基因表达谱分析人视网膜手术标本杂志

Medicine

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Summary

我们使用了视网膜从retinectomy样本为转录组分析视网膜脱离。我们开发了一种程序,允许RNA保护手术块和实验室之间。我们的标准化的协议通过氯化铯超速离心法,以保证纯化的RNA是适合于微阵列分析中纯化RNA。

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Delyfer, M. N., Aït-Ali, N., Camara, H., Clérin, E., Korobelnik, J. F., Sahel, J. A., Léveillard, T. Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl. J. Vis. Exp. (78), e50375, doi:10.3791/50375 (2013).

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Abstract

视网膜脱离(RD)介绍视网膜色素上皮(RPE)的视网膜神经上皮层的分离。的视网膜色素上皮的光敏感的神经元,光感受器的正常功能是至关重要的。从视网膜色素上皮脱离,视网膜创建一个物理间隙充满了细胞外液。 RD启动细胞和分子的不良事件,严重影响视网膜神经上皮层和视网膜色素上皮,因为生理的离子和代谢产物的交换严重扰动。果为视野脱离自一个的快速reapposition的两种组织的查询结果恢复视力1的持续时间有关。 RD的治疗完全是手术。去除玻璃体凝胶(玻璃体切除术)之后是除去非必需的部分分离的区域,有利于视网膜脱离的视网膜周围。删除视网膜标本是无主财产 (无),因此通常被丢弃。要恢复RNA从这些手术标本,我们开发的程序允许RNA保护杂志在从手术块转移到实验室。而且,我们标准化的协议通过氯化铯超速离心纯化RNA,以确保适用于全局基因表达分析,纯化的RNA。通过RT-PCR和微阵列分析的RNA的质量进行了验证。对数据的分析示出了同时参与炎症和光感受器变性过程中RD。

Introduction

视网膜脱离(RD)治疗的主要目标是找到一种方法,以限制视细胞损伤和视网膜炎症产生的光感受器的视网膜色素上皮细胞的分离。道期间,视网膜色素上皮细胞被激活,迁移,脱分化,增殖的表面脱离的视网膜,施加收缩力,导致并发症。转录组分析的RD是一种识别靶基因表达修改后RD,因此未来的治疗性分子,可以提高最终视觉效果与手术的组合。脱氧核糖核酸(DNA),核糖核酸(RNA)是不稳定的,这是众所周知的,后者被广泛用于遗传研究的,其稳定性允许的来自古生物学样品中的超过30,000岁2尼安德特人基因组的测序。转录成信使RNA的基因组DNA中的基因是主要在基因表达的过程中,该mRNA是不稳定的,以构成信号。 RNA是非常迅速降解RNA酶酶终止信号。从生物体组织分离时,RNA是非常经常退化的表达之前在研究实验室研究。降解的RNA是不适合用于分析基因的表达。由于实验室工作人员不能参加手术,我们开发了一个过程,是很容易的,只需要外科医生恢复组织到合适的无RNA酶的解决方案。组织中的RNA中是稳定的,可以分析在该溶液中在室温下72小时后,没有任何降解的迹象。从标本中的RNA中纯化由一个标准化的方法涉及在氯化铯密度梯度超速离心分离后,被转移到实验室3。然后,RNA的质量,通过琼脂糖凝胶电泳,并通过RT-PCR评估的。 RNA纯化协议根据它们的密度是不同的DNA和RNA,并保证不被污染的RNA的DNA分子在基因表达研究中,将产生人造的信号的分离的分子的优点。此外,转移RNA(tRNA的),这是定量细胞内含量最丰富的RNA,分离到相同的物理属性从核糖体RNA(核糖体rRNA)和信使RNA(mRNA的),这两个最后一个是纯化过程中的最终产品。从制剂中的tRNA的去除是非常有用的,因为大多数的微阵列分析方案涉及使用反转录酶和RNA聚合酶而抑制tRNA的4-6。纯化的RNA的手术标本,使用标准协议的标记,杂交的微阵列芯片的结果进行了分析使用两个互补的方法,假发现率的方法,并使用了一种基于互信息与可视捷思上基于Web服务器Retinobase的7,8。

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Protocol

1。日报:过程来恢复从外科块标本

在实验室

  1. 从快递公司的进口合同。
  2. 填写10(或25)的运输形式实验室实验室的联络人(电话号码和电子邮件地址)的邮政地址。
  3. 准备10(或25)样品编号从1到10(或25)的形式。这些形式包括专用空间通知)匿名鉴定的病人,B)的手术日期和c)任何额外的言论外科医生想补充。准备10(或25)软垫信封(150 x 210毫米)。
  4. 用无RNA酶试剂25毫升(或65)6 M盐酸胍酸二乙酯(DEPC)处理过的H 2 O(GHCL)。
  5. 填写10或25号5毫升无菌聚乙烯圆底管GHCL溶液2.4毫升。
  6. 二手氩气,以填补这些管子的顶端部分,比按TI机已上的盖,以防止存储在过去几年,在手术机柜GHCL溶液氧化。
  7. 介绍,每5毫升管50毫升无菌聚丙烯锥形筒底部用螺丝帽。使用一块干净的纸巾,保持管5毫升到50毫升管,管关闭。
  8. 将50毫升管聚苯乙烯机架和机架到一个纸箱软垫信封,航运形式,样品形式。
  9. 粘贴的纸板箱的盖子里面的说明(参见:1.12-1.19)​​,以方便他们阅读。
  10. 通过邮件发送的纸箱在医院的联络人。

在医院

  1. 把纸箱从手术室手术柜。注意注意:如果过程涉及免疫系统受损的患者,纸板不应该被带到手术室。
  2. 在手术过程中,将视网膜SPECIM连接到编号为5毫升无菌聚丙烯填充GHCL的解决方案。关闭严密管。
  3. 返回管简略。
  4. 将试管的血管摇臂10分钟。
  5. 填写随附的样品编号的形式。
  6. 报告到相应编号的50毫升管的识别号码。
  7. 介绍与手术标本管5毫升到50毫升管,取代纸巾,并拧紧管。
  8. 引入管和填充样品形式把它在一个随附软垫信封。关闭它。
  9. 拿起致电快递公司。

2。 RNA纯化

在实验室

  1. 均质GHCL溶液用均化1分钟的聚丙烯与5毫升管中的试样移动的同时向上和向下的管子。
  2. 加入270微升的2M乙酸钾pH值为5.0。管放置在振动筛上,在其大力摇晃10分钟水平位置(420分钟-1)。
  3. 在5,000 rpm(6,500 XG)在20℃下离心10分钟
  4. 顺利地吸出可溶部分,而不会干扰沉淀。
  5. 转移到一个14毫升的无菌试管。
  6. 添加5.3毫升100毫米的Tris pH值8.0,N-月桂酰肌氨酸1%。
  7. 添加3.2克氯化铯(CSCL),涡旋混合管。
  8. 在一个无菌的11毫升的聚异分的离心管中,添加1.8毫升的氯化铯/乙二胺四乙酸(EDTA)。
  9. 用10毫升无菌巴斯德移液管,管的边缘上缓慢滑动,以避免干扰的密度胶垫RNA溶液转移到1.8毫升氯化铯/ EDTA。
  10. 入转子,将反应管(第二管中,如有必要,视网膜无缓冲区)。
  11. (225,000 XG)在32000转离心24小时,在20°C
  12. 用无菌巴斯德吸管取出优越的解决方案的一部分,并丢弃。
  13. 逐步移除,同时检查时刻与第二无菌巴斯德吸管DNA(粘性)时吸气,并将其丢弃。
  14. 小心不要释放RNA沉淀与第三无菌巴斯德吸管中取出剩余的溶液。
  15. 第试管底部,用手术刀火焰消毒,然后把管倒挂一个无菌的目光上的剩余部分。
  16. 扭转管和160微升GHCL微妙冲洗。
  17. 让制粒干燥10分钟。
  18. 将沉淀重悬于150微升(10mM的Tris pH值7.5 - 1mM EDTA的 - 0.1%SDS)。
  19. 将溶液转移到2毫升无菌离心管中,然后收获剩余的30微升(10毫米的Tris pH值7.5 - 1毫米EDTA - 0.1%SDS)沉淀。
  20. 加入150μl中(10mM Tris pH值7.5 - 1mM EDTA)中。
  21. 加入30μl的3M醋酸钠pH值为5.0,涡管。
  22. 加入900μl的100%乙醇(-20℃),涡管。
  23. 将融化的冰管30分钟。
  24. 岑trifuge管30分钟,以15,000 rpm于4℃。
  25. 吸微妙可溶部分,并丢弃。
  26. 加入500μl70%乙醇(RT),涡旋管。
  27. 离心管20分钟,以15,000 rpm(18,000 XG)在4℃下
  28. 重复漂洗步骤(70%乙醇)。
  29. 短暂离心,消除剩余的乙醇与P200的移液器。
  30. 让沉淀空气干燥10分钟。
  31. 悬浮颗粒在50μLDEPC处理的H 2 O
  32. 大力涡旋混合。
  33. 孵育15分钟,在45℃的水浴中。

3。 RNA通过凝胶电泳分析

  1. 倒入琼脂糖凝胶化学罩内。
  2. 在无菌1.5毫升离心管中,加入2μl的RNA进行分析和样品制备缓冲液6.4微升。
  3. 在第二个1.5毫升试管中,加入3μl的RNA标准品和样品制备缓冲液9.6微升。
  4. 加热管15分钟,在65℃下,把它们放在冰上。
  5. 无染料的RNA样品管和1微升的EB样缓冲液与染料中的RNA标准品管中加入1μl溴化乙锭(EB)的上样缓冲液。
  6. 运行的凝胶在80 - 100伏的专家在运行缓冲液的化学罩,直到其中的染料溴酚蓝到达凝胶底部的2/3的。
  7. 冲洗凝胶,用250毫升去DEPC处理2X SSC两次15分钟。
  8. 在紫外光照射下,以数字化图像。
  9. 计算上带(23S rRNA的)和低频(16S rRNA基因)之间的比率。

4。最终纯化的RNA

  1. 的RNA样品的体积调整至100μlDEPC处理过的H 2 O(如有必要)。
  2. 添加100微升酸酚(1毫升苯酚DEPC处理的H 2 O + 130微升50毫米醋酸钠,pH值5.2),涡大力饱和。“
  3. (15,000 XG),在室温下以13000rpm离心10分钟。
  4. Recoveŗ仔细和转移为一种新型无菌1.5毫升离心管中水相(上期)。
  5. 加入10μl的3M醋酸钠,pH值5.2和250μl的100%乙醇(-20℃)。
  6. 孵育管30分钟到融化的冰。
  7. 离心管30分钟,每分钟14000转(18,000 XG)在4℃下
  8. 仔细吸可溶部分,并丢弃。
  9. 添加500μl的70%乙醇(室温)下,涡管。
  10. 离心管20分钟,每分钟14000转(18,000 XG)在4℃下
  11. 重复漂洗步骤(70%乙醇)。
  12. 短暂离心,消除剩余的乙醇与P200的移液器。
  13. 让空气干燥沉淀10分钟。
  14. 到50微升DEPC处理过的H 2 O 重悬沉淀
  15. 管15分钟,在45℃下孵育
  16. 2微升RNA样品上,测量在260 nm和280nm处的吸光率(Abs)。的比例计算Abs260/Abs280。
  17. <LI>商店的RNA样品在-80°C(稳定数年)。

5。解决方案和清洁程序

  1. 2 M醋酸钾,pH值5.0:溶解19.6醋酸钾为70毫升DEPC处理的H 2 O到用1M NaOH中浸泡15分钟,然后用DEPC处理过的H 2 O冲洗5次清洁的pH计探针用醋酸调节pH值至5.0,然后调整音量至100 mL DEPC处理的H 2 O
  2. ,pH值8.0的Tris-HCl 100mM的N-月桂酰肌氨酸1%:将2克N-月桂酰肌氨酸(下罩)的0.5M Tris-碱pH值8.0〜40毫升。 DEPC处理的H 2 O调节音量至200毫升)中海集运/ EDTA:中海集运96克50毫升10毫米EDTA pH值7.5编写DEPC处理的H 2 O高压灭菌,并调整体积至100毫升,用DEPC处理过的H 2 O的检查pH值<7.5。
  3. 琼脂糖凝胶1%:将1克琼脂糖在62毫升DEPC处理的H 2 O在微波炉中煮。添加18毫升为12.3 M甲醛,20毫升5×MOPS。倒入化学罩内。
  4. 样品制备缓冲器:要准备即席。混合化学罩8微升5×MOPS,16微升12.3中号甲醛,甲酰胺和40μl内。
  5. EB样缓冲液(不含染料):要准备的即席。入20μl的80%的甘油,用DEPC处理过的H 2 O制备,加入4微升10毫克/毫升的溴化3,8 -二氨基-5 -乙基-6 -苯基菲啶溴化
  6. EB样缓冲液(染料):要准备的即席。入10μl的80%甘油中含有0.25%的红外谱图严重混叠氰DEPC-处理过的H 2 O,0.25%溴酚蓝,加入2μl10毫克/毫升的溴化3,8 -二氨基-5 -乙基-6 -苯基菲啶溴化
  7. 电泳缓冲液:60毫升5倍MOPS,增加12.3中号甲醛54毫升和186毫升DEPC处理的H 2 O
  8. 用DEPC处理过的H 2 O:0.1%体积/体积焦碳酸二乙酯2小时孵育蒸馏水中,在37℃,同时搅拌。高压灭菌消毒。
  9. 清洁清洗液中加入25毫升(RBS)均质:1升的DEPC处理的H 2 O,并浸入轴搅拌1分钟。孵育2小时,在60℃下彻底冲洗成铝DEPC处理的H 2 O将仪器放入仪器箱。包装盒。高压灭菌消毒。
  10. 清洁电泳设备:清洗装置,托盘和15井梳。孵育15分钟,在3%的过氧化氢。用100%乙醇冲洗一次。空气干燥。
  11. 清洁玻璃菜:清洁玻璃板菜RBS 2%所有的夜晚,然后在200℃灭菌前用蒸馏水冲洗

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Representative Results

作者:( 图1)的程序允许我们从外科手术的块恢复视网膜标本纯化的RNA,并分析视网膜脱离的转录。视网膜脱离的查询结果中的单核细胞趋化CCL2,MCP1基因的上调和杆感光体转导基因GNAT1短波锥视蛋白OPN1SW和homeogene CRX( 图2)的表达减少。 的CCL2的感应产生的炎症9,而同时减少,GNAT1,OPN1SW CRX是光感受器变性的结果,两个杆细胞和锥。视锥细胞的损失可能导致的损失表达的NXNL1,编码杆派生锥生存力因子7,10或其同源基因RdCVF2的,这是编码由NXNL2基因的。令人惊讶的是,NXNL2信使前在存在两个不同的版本。版本1(NM_001161625.1)是来自系统发育分析的编码序列,但过去一直没有被报告表11,而第2版“(NM_145283.2),这其中有许多EST序列已被确定是一种不正常的mRNA的,不包括所述第二该基因的外显子和第二外显子包含一个替代,含有重复的Alu序列,位于超过40 kb的3'方向( 图3a)。利用人类视网膜RNA纯化,现在我们可以报道,两个版本的NXNL2的 mRNA表达( 图3b)。

图1
图1。的图片纸箱期刊所提供的材料。

图2图2。的代表的一个子集使用Retinobase的基因的表达。对于这些雷达图中显示的基因,CCL2,GNAT1 OPN1SW,CRX,图中的右侧部分对应于从视网膜脱离的标本的RNA(RD1-18), (NR1-18),而左边部分是RNA从年龄匹配的对照用验尸视网膜准备。的雷达图8中所述的方法。

图3
图3。的两个版本的NXNL2基因在视网膜中的表达。 。示意图的NXNL2 9号染色体上的基因。NXNL2v1预测的多序列比对和系统发育分析的两个外显子。NXNL2v2缺失,第二外显子,并包括了一个可选的第2外显子位于> 40 kb的3'方向。 Ť他的箭头显示的位置所用的引物(二)RT-PCR示出了两个NXNL2v1 NXNL2v2在视网膜中的表达。右车道对应于在没有逆转录酶的反应。ACTB,细胞质肌动。所用引物:NXNL2v1:5'-GCATGAGCTGAGGAAGAGGT的-3',5'-CTCA AACGGAGAAATTCTGGA-3',NXNLv2:5'-TCTGCACCCCCACGTTTATT的-3',5'-AGGGCCTCCT TTTCCATCTA-3'。

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Discussion

从手术块组织恢复发展的过程一直视网膜脱离的转录组分析的关键。人们应该注意到,这种类型的手术眼科医生经营,很少有时间参加一个生物研究计划,当他们在紧急情况和实践。此retinectomy也随机在每个服务,让简单的​​方法来达到统计上的数字是与网络。在这样的网络中,标准化组织集合是必不可少的成功的生物分析。通过提供的材料,非常容易使用和明确的指示,可在室温下储存在手术柜,手术块,我们鼓励医生参加在我们的研究中。

此外,实现标准化的纯化的RNA,以获得最佳的这些珍贵的CL标本inical。多年的纯RNA的集合可以存储在-80°C,并作为一种新型的基因组学技术的出现,将用于进一步的研究。该协议提供了视网膜手术标本,但也可以成功地用于从啮齿动物视网膜解剖后分离RNA。如果RNA被降解,)检查氯化铯/ EDTA溶液的pH值。 b)就所有未使用的化学品解决方案。该技术的主要限制为起始原料,这应该对应于至少50,000个细胞的量。

这里使用的方法从最商业化提供隔离的总RNA试剂是纯洁的程度,有什么区别。耗尽后,RNA的任何DNA的污染,从而消除了需要用DNA酶处理,可能会造成损害的任何进一步的程序。此外,这里耗尽后,总RNA制剂的tRNA,是已知的有效抑制剂中常用的RNA聚合酶扩增杂交微阵列芯片的步骤之前。我们已经观察到从这些RNA制剂中合成的探针具有一个非常高的比活性。这里描述的方法,非常适合于微阵列杂交后制备的RNA的纯度的程度,同时也为构建cDNA文库的高品质和对RNA测序,因为我们已经观察到。实验室应无RNA酶。氯化铯/ EDTA的pH值是酸性的,以避免采用碱裂解的RNA降解。氯化铯/ EDTA的密度应仔细地核实,为了不太高,以防止沉淀的RNA。

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Disclosures

什么都没有透露。

Acknowledgments

我们感谢的萨沙赖希曼和多米尼克Santiard男爵为他们的帮助,在编辑RNA纯化协议。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Beckman Coulter Aventi J-E
Rotor Beckman Coulter JS-5.3
Ultracentrifuge Beckman Coulter LE 80K
Rotor Beckman Coulter SW41
Power supply Biorad Pac 3000
PolytronTM Kinematica PT 2100 Supplied with PT-DA 2105:2
Agarose gel electrophoresis device Biorad MiniGel Cell GT
Imaging System Biorad GelDoc-It Imager
5 ml sterile polyethylene tube Greiner 115261
Sterile polyallomer centrifuge tube Beckman Coulter 331372
Chemical reagents Sigma Molecular biology grade (RNase and DNase free products)
Cleaning Solution VWR RBS
Microarray chip Affymetrix Human U133 plus 2 array

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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