Transcriptomic Analyse van de Mens Retina Chirurgische Specimens gebruiken Journal

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

We gebruikten het netvlies monsters uit retinectomy voor een transcriptoom analyse netvliesloslating. We ontwikkelden een procedure die RNA conservering tussen de chirurgische blokken en het laboratorium maakt. We een gestandaardiseerd protocol voor RNA zuivering door cesiumchloride ultracentrifugatie te verzekeren dat de gezuiverde RNA's zijn geschikt voor microarray analyse.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Delyfer, M. N., Aït-Ali, N., Camara, H., Clérin, E., Korobelnik, J. F., Sahel, J. A., Léveillard, T. Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl. J. Vis. Exp. (78), e50375, doi:10.3791/50375 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Netvliesloslating (RD) beschrijft een scheiding van de neurosensorische netvlies van de retinale pigment epitheel (RPE). De RPE is essentieel voor normale functie van de lichtgevoelige neuronen, fotoreceptoren. Loslating van het netvlies van het RPE leidt tot een fysieke spleet die is gevuld met de extracellulaire vloeistof. RD initieert cellulaire en moleculaire bijwerkingen die zowel de neurosensorische netvlies en de RPE sinds de fysiologische uitwisseling van ionen en metabolieten is ernstig verstoord beïnvloeden. De gevolgen voor visie van de duur van de onthechting omdat een snelle reapposition van de twee weefsels leidt tot het herstel van het gezichtsvermogen 1. De behandeling van RD is uitsluitend chirurgische. Verwijdering van glasvocht (vitrectomie) wordt gevolgd door de verwijdering niet essentiële deel van het netvlies in het vrijstaande gebied netvliesloslating begunstigen. De verwijderde retinale exemplaren zijn res nullius (niets) en dus normaal weggegooid.Om RNA te herstellen van deze chirurgische specimens, wij de procedure Journal dat RNA behoud mogelijk maakt tijdens de overdracht van de chirurgische blok naar het laboratorium ontwikkeld. Ook een gestandaardiseerd protocol voor RNA zuivering door cesiumchloride ultracentrifugatie te verzekeren dat de gezuiverde RNA's zijn geschikt voor globale genexpressie analyse. De kwaliteit van RNA werd gevalideerd door zowel RT-PCR en microarray-analyse. Analyse van de gegevens blijkt een gelijktijdige betrokkenheid van ontsteking en fotoreceptor degeneratie tijdens RD.

Introduction

Het belangrijkste therapeutische doel in netvliesloslating (RD) is een manier om fotoreceptorcel retinale schade en ontsteking als gevolg van de scheiding van de fotoreceptoren van de retinale gepigmenteerde epitheelcellen beperkt zijn. Tijdens RD, zijn RPE cellen geactiveerd, migreren, differentiëren, en vermenigvuldigen op het oppervlak van de vrijstaande netvlies, het uitoefenen van contractiele krachten die leiden tot complicaties. Transcriptomics analyse van RD is een manier om doel genen te identificeren met gewijzigde expressie na RD en dus toekomstige therapeutische moleculen die uiteindelijke visuele resultaat in combinatie met chirurgie zou kunnen verbeteren. Het is bekend ribonucleïnezuur (RNA) niet stabiel zijn desoxyribonucleïnezuur (DNA), welke laatste veel gebruikt voor genetische studies, de stabiliteit had sequentiebepaling van het genoom van Neanderthaler paleontologische monsters van meer dan 30.000 jaar 2 toegelaten. Transcriptie van DNA van de genen van het genoom in messenger RNA is debelangrijke proces genexpressie en de mRNA labiel is om een ​​signaal vormen. RNAs zeer snel afgebroken door RNAse enzymen die het signaal beëindigen. Wanneer weefsels worden geïsoleerd uit een organisme, de RNAs vaak afgebroken voordat de expressie onderzocht in een onderzoekslaboratorium. Gedegradeerde RNA is niet geschikt voor analyse genexpressie. Omdat het laboratorium personeel niet kan deelnemen aan de operatie, we een procedure die is gemakkelijk ontwikkeld en vereist alleen dat de chirurg naar de weefsels te herstellen in een geschikte RNAse-vrije oplossing. Het RNA van de weefsels is stabiel en kan worden geanalyseerd zonder enig teken van afbraak na 72 uur bij kamertemperatuur in deze oplossing. De RNA's van specimens worden gezuiverd door middel van een gestandaardiseerde methode waarbij een ultracentrifuge op een cesiumchloridegradiënt na te zijn overgebracht naar het laboratorium 3. Vervolgens wordt de kwaliteit van het RNA bepaald door agarose gelelektroforese en RT-PCR. Het RNA zuivering protocol heeft devoordeel van het scheiden van de moleculen op dichtheid die verschillend is voor DNA en RNA en verzekert dat de RNA niet door een DNA-moleculen die kunstmatig signalen in genexpressie studies zullen genereren verontreinigd. Bovendien worden de overdracht RNA (tRNA), die kwantitatief zijn de meest voorkomende RNA in een cel, gescheiden naar dezelfde fysieke eigenschap van het ribosomaal RNA (rRNA) en boodschapper RNAs (mRNAs) die laatste twee namelijk de eindproduct van het zuiveringsproces. De verwijdering van tRNA van het preparaat bruikbaar omdat de meeste microarray analyse protocollen bij het ​​gebruik van omgekeerde transcriptasen en RNA polymerasen die worden geremd door tRNA 4-6. Het gezuiverde RNA van chirurgische specimens worden gemerkt met een standaardprotocol en gehybridiseerd met een microarray chip en de resultaten worden geanalyseerd met twee complementaire methoden, de valse ontdekking thode en met een nieuwe methode van wederzijdse informatie en visualisatiezed op het web-based server Retinobase 7,8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Dagboek: Procedure voor de Monsters herstellen van de Surgical Block

In het laboratorium

  1. Krijgen een invoer contract van uitdrukkelijke rederij.
  2. Vul 10 (of 25) scheepvaart vormen met het postadres van het laboratorium met vermelding van de contactpersoon in het laboratorium (telefoonnummer en e-mailadres).
  3. Bereid 10 (of 25) monsters vormen genummerd 1 tot 10 (of 25). Deze vormen zijn toegewijde ruimten te informeren over a) anonieme identificatie van de patiënt, b) de datum van de operatie en c) eventuele aanvullende opmerkingen van de chirurg zou willen toevoegen. Bereid 10 (of 25) gewatteerde enveloppen (150 x 210 mm).
  4. Bereid met RNAse-vrij reagentia 25 (of 65) ml van 6 M guanidine chloride in diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld H 2 O (GHCL).
  5. Vullen 10 of 25 genummerde 5 ml steriele polyethyleen ronde bodem buizen met 2,4 ml GHCL oplossing.
  6. Gebruikt argon gas om het bovenste gedeelte van deze buizen te vullen, dan drukt u op tightly op de dop om de oxidatie van de GHCL oplossing over enkele jaren van opslag in de chirurgische kast te voorkomen.
  7. Introduceer elke 5 ml buizen in een ml steriele polypropyleen conische bodem buis 50 met schroefdop. Gebruik een stuk schoon papier weefsel om de ml buisje 5 houdt in de 50 ml buis, sluit de buis.
  8. Plaats de 50 ml buisjes op een polystyreen rek en de rek in een kartonnen doos met de gewatteerde enveloppen, de scheepvaart vormen, de monsters vormen.
  9. Plak de instructies (zie: 1,12-1,19) binnenkant van het deksel van de doos om hun lezen te vergemakkelijken.
  10. Stuur de kartonnen doos per mail aan de contactpersoon in het ziekenhuis.

In het ziekenhuis

  1. Breng de doos van de kast aan de chirurgische operatiekamer. Let op Let op: indien de procedure betrekt een immuun gecompromitteerde patiënt, het karton mag niet worden naar de operatiekamer gebracht.
  2. Tijdens de operatie, plaatst de retinale preparaten gebruikennl in genummerde 5 ml steriel polypropyleen gevuld met GHCL oplossing. Sluit stevig de buis.
  3. Terug de buis kort.
  4. Plaats de buis op het bloed buis rocker gedurende 10 minuten.
  5. Vul het bijgevoegde monster genummerde formulier.
  6. Meld het identificatienummer op de overeenkomstige genummerde 50 ml buis.
  7. Introduceer de ml buis 5 met de chirurgische specimen in de 50 ml buis, vervangt papieren tissue en schroef de buis.
  8. Introduceer de buis en de gevulde monster vorm in het in een van de begeleidende gewatteerde enveloppen. Sluit het.
  9. Bel de uitdrukkelijke rederij te halen.

2. RNA Purification

In het laboratorium

  1. Homogeniseren het specimen in zijn 5 ml tube polypropyleen met GHCL oplossing met een homogenisator voor 1 min tijdens het verplaatsen van de buis op en neer.
  2. Voeg 270 ul van 2 M kaliumacetaat pH 5,0. Schud krachtig gedurende 10 min door het plaatsen van de buis op een shaker in zijnhorizontale positie (420 min -1).
  3. Centrifugeer 10 minuten bij 5000 rpm (6.500 xg) bij 20 ° C.
  4. Aspireren vlot de oplosbare fractie zonder de pellet te verstoren.
  5. Te zetten in een 14 ml steriel buisje.
  6. Voeg 5,3 ml van 100 mM Tris pH 8,0, N-lauroylsarcosine 1%.
  7. Voeg 3,2 g cesium chloride (CsCl) en meng de buis door vortexen.
  8. Voeg 1,8 ml CsCl / ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) in een steriele 11 ml centrifugebuis polyallomer.
  9. Met ml steriele Pasteur pipet 10, dragen de RNA-oplossing op 1,8 ml CsCl / EDTA door schuiven langzaam aan de rand van de buis te voorkomen dat de dichtheid kussen verstoren.
  10. Plaats de buizen (een tweede buis die de buffers zonder retina indien nodig) in de rotor.
  11. Centrifugeer 24 uur bij 32.000 rpm (225.000 x g) bij 20 ° C.
  12. Verwijder het bovenste deel van de oplossing met een steriele Pasteur pipet, en gooi deze weg.
  13. Verwijder geleidelijk terwijl het controleren van demoment dat het DNA (viskeuze) wordt opgezogen met een tweede steriele Pasteur pipet, en gooi deze weg.
  14. Verwijder de resterende oplossing het verzorgen van de RNA-pellet niet vrij te geven met een derde steriele Pasteur pipet.
  15. Gedeelte de bodem van de buis met een scalpel vlam gesteriliseerd, vervolgens de rest van de buis het ondersteboven op een steriele blik.
  16. Keer de buis en spoel subtiel met 160 ul van GHCL.
  17. Laat het pellet 10 minuten drogen.
  18. Resuspendeer de pellet in 150 ui (10 mM Tris pH 7,5-1 mM EDTA - 0,1% SDS).
  19. Over in een 2 ml steriele microcentrifugebuis, halen er de resterende pellet met 30 ui (10 mM Tris pH 7,5-1 mM EDTA - 0,1% SDS).
  20. Voeg 150 ui (10 mM Tris pH 7,5-1 mM EDTA).
  21. Voeg 30 pl 3 M natriumacetaat pH 5,0, vortex de buis.
  22. Voeg 900 ul 100% ethanol (-20 ° C), vortex de buis.
  23. Plaats de buis 30 min in smeltend ijs.
  24. Centrifuge het buisje 30 minuten bij 15.000 rpm bij 4 ° C.
  25. Aspireren fijntjes de oplosbare fractie, en gooi deze weg.
  26. Voeg 500 ul 70% ethanol (RT), vortex de buis.
  27. Centrifugeer het buisje 20 minuten bij 15.000 rpm (18.000 x g) bij 4 ° C.
  28. Herhaal de spoelstap (70% ethanol).
  29. Centrifugeer kort elimineren van de resterende ethanol met een P200 pipet.
  30. Laat de pellet drogen aan de lucht gedurende 10 minuten.
  31. Resuspendeer de pellet in 50 pl DEPC-behandeld H2O
  32. Meng krachtig door vortexen.
  33. Incubeer 15 min bij 45 ° C in een waterbad.

3. RNA-analyse door gelelektroforese

  1. Voor een agarosegel in een chemische afzuigkap.
  2. In een steriele 1,5 ml microcentrifuge buis, voeg 2 pl RNA te analyseren en 6,4 pl monster prep buffer.
  3. In een tweede ml tube 1.5, voeg 3 ul van RNA normen en 9,6 pi van het monster prep buffer.
  4. Verwarm de buizen 15 minuten bij 65 ° C, Leg ze op ijs.
  5. Voeg 1 ui ethidiumbromide (EB) loading buffer zonder kleurstof in de RNA-monster buis en 1 pl EB ladingsbuffer met kleurstof in de RNA-normen buis.
  6. Voer de gel onder 80-100 V In een chemische kap loopbuffer, totdat een van de kleurstoffen (broomfenolblauw) heeft van 2/3 van de bodem van de gel.
  7. Spoel de gel twee keer 15 minuten met 250 ml de DEPC behandelde 2x SSC.
  8. Neem een ​​gedigitaliseerde afbeelding onder UV-belichting.
  9. Bereken de verhouding tussen de bovenste band (23S rRNA) en de onderste band (16S rRNA).

4. Definitieve Zuivering van het RNA

  1. Het volume van het RNA monster 100 ui met DEPC behandeld H 2 O (indien nodig).
  2. Voeg 100 ul van zure fenol (1 ml fenol verzadigd met DEPC behandeld H 2 O + 130 ui 50 mM natriumacetaat, pH 5,2), vortex krachtig.
  3. Centrifugeer de 10 min bij 13.000 rpm (15.000 xg) bij kamertemperatuur.
  4. Recover zorgvuldig en breng de waterfase (bovenste fase) in een roman een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis.
  5. Voeg 10 pl 3 M natriumacetaat, pH 5,2 en 250 pl 100% ethanol (-20 ° C).
  6. Incubeer het buisje 30 minuten in smeltend ijs.
  7. Centrifugeer het buisje 30 minuten bij 14.000 rpm (18.000 x g) bij 4 ° C.
  8. Verstuif zorgvuldig de oplosbare fractie, en gooi deze weg.
  9. Voeg 500 ul van 70% ethanol (kamertemperatuur), en vortex de buis.
  10. Centrifugeer het buisje 20 minuten bij 14.000 rpm (18.000 x g) bij 4 ° C.
  11. Herhaal de spoelstap (70% ethanol).
  12. Centrifugeer kort elimineren van de resterende ethanol met een P200 pipet.
  13. Laat lucht droog de pellet gedurende 10 minuten.
  14. Resuspendeer de pellet in 50 pl DEPC-behandeld H2O
  15. Incubeer dan buis 15 min bij 45 ° C.
  16. Meet de absorptie (Abs) bij 260 nm en 280 nm op 2 ui van het RNA-monster. Berekende de verhouding Abs260/Abs280.
  17. <li> Store de RNA-monster bij -80 ° C (stabiel gedurende meerdere jaren).

5. Oplossingen en Schoonmaakprocedures

  1. 2 M kaliumacetaat, pH 5,0: Los 19,6 g kaliumacetaat in 70 ml met DEPC behandeld H2O Reinig de pH-meter probe door onderdompeling deze in met 1M NaOH gedurende 15 min, gevolgd door 5 spoelingen met DEPC behandeld H2O Op pH 5,0 met azijnzuur dan het volume op 100 ml met DEPC behandeld H2O
  2. Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, N-lauroylsarcosine 1%: Los 2 g N-lauroylsarcosine (onder een kap) in 40 ml 0,5 M Tris-base pH 8,0. Stel het volume op 200 ml met DEPC behandeld H2O) CsCl / EDTA: 96 g CsCl in 50 ml 10 mM EDTA pH 7,5 bereid met DEPC behandeld H2O Autoclaaf en volume op 100 ml met DEPC behandeld H2O Controleer pH <7,5.
  3. Agarose gel 1%: Doe 1 g agarose in 62 ml DEPC-behandeld H2O Kook in een magnetron. Voeg 18 ml van 12,3 Mformaldehyde, 20 ml 5x MOPS. Giet in een chemische kap.
  4. Sample prep Buffer: Om voorbereid geïmproviseerde zijn. Meng in een chemische kap 8 pl 5x MOPS, 16 gl 12,3 M formaldehyde en 40 pl formamide.
  5. EB laadbuffer (zonder kleurstof): Om voorbereid geïmproviseerde zijn. Voeg 4 pi 10 mg / ml ethidiumbromide in 20 ui 80% glycerol bereid met DEPC behandeld H2O
  6. EB laadbuffer (met kleurstof): Om voorbereid geïmproviseerde zijn. Voeg 2 pi 10 mg / ml ethidiumbromide in 10 ui 80% glycerol bevattende 0,25% houtweefsel cyanol, 0.25% broomfenolblauw met DEPC behandeld H2O
  7. Lopende buffer: Tot 60 ml 5x MOPS, voeg 54 ml van 12,3 M formaldehyde en 186 ml DEPC behandeld H 2 O.
  8. DEPC behandeld H2O: Incubeer gedestilleerd water met 0,1% v / v diethylpyrocarbonaat gedurende 2 uur bij 37 ° C onder roeren. Steriliseren in autoclaaf.
  9. Reinigen homogenisator Voeg 25 ml reinigingsoplossing (RBS) naar 1 L met DEPCbehandeld H 2 O, en dompel de as 1 min. onder roeren. Incubeer 2 uur bij 60 ° C. Grondig met DEPC behandeld H 2 O Wikkel het instrument in aluminium en in de doos instrument. Wikkel de doos. Steriliseren in autoclaaf.
  10. Het reinigen van de elektroforese-inrichting: Was het apparaat, de lade en de 15-wells comb. Incubeer 15 min bij 3% waterstofperoxide. Eenmaal spoelen met 100% ethanol. Lucht drogen.
  11. Het reinigen van de glazen schalen: Reinig de glazen schalen RBS 2% al de nacht, dan spoelen met gedistilleerd water voordat sterilisatie bij 200 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De procedure Journal (figuur 1) biedt ons specimens van retina herstellen van de chirurgische blok gezuiverd RNA, en het transcriptoom van netvliesloslating analyseren. Netvliesloslating resulteert in de verhoogde expressie van de monocyt chemotactische MCP1 gen CCL2, en de afname in expressie van de staaf fotoreceptor transduceren gen GNAT1, korte golf kegel opsin OPN1SW en de homeogene CRX (figuur 2). De inductie van CCL2 resulteert een ontsteking 9, terwijl de overeenkomstige vermindering van GNAT1, OPN1SW en CRX is het resultaat van fotoreceptor degeneratie, zowel staafjes en kegeltjes. Het verlies van kegels kan het verlies van expressie van NXNL1, dat codeert voor een staaf-afgeleide Factor 7,10 Cone levensvatbaarheid of de paraloog RdCVF2, dat wordt gecodeerd door het gen NXNL2. Verrassend, de NXNL2 boodschapper existen in twee verschillende versies. Versie 1 (NM_001161625.1) een coderende sequentie afgeleid van fylogenetische analyse, maar niet eerder gerapporteerd tot expressie 11, terwijl versie 2 (NM_145283.2), waarbij verscheidene EST is geïdentificeerd is een abnormale mRNA dat de tweede uitsluit exon van het gen en bevat een alternatieve tweede exon, dat een herhalende sequentie Alu ligt meer dan 40 kb in de 3 'richting (figuur 3a). Gebruik RNA gezuiverd uit menselijke retina, kunnen we nu gemeld dat de twee versies van de NXNL2 mRNA expressie (figuur 3b).

Figuur 1
Figuur 1. Beeld van de kartonnen doos met de door de Journal materiaal.

Figuur 2
Figuur 2. Vertegenwoordiging van de expressie van een subset van genen met behulp Retinobase. Voor de genen weergegeven in deze radargrafieken, CCL2, GNAT1, OPN1SW, en CRX, het rechter gedeelte van de figuur komt overeen met RNA uit monsters van netvliesloslatingen (RD1-18), terwijl het linkerdeel (NR1-18) zijn RNA van leeftijd-gematchte controles bereid met behulp van post-mortem netvliezen. De radar grafiek werkwijze wordt beschreven in 8.

Figuur 3
Figuur 3. Expressie van de twee versies van de NXNL2 gen in de retina. een. Schematische weergave van de NXNL2 gen op chromosoom 9. NXNL2v1 twee exons die zijn voorspeld door meervoudige uitlijning en fylogenetische analyse. NXNL2v2 ontbreekt die tweede exon en bevat een alternatief exon 2 ', gelegen> 40 kb in de 3' richting. THij pijlen geven de positie van de primer. b. RT-PCR waarin de expressie van zowel NXNL2v1 en NXNL2v2 in de retina. De rechterbanen overeen met reactie in de afwezigheid van reverse transcriptase. ACTB, cytoplasmatische actine. Primers gebruikt: NXNL2v1: 5'-GCATGAGCTGAGGAAGAGGT-3 ', 5'-CTCA AACGGAGAAATTCTGGA-3', NXNLv2: 5'-TCTGCACCCCCACGTTTATT-3 ', 5'-AGGGCCTCCT TTTCCATCTA-3'.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De ontwikkeling van een procedure voor weefsel herstel van de chirurgische blok essentieel voor het transcriptoom van netvliesloslating geweest. Men moet opmerken dat dit type van chirurgie wordt beoefend in nood en dat de oogartsen operationele hebben weinig tijd om deel te nemen in een biologisch onderzoeksprogramma wanneer zij opereren. Dit retinectomy wordt ook stochastisch uitgevoerd in elke dienst, zodat het eenvoudiger manier om statistische cijfers te bereiken is om te werken met een netwerk. In dergelijk netwerk, de normalisatie van de weefsels collectie is essentieel voor het succes van de biologische analyse. Door een materiaal zeer makkelijk te gebruiken en precieze instructies, die bij kamertemperatuur kunnen worden bewaard in een operatie kast, dichtbij de chirurgische blok, hebben we aangespoord de chirurgen om aan onze studie.

Bovendien werd de standaardisatie van de zuivering van het RNA bereikte de beste van deze kostbare cl krijgeninical specimens. De verzamelingen van pure RNA kan jarenlang bewaard bij -80 ° C en worden gebruikt voor verdere studies nieuwe genomics technologieën ontwikkeld. Het protocol is bedoeld netvlies chirurgische specimen, maar kan ook goed worden gebruikt om RNA te isoleren van knaagdieren retina na dissectie. Als de RNA worden afgebroken, a) controle van de pH van de CsCI / EDTA-oplossing. b) maken alle oplossingen van niet-gebruikte chemicaliën. De grootste beperking van deze techniek is de hoeveelheid grondstof die moet overeenkomen met ten minste 50.000 cellen.

Onderscheidt de hier gebruikte methode van de meeste commerciële reagentia die voor het isoleren van totaal RNA is de zuiverheidsgraad. RNA is uitgeput van elke DNA verontreinigingen die de noodzaak van het gebruik DNAse behandeling die schadelijk kan zijn om verdere procedure elimineert. Daarnaast wordt het totale RNA preparaten here waaruit tRNA, waarvan bekend is dat het krachtige remmers van RNA polymerasen die algemeen worden gebruikt in zijnde amplificatiestap voor hybridisatie aan microarray chips. We hebben opgemerkt dat de probes gesynthetiseerd uit deze RNA preparaten hebben een zeer hoge specifieke activiteit. De zuiverheid van het RNA bereid volgens de hier beschreven is zeer geschikt voor microarray hybridisatie werkwijze, maar ook voor het construeren van cDNA-bibliotheken van hoge kwaliteit en RNA sequentie zoals we hebben waargenomen. Het laboratorium moet RNAse vrij. De pH van de CsCl / EDTA moet zuur tot de afbraak van het RNA te voorkomen door alkalische lysis. De dichtheid van de CsCl / EDTA moet zorgvuldig worden gecontroleerd om niet te hoog zijn en de sedimentatie van RNA voorkomen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken Sacha Reichman en Dominique Santiard-Baron voor hun hulp bij het bewerken van de RNA-zuivering protocol.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Beckman Coulter Aventi J-E
Rotor Beckman Coulter JS-5.3
Ultracentrifuge Beckman Coulter LE 80K
Rotor Beckman Coulter SW41
Power supply Biorad Pac 3000
PolytronTM Kinematica PT 2100 Supplied with PT-DA 2105:2
Agarose gel electrophoresis device Biorad MiniGel Cell GT
Imaging System Biorad GelDoc-It Imager
5 ml sterile polyethylene tube Greiner 115261
Sterile polyallomer centrifuge tube Beckman Coulter 331372
Chemical reagents Sigma Molecular biology grade (RNase and DNase free products)
Cleaning Solution VWR RBS
Microarray chip Affymetrix Human U133 plus 2 array

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mitry, D., Charteris, D. G., et al. The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations. The British Journal of Ophthalmology. 94, (6), 678 (2010).
  2. Green, R. E., Krause, J., et al. A draft sequence of the Neandertal genome. Science. 328, (5979), 710 (2010).
  3. Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation. Biochemistry. 13, (12), 2633 (1974).
  4. Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, (5), 1663 (1990).
  5. Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro. Nucleic Acids Research. 2, (12), 2315 (1975).
  6. Sawadogo, M. On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin. Biochemical and biophysical research communications. 98, (1), 261 (1981).
  7. Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death. PloS ONE. 6, (12), e28791 (2011).
  8. Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina. BMC Genomics. 9, 208 (2008).
  9. Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (7), 2425 (2007).
  10. Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Science Translational Medicine. 2, (26), 26ps16 (2010).
  11. Chalmel, F., Leveillard, T., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics