Analisi trascrittomica di campioni chirurgici retiniche umane Utilizzo ufficiale

Medicine

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Summary

Abbiamo utilizzato campioni di retina da retinectomy per un'analisi trascrittomica di distacco di retina. Abbiamo sviluppato una procedura che consente la conservazione di RNA tra i blocchi chirurgici e il laboratorio. Abbiamo standardizzato un protocollo per purificare l'RNA da cesio ultracentrifugazione cloruro di assicurare che gli RNA purificati sono adatti per l'analisi di microarray.

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Delyfer, M. N., Aït-Ali, N., Camara, H., Clérin, E., Korobelnik, J. F., Sahel, J. A., Léveillard, T. Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl. J. Vis. Exp. (78), e50375, doi:10.3791/50375 (2013).

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Abstract

Distacco di retina (RD) descrive una separazione della retina neurosensoriale dalla epitelio pigmentato retinico (RPE). La RPE è essenziale per la normale funzione dei neuroni sensibili alla luce, i fotorecettori. Distacco della retina dal RPE crea un gap fisico che è pieno di fluido extracellulare. RD avvia eventi avversi cellulari e molecolari che influenzano sia la retina neurosensoriale e la RPE in quanto lo scambio fisiologico di ioni e metaboliti è gravemente perturbato. La conseguenza per la visione è legata alla durata del distacco poiché una rapida reapposition dei due tessuti determina il ripristino della visione 1. Il trattamento della RD è esclusivamente chirurgica. Rimozione del gel vitreale (vitrectomia) è seguita dalla rimozione non parte essenziale della retina intorno alla zona distaccata per favorire il distacco di retina. Gli esemplari della retina rimosse sono res nullius (nulla) e di conseguenza normalmente scartati.Per recuperare RNA da questi campioni chirurgici, abbiamo sviluppato la procedura ufficiale che permette di RNA conservazione durante il trasferimento dal blocco chirurgico al laboratorio. Abbiamo anche un protocollo standardizzato per purificare l'RNA da cesio ultracentrifugazione cloruro di assicurare che gli RNA purificati sono adatti per l'analisi globale dell'espressione genica. La qualità del RNA è stato convalidato sia mediante RT-PCR e microarray. L'analisi dei dati mostra un coinvolgimento simultaneo di infiammazione e la degenerazione dei fotorecettori durante RD.

Introduction

Il principale obiettivo terapeutico nel distacco di retina (RD) è di trovare un modo per limitare i danni fotorecettori retinici e infiammazione risultante dalla separazione dei fotorecettori dalle cellule epiteliali pigmentate retiniche. Durante RD, vengono attivati ​​cellule RPE, migrare, dedifferentiate, e proliferano sulla superficie della retina distaccata, esercitando forze contrattili conducono a complicazioni. Analisi trascrittomica di RD è un modo per identificare i geni bersaglio con l'espressione modificata a seguito di RD e quindi futuri molecole terapeutiche che potrebbero migliorare il risultato visivo finale in combinazione con la chirurgia. E 'ben noto l'acido ribonucleico (RNA) non è stabile come è acido desossiribonucleico (DNA), quest'ultimo essendo ampiamente utilizzato per studi genetici, la sua stabilità aveva permesso il sequenziamento del genoma Neanderthal da campioni paleontologici di più di 30.000 anni 2. Trascrizione del DNA dei geni dal genoma in RNA messaggero è l'processo importante nell'espressione genica, e l'mRNA è labile per costituire un segnale. RNA sono molto rapidamente degradato dalla RNAsi enzimi che terminano il segnale. Quando i tessuti sono isolati da un organismo, gli RNA sono molto spesso degradate prima che l'espressione è studiata in un laboratorio di ricerca. RNA degradato non è adatto per l'analisi di espressione genica. Perché il personale di laboratorio non può partecipare in chirurgia, abbiamo sviluppato una procedura che è facile e richiede solo che il chirurgo di recuperare i tessuti in un'appropriata soluzione RNase-free. L'RNA dei tessuti è stabile e può essere analizzate senza segni di degradazione dopo 72 ore a temperatura ambiente in questa soluzione. Gli RNA da campioni vengono purificati mediante un metodo standardizzato che coinvolge un ultracentrifugazione su un gradiente di cloruro di cesio dopo essere stato trasferito al laboratorio 3. Poi, la qualità degli RNA sono valutati mediante elettroforesi su gel di agarosio e mediante RT-PCR. Il protocollo di purificazione dell'RNA ha l'vantaggio di separare le molecole secondo la loro densità che è diversa per DNA e RNA e assicura che l'RNA non viene contaminato da una molecole di DNA che generano segnali artefatti in studi di espressione genica. Inoltre, gli RNA di trasferimento (tRNA), che sono quantitativamente le RNA più abbondanti all'interno di una cellula, siano separate per la stessa proprietà fisico dal RNA ribosomiale (rRNA) e gli RNA messaggero (mRNA), quei due ultimo la prodotto finale del processo di depurazione. La rimozione del tRNA dalla preparazione è utile in quanto la maggior parte dei protocolli di analisi di microarray coinvolto l'uso di trascrittasi inversa e la RNA polimerasi, che sono inibiti da tRNA 4-6. L'RNA purificato da campioni chirurgici sono etichettati utilizzando il protocollo standard e ibridati un chip microarray ed i risultati vengono analizzati utilizzando due metodi complementari, il metodo tasso scoperta falsi, e utilizzando un nuovo metodo basato su informazioni reciproca e visualizzed sul server web-based Retinobase 7,8.

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Protocol

1. Giornale: procedimento di recupero degli esemplari del blocco chirurgico

Nel laboratorio

  1. Ottenere un contratto di importazione dalla società di trasporto espresso.
  2. Riempire 10 (o 25) le forme di trasporto, con l'indirizzo postale del laboratorio che indica la persona da contattare in laboratorio (numero di telefono e indirizzo email).
  3. Preparare 10 (o 25) le forme esemplari numerati da 1 a 10 (o 25). Queste forme includono spazi dedicati ad informare su: a) l'identificazione anonima del paziente, b) la data della chirurgia e c) le eventuali osservazioni aggiuntive che il chirurgo vorrebbe aggiungere. Preparare 10 (o 25) buste imbottite (150 x 210 mm).
  4. Preparata con RNase-free reagenti 25 (o 65) ml di 6 M di cloruro di guanidina in dietilpirocarbonato (DEPC) trattato con H 2 O (GHCL).
  5. Riempire 10 o 25 numerati da 5 ml sterili tubi in polietilene con fondo arrotondato con 2,4 ml di soluzione GHCL.
  6. Utilizzati gas argon per riempire la parte superiore di questi tubi, che ti premereghtly sul tappo per evitare l'ossidazione della soluzione GHCL in diversi anni di stoccaggio nell'armadio chirurgica.
  7. Introdurre ogni provette da 5 ml in un ml polipropilene sterile conica tubo 50 fondo con tappo a vite. Usare un pezzo di tessuto di carta pulito per tenere il tubo 5 ml in tubo da 50 ml, chiudere il tubo.
  8. Collocare le provette da 50 ml su un rack di polistirolo e il rack in una scatola di cartone con le buste imbottite, le forme di trasporto, le forme di campioni.
  9. Incollare le istruzioni (vedi: 1,12-1,19) all'interno del coperchio della scatola di cartone per facilitare la loro lettura.
  10. Invia la scatola di cartone per posta alla persona di contatto in ospedale.

In ospedale

  1. Portare la scatola di cartone dal cabinet chirurgica in sala operatoria. Attenzione Nota: Se la procedura comporta un paziente compromesso immunitario, il cartone non deve essere portato in sala operatoria.
  2. Durante l'intervento chirurgico, collocare il SPECIM retinait in numerata 5 ml in polipropilene sterile riempito con soluzione GHCL. Chiudere ermeticamente il tubo.
  3. Tornare brevemente il tubo.
  4. Posizionare il tubo sul rocker tubo di sangue per 10 min.
  5. Compila il modulo numerato campione di accompagnamento.
  6. Riporta il numero di identificazione sul corrispondente numerato tubo da 50 ml.
  7. Introdurre il tubo 5 ml con il campione chirurgico nel tubo da 50 ml, sostituire il tessuto carta e avvitare il tubo.
  8. Introdurre il tubo e il modulo di esempio compilato in esso in una delle buste imbottite accompagnamento. Chiuderlo.
  9. Chiamare la società di trasporto espresso per il ritiro.

2. RNA Purification

Nel laboratorio

  1. Omogeneizzare il campione nella sua polipropilene tubo 5 ml con soluzione GHCL con un omogeneizzatore per 1 min, mentre spostando il tubo su e giù.
  2. Aggiungere 270 ml di 2 M potassio acetato pH 5.0. Agitare vigorosamente per 10 minuti ponendo la provetta in un agitatore a suaposizione orizzontale (420 min -1).
  3. Centrifugare 10 min a 5000 rpm (6500 xg) a 20 ° C.
  4. Aspirare senza problemi la frazione solubile senza disturbare il pellet.
  5. Trasferire in una provetta sterile 14.
  6. Aggiungere 5,3 ml di 100 mM Tris pH 8,0, N-Lauroylsarcosine 1%.
  7. Aggiungere 3,2 g di cloruro di cesio (CsCl) e mescolare il tubo nel vortex.
  8. Aggiungere 1,8 ml di acido CsCl / etilendiamminotetraacetico (EDTA) in una sterile 11 ml polyallomer provetta da centrifuga.
  9. Con una pipetta Pasteur sterile ml 10, trasferire la soluzione di RNA su 1,8 ml CsCl / EDTA facendo scorrere lentamente sul bordo del tubo per non disturbare il cuscino densità.
  10. Porre i tubi (un secondo tubo contenente i buffer senza retina se necessario) nel rotore.
  11. Centrifugare 24 ore a 32.000 giri al minuto (225.000 xg) a 20 ° C.
  12. Rimuovere la parte superiore della soluzione con una pipetta Pasteur sterile, e buttarlo.
  13. Rimuovere gradualmente durante il controllo dellamomento in cui il DNA (viscoso) viene aspirato con una seconda pipetta Pasteur sterile, e buttarlo.
  14. Rimuovere la soluzione rimanente facendo attenzione a non rilasciare il pellet di RNA con una terza pipetta Pasteur sterile.
  15. La sezione inferiore del tubo con un bisturi fiamma sterilizzato, poi mettere la parte rimanente del tubo capovolto su un sguardo sterile.
  16. Invertire la provetta e lavare delicatamente con 160 ml di GHCL.
  17. Lasciate che il pellet asciutto per 10 min.
  18. Risospendere il pellet in 150 ml di (10 mM Tris pH 7,5-1 mM EDTA - 0,1% SDS).
  19. Trasferire la soluzione in una provetta sterile ml 2, poi raccogliere il pellet residuo con 30 ml di (10 mM Tris pH 7,5-1 mM EDTA - 0,1% SDS).
  20. Aggiungere 150 ml di (10 mM Tris pH 7,5-1 mM EDTA).
  21. Aggiungere 30 ml di sodio acetato 3 M pH 5.0, vortex la provetta.
  22. Aggiungere 900 ml di etanolo al 100% (-20 ° C), il tubo vortex.
  23. Posizionare il tubo di 30 min in ghiaccio fondente.
  24. Centrifuge il tubo 30 min a 15.000 rpm a 4 ° C.
  25. Aspirare delicatamente la frazione solubile, e buttarlo.
  26. Aggiungere 500 ml di etanolo al 70% (RT), vortex la provetta.
  27. Centrifugare la provetta 20 min a 15.000 rpm (18.000 xg) a 4 ° C.
  28. Ripetere la fase di risciacquo (70% di etanolo).
  29. Centrifugare brevemente ed eliminare l'etanolo residuo con una pipetta P200.
  30. Lasciare il pellet aria secca per 10 min.
  31. Risospendere il pellet in 50 microlitri DEPC trattati con H 2 O.
  32. Mescolare vigorosamente nel vortex.
  33. Incubare 15 min a 45 ° C in un bagno d'acqua.

3. RNA Analisi per elettroforesi su gel

  1. Versare un gel di agarosio all'interno di una cappa chimica.
  2. In una sterile 1,5 ml provetta, aggiungere 2 ml di RNA da analizzare e 6,4 ml di tampone campione prep.
  3. In un secondo tubo 1,5 ml, aggiungere 3 ml di RNA standard e 9,6 ml di tampone campione prep.
  4. Riscaldare il tubo 15 min a 65 ° C, Metterli su ghiaccio.
  5. Aggiungere 1 ml di bromuro di etidio (EB) loading buffer senza colorante nel tubo campione di RNA e 1 ml EB loading buffer con colorante nel tubo standard di RNA.
  6. Eseguire il gel sotto 80 - 100 V all'interno di una cappa chimica in tampone di corsa, fino a quando uno dei coloranti (blu di bromofenolo) raggiunge 2/3 del fondo del gel.
  7. Sciacquare il gel due volte 15 min con 250 ml di DEPC trattati 2x SSC.
  8. Prendete una immagine digitalizzata sotto illuminazione UV.
  9. Calcolare il rapporto tra la banda superiore (23S rRNA) e la banda inferiore (16S rRNA).

4. La purificazione finale del RNA

  1. Regolare il volume del campione di RNA di 100 microlitri con DEPC trattati con H 2 O (se necessario).
  2. Aggiungere 100 ml di acido fenolo (1 ml di fenolo saturato in DEPC trattati con H 2 O + 130 pl di 50 mM di acetato di sodio, pH 5,2), vortice vigorosamente.
  3. Centrifugare la 10 min a 13.000 rpm (15.000 xg) a temperatura ambiente.
  4. Recover attenzione e Trasferire la fase acquosa (fase superiore) in un romanzo una sterile 1,5 ml provetta.
  5. Aggiungere 10 ml di acetato di sodio 3 M, pH 5,2 e 250 ml di etanolo al 100% (-20 ° C).
  6. Incubare la provetta 30 min in ghiaccio fondente.
  7. Centrifugare la provetta 30 min a 14.000 rpm (18.000 xg) a 4 ° C.
  8. Aspirare accuratamente la frazione solubile, e buttarlo.
  9. Aggiungere 500 ml di etanolo al 70% (temperatura ambiente), e il tubo vortex.
  10. Centrifugare la provetta 20 min a 14.000 rpm (18.000 xg) a 4 ° C.
  11. Ripetere la fase di risciacquo (70% di etanolo).
  12. Centrifugare brevemente ed eliminare l'etanolo residuo con una pipetta P200.
  13. Lasciare asciugare il pellet per 10 min.
  14. Risospendere il pellet in 50 ml di DEPC trattati con H 2 O.
  15. Incubare quindi tubo 15 min a 45 ° C.
  16. Misurare l'assorbanza (Abs) a 260 nm e 280 nm in 2 ml di campione di RNA. Calcolato il rapporto Abs260/Abs280.
  17. <li> Conservare il campione di RNA a -80 ° C (stabile per diversi anni).

5. Soluzioni e procedure di pulizia

  1. Potassio acetato 2 M, pH 5.0: Sciogliere 19.6 g di acetato di potassio in 70 ml di DEPC trattati H 2 O. Pulire la sonda pH-metro da ammollo in con NaOH 1M per 15 minuti, seguita da 5 risciacqui con DEPC trattati con H 2 O. Regolare il pH a 5,0 con acido acetico quindi regolare il volume a 100 ml con DEPC trattati H 2 O.
  2. Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, N-Lauroylsarcosine 1%: Sciogliere 2 g di N-Lauroylsarcosine (sotto una cappa) in 40 ml di 0,5 M Tris-base pH 8,0. Regolare il volume a 200 ml con DEPC trattati H 2 O.) CsCl / EDTA: 96 g di CsCl in 50 ml di 10 mM EDTA pH 7,5 preparato con DEPC trattati H 2 O. Autoclave e regolare il volume a 100 ml con DEPC trattati con H 2 O. Verificare la presenza di pH <7,5.
  3. Gel di agarosio 1%: Mettere 1 g di agarosio in 62 ml DEPC trattati H 2 O. Fate bollire in un forno a microonde. Aggiungere 18 ml di 12,3 Mformaldeide, 20 ml di MOPS 5x. Versare all'interno di una cappa chimica.
  4. Esempio di preparazione del buffer: Per essere estemporanea preparata. Mescolare in una cappa chimica 8 pl di MOPS 5x, 16 ml di 12,3 M formaldeide e 40 ml di formammide.
  5. EB caricamento del buffer (senza colorante): Per essere estemporanea preparata. Aggiungere 4 microlitri 10 mg / ml di bromuro di etidio in 20 ml di glicerolo 80% preparato con DEPC trattati con H 2 O.
  6. EB caricamento del buffer (con colorante): Per essere estemporanea preparata. Aggiungere 2 microlitri 10 mg / ml di bromuro di etidio in 10 ml di 80% glicerolo contenente 0,25% xilema cyanol, 0.25% blu di bromofenolo con DEPC trattati H 2 O.
  7. Il tampone di corsa: a 60 ml MOPS 5x, aggiungere 54 ml di 12,3 M formaldeide e 186 ml di DEPC trattati con H 2 O.
  8. DEPC trattati H 2 O: acqua distillata Incubare con 0,1% v / v dietilpirocarbonato per 2 ore a 37 ° C con agitazione. Sterilizzare in autoclave.
  9. Pulizia del omogeneizzatore: Aggiungere 25 ml di soluzione di pulizia (RBS) a 1 L di DEPCtrattata H 2 O, e immergere l'asse 1 min con agitazione. Incubare 2 ore a 60 ° C. Sciacquare abbondantemente con DEPC trattati con H 2 O avvolgere lo strumento in alluminio e mettere nella scatola strumento. Avvolgere la scatola. Sterilizzare in autoclave.
  10. Pulizia del dispositivo per elettroforesi: Lavare l'apparato, il vassoio e il pettine da 15 pozzetti. Incubare 15 min a 3% di acqua ossigenata. Risciacquare una volta con il 100% di etanolo. Aria secca.
  11. Pulizia dei piatti di vetro: pulire i piatti di vetro RBS 2% per tutta la notte, poi sciacquare con acqua distillata prima di sterilizzazione a 200 ° C.

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Representative Results

La procedura ufficiale (figura 1) permette a recuperare esemplari di retina dal blocco chirurgico di RNA purificato, e di analizzare il trascrittoma di distacco di retina. Risultati distacco di retina in up-regulation del chemiotattica dei monociti MCP1 gene CCL2, e nella diminuzione della espressione del fotorecettore asta di trasduzione genica GNAT1, l'onda corta cono opsina OPN1SW, e la homeogene CRX (Figura 2). L'induzione di CCL2 è derivato da un'infiammazione 9, mentre la concomitante riduzione dei GNAT1, OPN1SW e CRX è il risultato di una degenerazione dei fotorecettori, entrambi i coni ei bastoncelli. La perdita di coni può derivare dalla perdita di espressione di NXNL1, che codifica per una barra derivato Cone Viability Factor 7,10, o la sua RdCVF2 paralogo, che è codificata dal gene NXNL2. Sorprendentemente, il NXNL2 messaggero exnalisti in due versioni differenti. Versione 1 (NM_001161625.1) è una sequenza di codifica derivata da analisi filogenetica, ma non è stato precedentemente riportato da esprimere 11, mentre la versione 2 (NM_145283.2), per i quali è stato identificato diversi EST è un mRNA anomalo che esclude il secondo esone del gene e contiene un secondo esone alternativa, contenente una sequenza ripetitiva Alu, situati a più di 40 kb nella direzione 3 '(Figura 3a). Utilizzando RNA purificati da retina umana, possiamo ora riportato che le due versioni del mRNA NXNL2 sono espressi (Figura 3b).

Figura 1
Figura 1. Immagine della scatola di cartone contenente il materiale fornito da ufficiale.

Figura 2
Figura 2. Rappresentazione della espressione di un sottogruppo di geni usando Retinobase. Per i geni sono in questi grafici radar, CCL2, GNAT1, OPN1SW e CRX, la parte destra della figura corrisponde a RNA da campioni di distacco di retina (RD1-18), mentre la parte sinistra (NR1-18) sono RNA controlli da pari età preparati con retine post mortem. Il metodo grafico radar è descritto in 8.

Figura 3
Figura 3. Espressione della versione due del gene NXNL2 nella retina. una rappresentazione. schematica del gene NXNL2 sul cromosoma 9. NXNL2v1 ha due esoni che si prevede di allineamento multipla e analisi filogenetiche. NXNL2v2 manca che secondo esone e comprende una alternativa esone 2 ', che si trova> 40 kb in 3'. Tegli frecce mostrano la posizione del primer utilizzato. b. RT-PCR che mostra l'espressione sia NXNL2v1 e NXNL2v2 nella retina. Corsie di destra corrispondono alla reazione in assenza di trascrittasi inversa. ACTB, actina citoplasmatica. Primer utilizzati: NXNL2v1: 5'-GCATGAGCTGAGGAAGAGGT-3 ', 5'-CTCA AACGGAGAAATTCTGGA-3', 5'-NXNLv2: TCTGCACCCCCACGTTTATT-3 ', 5'-AGGGCCTCCT TTTCCATCTA-3'.

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Discussion

Lo sviluppo di una procedura di recupero tessuto dal blocco chirurgico è stato essenziale per l'analisi del trascrittoma di distacco di retina. Si dovrebbe notare che questo tipo di intervento viene praticato in emergenza e che il oculisti operativo hanno poco tempo per partecipare a un programma di ricerca biologica in cui esse operano. Questo retinectomy viene anche eseguito stocasticamente in ogni servizio, in modo che il modo più facile raggiungere numeri statistici è di lavorare con una rete. In tale rete, la standardizzazione della collezione tessuti è essenziale il successo della analisi biologiche. Fornendo un materiale, molto facile da usare e istruzioni precise, che possono essere conservati a temperatura ambiente in un armadio chirurgia, vicino al blocco chirurgico, abbiamo incoraggiato i chirurghi a partecipare al nostro studio.

Inoltre, la standardizzazione della purificazione del RNA è stato realizzato per ottenere il meglio di questi preziosi clcampioni inical. Le collezioni di RNA puri possono essere conservati per anni a -80 ° C e sarebbero stati utilizzati per ulteriori studi in quanto nuovi tecnologie genomiche emergono. Il protocollo è fornito per campione chirurgico retinica ma può anche essere utilizzato con successo per isolare l'RNA da roditore retina dopo la dissezione. Se l'RNA sono degradati, a) controllare il pH della soluzione di CsCl / EDTA. b) effettuare tutte le soluzioni di prodotti chimici utilizzati. La limitazione principale di questa tecnica è la quantità di materiale che deve corrispondere ad almeno 50.000 cellule di partenza.

Ciò che distingue il metodo qui utilizzato dalla maggior reagenti commerciali forniti per isolare l'RNA totale è il grado di purezza. RNA è impoverito di qualsiasi contaminazione del DNA, che elimina la necessità di usare un trattamento DNAsi che può essere dannoso per qualsiasi ulteriore procedura. Inoltre, il totale preparazioni RNA sono qui impoverito in tRNA, che sono noti per essere potenti inibitori della RNA polimerasi che vengono comunemente utilizzati nellala fase di amplificazione prima di ibridazione di chip di microarray. Abbiamo osservato che le sonde sintetizzati da queste preparazioni di RNA hanno un'elevata attività specifica. Il grado di purezza del RNA preparato seguendo il metodo descritto qui è molto adatto per l'ibridazione microarray, ma anche per la costruzione di librerie di cDNA di alta qualità e di sequenziamento per RNA come abbiamo osservato. Il laboratorio deve essere RNAse gratuito. Il pH della CsCl / EDTA deve essere acida per evitare la degradazione del RNA mediante lisi alcalina. La densità della CsCl / EDTA deve essere attentamente verificata per non essere troppo elevato e per impedire la sedimentazione di RNA.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Sacha Reichman e Dominique Santiard-Baron per il loro aiuto nel modificare il protocollo di purificazione dell'RNA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Beckman Coulter Aventi J-E
Rotor Beckman Coulter JS-5.3
Ultracentrifuge Beckman Coulter LE 80K
Rotor Beckman Coulter SW41
Power supply Biorad Pac 3000
PolytronTM Kinematica PT 2100 Supplied with PT-DA 2105:2
Agarose gel electrophoresis device Biorad MiniGel Cell GT
Imaging System Biorad GelDoc-It Imager
5 ml sterile polyethylene tube Greiner 115261
Sterile polyallomer centrifuge tube Beckman Coulter 331372
Chemical reagents Sigma Molecular biology grade (RNase and DNase free products)
Cleaning Solution VWR RBS
Microarray chip Affymetrix Human U133 plus 2 array

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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