugate possono essere collocati in prossimità del cuore di fornire una fonte di segnalazione localizzata. Insieme, questi vantaggi fanno di questa tecnica un metodo ideale per lo studio dei processi di sviluppo in embryonic cuore del mouse.

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Protocol

1. Ablazione del Hearts embrionali

  1. Eutanasia di un mouse timed-incinta al giorno embrionale desiderato utilizzando una tecnica di eutanasia approvato. Tutti gli esperimenti sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la University of North Carolina a Chapel Hill.
  2. Liberamente spruzzare la femmina con il 70% di etanolo prima di dissezione. Aprire cavità addominale della femmina per recuperare e accise il corno uterino.
  3. Collocare il corno uterino in una capsula di Petri contenente freddo 1x tampone fosfato salino (PBS) e sciacquare come necessario. Tagliare il corno uterino attraverso la linea mediana per esporre i sacchi embrionali allegati.
  4. Tagliare un sacco embrionale e recuperare un embrione. Posizionare l'embrione in una seconda capsula di Petri con PBS freddo. Riportare la capsula di Petri con il corno uterino di ghiaccio.
  5. Decapitare l'embrione per migliorare l'accesso alla parete toracica. Se genotipizzazione è necessario, rimuovere e salvare la coda in una provetta Eppendorf posti su ghiaccio.
  6. Con l'embrione sul dorso, tagliare aprire la parete toracica per visualizzare il cuore e polmoni. A seconda della fase, la parete toracica può essere trasparente.
  7. Sollevare delicatamente il cuore con pinze e tagliare i vasi sotto. Quindi, tagliare sopra i grandi vasi di liberare il cuore. Se necessario, rimuovere i tessuti estranei.
  8. Mettere il cuore in un pozzetto di un piatto da 24 pozzetti riempiti con PBS freddo e porre il recipiente sul ghiaccio.
  9. Ripetere i passaggi precedenti fino a quando i cuori sono stati rimossi da tutti gli embrioni.

2. Cultura Set-up

  1. In una cappa laminare, combinare Matrigel freddo e il terreno di coltura desiderato (ad esempio 10% di siero fetale bovino (FBS) in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)) in rapporto 1:1. Non pre-riscaldare il terreno di coltura.
  2. Mantenendo la Matrigel diluita in ghiaccio, pipetta 500-1000 microlitri della soluzione diluita in un pozzetto di una piastra da coltura da 24 pozzetti che è inoltre mantenuto in ghiaccio.
  3. Nel cofano, accuratamente raccogliere e posizionare il asportatocuore in un pozzetto della piastra da coltura Matrigel contenente mantenendo il piatto cultura su ghiaccio.
  4. Se l'orientamento del cuore incorporato è cruciale: Liberamente spruzzare un microscopio invertito e lo spazio circostante con il 70% di etanolo. Nella cappa, posizionare il cuore staccato in un pozzetto della piastra di coltura Matrigel contenente mentre ancora sul ghiaccio. Quindi, posizionare la lastra su un microscopio e di orientarsi velocemente il cuore asportato come Matrigel inizia a solidificare.
  5. Posizionare il piatto di coltura in un umidificata 37 ° C incubatore (5% di CO 2) e lasciare il Matrigel a solidificare per circa 30 min.
  6. Aggiungere 1 ml di terreno di coltura pre-riscaldato a ciascun pozzetto contenente un cuore.
  7. Cuori possono rimanere in coltura per almeno quattro giorni. Cambiare il terreno di coltura ogni due giorni è raccomandato.

3. Fissazione e visualizzazione

  1. Eventualmente aggiungere un colorante fluorescente live-cella (ad es Syto-16) per visualizzare il cuore vivo. Fotografia saràlimitata al lato del cuore che è visibile in base alla posizione in cui è stato incorporato.
  2. Se saranno eseguite le analisi post-coltura (ad esempio l'imaging monte tutto o sezionamento), rimuovere il terreno di coltura e sostituirlo con il freddo il 4% di formaldeide. Porre la capsula in ghiaccio per 30 min.
  3. Dopo la formaldeide fredda e ghiaccio promuovono dissoluzione del Matrigel, sostituire il fissativo (e Matrigel) con formaldeide fresco e fissare cuori notte a 4 ° C.
  4. Lavare i cuori con il tampone (ad esempio PBS o Tris) e conservare a 4 ° C fino a quando ulteriori analisi.

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Representative Results

Usando questa tecnica, il cuore mantiene la sua morfologia tridimensionale e rimane vitale, come indicato dalle continue contrazioni (Film 1). Queste contrazioni sono sempre più prominente negli atri che nei ventricoli. Seguendo cultura, cuori possono essere fissati e trattati per immunoistochimica sia o istologia per esaminare l'espressione marker specifico o strutture. Figura 1A mostra la base dei ventricoli e grandi arterie di un cuore embrionale di topo che è stato coltivato per 24 ore, fisso, e trattati per immunoistochimica per etichettare l'endotelio. Queste micrografie confocali dimostrano che il sistema vascolare coronarico appare simile ad un cuore staccato da un embrione comparabilmente invecchiato che è stato mantenuto in utero (Figura 1B). Tuttavia, i vasi coronarici nel cuore coltivate ex vivo fanno apparire più piccola nel cuore che è stata mantenuta in utero. In entrambi i cuori, thelettroniche apici dei ventricoli sono stati rimossi per permettere un migliore accesso degli anticorpi per il tessuto.

Ematossilina ed eosina (H & E) Analisi dei cuori asportati a E16.5 e colto ex vivo per 4 d dimostra che la morfologia complessiva, comprese le pareti delle grandi arterie (Figura 2A) e il ventricolari e del setto interventricolare miocardio (Figura 2B) di cuore rimane intatto. Nonostante la mancanza di circolazione, il osti coronarici sono evidenti (Figura 2A). Tuttavia, la frammentazione del DNA, osservata sia con H & E (Figure 2A, 2B) e DAPI (dati non mostrati), è evidente nel compatto miocardio e intorno ai grossi vasi. Ulteriormente, il miocardio è meno denso rispetto a un cuore da un embrione E18.5 sviluppatosi in utero (figure 2C, 2D), anche se il cuore coltivate ex vivo batteva ancora. Quindi, ci sono limitazioni alla lunghezzadi tempo per o la fase in cui è possibile mantenere questi cuori.

Questa tecnica cultura può anche essere usato per etichettare fluorescently cuori mentre in coltura. In questo caso, i cuori sono coltivate per 48 ore dopo essere stata incubata con un colorante fluorescente endoteliale-specifica. In questo caso, la visualizzazione è limitata in base all'orientamento del cuore e l'opacità del tessuto (Figure 3A, 3B). Tuttavia, le successive sezioni istologiche attraverso il miocardio ventricolare confermano che tale molecola fluorescente può penetrare gli strati cellulari esterni per etichettare navi sub-epicardici all'interno dei ventricoli (figure 3C, 3D), e questo colorante fluorescente colocalizza con iso-lectina (Figura 3D).

Figura 1
Figura 1. Sviluppo appare normale in condizioni ex vivo. (A) Dopo 24 ore di cultura, ex vivo cuore da E14.5 embrioni sono stati fissati, etichettati con un marcatore endoteliale (verde), cancellati, e ripreso con microscopia confocale. L'arteria polmonare (PA), aorta (Ao), e la base del cuore sono mostrati. (B) Cuori escisse da E15.5 embrioni che si sono sviluppate in utero sono stati trattati allo stesso modo. Barra della scala, 100 micron.

Figura 2
Figura 2. Morfologia è grossolanamente mantenuta durante la coltura ex vivo. (A, B) Hearts sono stati asportati da E16.5 embrioni e coltivate ex vivo per 4 giorni. Cuori erano poi sezionati e colorati con ematossilina ed eosina (H & E). (A) una sezione trasversale che mostra l'allineamento dell'aorta (Ao) e l'arteria polmonare (PA). Uno degli osti coronarici (punta di freccia) è visibile. Il miocardio surarrotondando l'aorta è meno denso del controllo (C), e alcuni frammentazione nucleare (freccia) è anche presente. (B) La morfologia complessiva della compatta miocardio dei ventricoli e il setto interventricolare (IVS) appare normale, ma l' miocardio è meno densa rispetto al controllo (D), e un po 'di frammentazione nucleare (freccia) è ravvisabile in SVI. (C, D) Per confronto, frontale H & sezioni colorate con EE da un cuore E18.5 sono mostrati. (C) Un ostio coronarico si osserva adiacente al Ao (punta di freccia). (D) Il setto interventricolare è ben definito. Barra della scala, 70 micron.

Figura 3
Figura 3. Ex vivo cuori possono essere fluorescente durante la coltura. (A, B) Dopo 48 ore di cultura, ex vivo cuori daE16.5 embrioni sono stati incubati con Syto 16 (verde) per 1 ora, e fluorescenza potrebbero essere osservati il più tardi 48 ore dopo l'incubazione. (C, D) La fluorescenza è stata mantenuta attraverso sezionamento congelati e potrebbe essere osservato nelle cellule epiteliali subepicardica all'interno del miocardio ventricolare. In D, la sezione all'interno del miocardio ventricolare è stato co-etichettato con iso-lectina (rosso). Le iso-lectina co-etichette verdi Syto celle 16-positive (frecce) e le etichette anche vasi all'interno del miocardio, che non sono state colorate con Syto 16. AB, ingrandimento 4x, barra di scala nel CD, 120 micron.

Movie 1. Dopo la coltura ex vivo per 30 ore, un cuore staccato da un E14.5 embrione mostra contrattilità coerente e stimolazione tra atri e ventricoli. Clicca qui per vedere film .

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Discussion

Il sistema attuale cultura pone vantaggi significativi per gli studi embrionali cuore del mouse. Questo sistema di coltura preserva contrattilità miocardica e il plesso coronario, con segnali limitati di necrosi, anche dopo quattro giorni di coltura. Inoltre, la matrice semi-solido fornisce supporto sufficiente a mantenere la morfologia tridimensionale del cuore di sviluppo pur consentendo flessibilità per contratto e anche per tenere perline rivestite in posizione durante cultura. Nonostante questo sostegno, questa matrice è permeabile coloranti fluorescenti quali Syto 16, consentendo fluorescente analisi del cuore vivo.

Metodi di coltura fetta posizionare la sezione cuore, contenente la sua porzione del plesso coronario, su una membrana porosa su una interfaccia aria-liquido per mantenere l'ossigenazione tramite azione capillare 7. Al contrario, i metodi di coltura memoria interi precedenti si basano su studi a dondolo e ristretta per età embrionali prima che un vasculat coronarica funzionaleure è necessario 2,3,5. Utilizzando la tecnica attuale, tuttavia, cuori possono facilmente essere coltivate dopo il plesso coronario ha formato senza la complessità aggiuntiva di una interfaccia aria-liquido.

Nonostante le nostre preoccupazioni che cuori fine embrionali (es. E16.5) diventerebbe necrotica dopo un lungo periodo di tempo nella cultura, solo necrosi limitata è stata osservata dopo quattro giorni di cultura (cioè l'equivalente di un giorno post-natale 1 cuore). Il protocollo originale, come eseguita utilizzando gemme polmonari embrionali, 10 ha riportato nessuna necrosi ma anche polmoni utilizzati da precedenti embrioni in scena. Così, la necrosi può essere evitato limitando studi a momenti precedenti embrionali.

Questo sistema di coltura ex vivo ha ancora dei limiti. Dopo due giorni di cultura, l'epicardio inizia diffondere alla matrice, e nel giro di quattro giorni, l'epicardio attribuisce al piatto cultura. Poiché la conseguenza epicardica does non influenza la visualizzazione, tuttavia, questo problema può essere di primaria importanza per gli studi epicardiche. Nelle fasi analizzate nel presente documento (E14.5-E16.5), l'epicardio è da tempo impegnato il cuore 11 e ha fornito segnali al plesso di sviluppo 12, quindi, la sua escrescenza non sembra avere effetti negativi sul plesso coronario. Inoltre, il cuore della cultura sembrano smettere di crescere più grande come la loro controparte in utero. Un'altra limitazione è che il cuore embrionale mouse non è trasparente come l'embrione zebrafish. Ogni visualizzazione dal vivo è limitata a ciò che può essere osservato sugli strati esterni del cuore. Tuttavia, un marker endoteliale vivo può sufficientemente permeato cuore di etichettare alcuni plesso coronarico ed è visibile in coltura.

Nonostante questi limiti, prevediamo che questo metodo di coltura ex vivo sarà utile per una serie di applicazioni. Linee la grande varietà di topi transgenici che autory tipi di cellule fluorescente potrebbero essere facilmente utilizzati per valutare diversi aspetti dello sviluppo utilizzando time-lapse imaging. Inoltre, il trattamento dei embrionale cuori ex vivo con piccoli composti molecolari, sia romanzo o già in uso clinico, sarà facile da realizzare e mima come le terapie farmacologiche sono applicate negli esseri umani.

In conclusione, abbiamo adattato un metodo di coltura ex vivo per il cuore embrionale del mouse. Questa tecnica permette un facile accesso agli organi altrimenti inaccessibili, come il fegato o reni, durante lo sviluppo e consentirà la manipolazione e l'analisi diretta di questi organi.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare Andrea Portbury per la lettura critica del manoscritto e del NIH (borsa # R01HL061656) per il supporto finanziario.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Timed-pregnant mice To be dissected at the embryonic stage of interest
PBS (1x)
DMEM Cellgro
FBS Sigma-Aldrich F2442
Growth factor-reduced Matrigel BD Bioscience 356231
Syto-16 Invitrogen S7578 Used as directed in 13
24-well culture plate Fisher Scientific 07-200-84
EQUIPMENT
Stereoscopic microscope Nikon SMZ645
Cell culture incubator Thermo 3110

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References

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