La transmission orale de

Immunology and Infection

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Summary

Cet article décrit une nouvelle méthode pour infection orale de souris à l'aide

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Bou Ghanem, E. N., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D'Orazio, S. E. Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food. J. Vis. Exp. (75), e50381, doi:10.3791/50381 (2013).

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Abstract

L. monocytogenes sont facultatives bactéries pathogènes intracellulaires qui causent des infections d'origine alimentaire chez les humains. Très peu est connu au sujet de la phase digestive de listériose en raison de l'absence d'un petit modèle animal qui reproduit fidèlement la maladie humaine. Ce document décrit un nouveau modèle de souris pour la transmission orale de L. monocytogenes. En utilisant ce modèle, les souris nourries L. monocytogenes-pain contaminés ont une phase discrète de l'infection gastro-intestinale, suivie de degrés de dissémination systémique varier dans des souches de souris sensibles (BALB / c / par / J) ou résistants (C57BL / 6). Pendant les derniers stades de l'infection, on observe la diffusion de la vésicule biliaire et le cerveau. Le modèle d'origine alimentaire de la listériose est hautement reproductible, ne nécessite pas de compétences spécialisées, et peut être utilisé avec une grande variété de souches bactériennes et des souches de souris de laboratoire. En tant que tel, il est le modèle idéal pour étudier les stratégies de virulence utilisés par L. monocytogenes

Introduction

Listeria monocytogenes sont facultatives bactéries pathogènes intracellulaires qui causent des infections d'origine alimentaire chez les humains. Les bactéries sont résistantes à la plupart des processus utilisés pour protéger notre approvisionnement alimentaire, comme le séchage, le salage, ou 1,2 de réfrigération et les infections sont généralement liés aux traités », prêt-à-manger" des aliments qui ne sont pas chauffés avant la consommation . Dans plusieurs épidémies précédentes, la source de L. nourriture monocytogenes contaminé a été identifié, et le groupe restreint d'individus exposés a été étroitement surveillé 3-6. Dans ces exemples, la maladie clinique chez les individus en bonne santé varie d'une légère gastro-entérite spontanément à des infections intestinales et systémiques plus graves ayant nécessité une hospitalisation. L. infections monocytogenes chez les individus immunodéprimés, y compris les nouveau-nés et les personnes âgées, ont été associés à un taux de mortalité élevé (25-30%), même avec un traitement antibiotique L. monocytogenes, ou les facteurs de l'hôte qui régissent la susceptibilité à l'infection après la transmission orale, principalement en raison de l'absence d'un petit modèle animal qui récapitule ce large éventail de résultats d'infection.

Le modèle le plus largement utilisé de la listériose soit par voie intraveineuse inoculation (iv) de souris. Le modèle IV est hautement reproductible, et a été extrêmement utile pour étudier les réponses des cellules T naïves à la fois et de la mémoire au cours de l'infection par 9,10. L'inconvénient du modèle IV est qu'il contourne complètement la phase intestinale de l'infection. Après la transmission d'origine alimentaire, la muqueuse intestinale constitue une barrière qui ralentit et limite le nombre de bactéries qui peuvent continuellement diffuser vers les tissus périphériques sans doute. En revanche, l'ensemble de l'inoculum peut être trouvé dans la rate et du foie dans les minutes suivant l'administration iv, et ce grand bol d'organismes peut submerger d immunitaire innéefenses dans ces tissus. L'infection orale par gavage des souris est utilisé moins souvent, parce que de fortes doses (10 9 -10 11 CFU) sont généralement nécessaires pour atteindre la colonisation intestinale 10. En outre, intragastrique (ig) inoculation avec une aiguille d'alimentation ne génère pas une période reproductible d'une infection gastro-intestinale avant dissémination systémique. Certains laboratoires ont rapporté que L. monocytogenes atteindre la rate et le foie dans les 4-12 heures après l'infection (HPI), tandis que d'autres n'ont pas montré de propagation systémique jusqu'à 48 HPI 11-15. Cette variation du laboratoire au laboratoire peut être une conséquence de la nature invasive de ig inoculation, ce qui peut entraîner un traumatisme mineur à la muqueuse de l'œsophage, et de promouvoir invasion sanguine directe de la bactérie.

Nous avons récemment développé un nouveau modèle de souris de oral L. infection monocytogenes qui imite de près toutes les phases de la maladie humaine 16. L'infection survient lorsque les souris ingèrent des morceaux de contaminé alimentaire, un processus qui est non-traumatique, et ne nécessite pas de compétences spécialisées par des chercheurs de laboratoire. Pendant une période de temps discrète (36-48 h), L. monocytogenes reproductible colonisent seulement le tractus gastro-intestinal, permettant ainsi enquête sur les mécanismes utilisés par les pathogènes Listeria de translocation à travers la muqueuse de l'intestin et de diffuser dans les tissus périphériques. Surtout, le modèle peut être utilisé pour étudier les différences dans la résistance innée de l'hôte à l'infection. Dans une étude précédente, nous avons montré que des souris BALB / c / par / J ont été très sensibles à la listériose d'origine alimentaire, avec la réplication exponentielle de L. monocytogenes qui se produisent dans l'intestin, la rate, le foie et la vésicule biliaire 16. En revanche, les souris C57BL / 6 étaient résistants à l'infection d'origine alimentaire, avec seulement colonisation transitoire de L. monocytogenes se produisant dans chacun de ces tissus. Une autre caractéristique du modèle d'origine alimentaire qui imite de près la maladie humaine, c'est que la diffusion naturelleau cerveau survenue pendant les derniers stades de l'infection (5-7 dpi).

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Protocol

1. Préparation de la gélose sélective des médias (BHI / L + G) pour inhiber microbiote intestinal

  1. Peser 26 g de cerveau-coeur Infusion Agar (Difco), 7,5 g de LiCl et 5,0 g de glycine et le placer dans un ballon de 1 litre. Ajouter 500 ml d'eau désionisée.
  2. Chauffer sur un agitateur magnétique jusqu'à ébullition d'agar, en remuant continuellement. Prenez le ballon hors du feu, laissez les bulles s'installer brièvement, puis ramener à ébullition.
  3. . Autoclave pendant 30 min à 121 ° C sous 16-19 psi sur un cycle liquide REMARQUE: Laisser le barreau d'agitation dans le ballon.
  4. Amener les médias à 55 ° C dans un bain d'eau ou laisser refroidir à température ambiante. Ne pas laisser la solution se refroidir à 55 ° C ou cristaux se formeront dans l'agar. Les cristaux ne freinent L. monocytogenes et n'affecte pas les propriétés sélectives des médias. Toutefois, les cristaux seront semblables en apparence à de petites colonies et il sera difficile de compter CFU bactérienne.
  5. Mélanger délicatement leagar pendant 1 min à l'aide d'un agitateur magnétique. Éviter la formation de bulles d'air. Verser l'agar-agar dans des boîtes de Pétri (~ 25 ml / plaque).
    Note: Ce média ne supporte pas la croissance de tous L. souches monocytogenes. Par exemple, L. monocytogenes EGDe pousse bien sur cette gélose, avec des colonies visibles dans les 36-48 heures, mais 10403s ne pousse pas sur ce support.

2. Préparation de l'inoculum

  1. Couper le pain blanc tranché (Kroger) en petits (2-3 mm) cubes avec des ciseaux ora lame de bistouri stérile stérile. Ne pas utiliser les croûtes. Stocker des pièces individuelles dans des microtubes à -20 ° C jusqu'à ce que le jour de l'infection.
  2. L'utilisation d'un scalpel stérile, couper des petits (0,5-1 cm) de morceaux de beurre salé (Kroger) et placer chacun dans un tube à centrifuger stérile. Chaque tube contient assez de beurre pour préparer 50 - 60 morceaux de pain. Conserver à -20 ° C jusqu'au moment de servir.
  3. Cultivez L. monocytogenes dans du bouillon BHI agitation à 30 ° C jusqu'à ce que la culture atteigne une DO 600 de ~ 0.8-1.0. Préparez 500 aliquotes dans des tubes à centrifuger, en prenant soin de vortex de l'échantillon fréquemment de sorte que tous les tubes contiennent le même nombre de bactéries. Conserver à -80 ° C.
  4. Pour titrer les portions bactériennes, décongeler un tube sur la glace, puis ajouter 500 ul de 9,5 ml de bouillon BHI. Incuber pendant 1,5 heures debout à 30 ° C. Plate dilutions en série sur gélose BHI. Attendez-vous à un titre de ~ 1-5 x 10 8 UFC / ml. Remarque: Si portions homogènes sont préparés, peuvent s'attendre à chacun des tubes pour conduire ce titre quand il est préparé d'une manière similaire avec un écart de 2 à 4 fois.
  5. Pour infecter des souris, préparer une aliquote de L. monocytogenes comme décrit dans l'étape 2.4. Environ 20 min avant le L. culture monocytogenes est prêt, décongeler les morceaux de pain à température ambiante. Faire fondre une aliquote de beurre à 55 ° C et préchauffer un petit volume de PBS à 55 ° C. Préparer morceaux assez pain pour qu'il y ait au moins un par sourisd'être infectées et au moins une pièce supplémentaire permettant de déterminer le titre de l'inoculum réelle.
  6. Sur la base du titre prédéterminé de l'aliquote bactérienne, calculer le volume total de L. culture monocytogenes nécessaire pour préparer l'inoculum pour le nombre requis de morceaux de pain. Pellet les bactéries par centrifugation à 14000 g pendant 10 min Aspirer tous bouillon BHI et remettre en suspension les bactéries dans un petit volume de PBS préchauffé (2 pi / pain pièce).
  7. Vortex le beurre fondu, ajouter des bactéries (en utilisant un volume total égal à 3 pl / pain pièce) et bien mélanger. Remarque: Ne pas tenter de préparer plus de 10-15 morceaux de pain à un moment ou le beurre va se solidifier.
  8. En travaillant rapidement, 5 ul de la suspension bactérienne sur un seul morceau de pain dans un tube de centrifugation. La solution doit être complètement absorbée par le morceau de pain.
  9. Pour déterminer le titre réel de l'inoculum, ajouter 1 ml de PBS stérile à l'un des piec de paines. Vortex vigoureusement pendant 1 min. Préparer des dilutions en série et la plaque à la fois BHI et BHI / L + G agar.
  10. Autre procédure pour un titre élevé (> 10 9 UFC) inoculum. Si le culot bactérien est trop grand, il peut être difficile à mettre en suspension dans un si petit volume, et le matériau résultant est très visqueux, comme une pâte, et une partie de l'inoculum peut s'en tenir aux côtés du tube de centrifugation. Dans ce cas, il est préférable d'inoculer le pain dans un plat mm stérile 60 de culture, et d'offrir à l'ensemble du plat (sans le couvercle) de la souris (voir ci-dessous). Tout excédent inoculum qui n'est pas absorbé par le pain peut être consommé directement par la souris. En général, il faut plus de temps pour les souris de manger tout le pain et lécher le plat propre que le protocole standard décrit ci-dessous, si ce n'est que la méthode préférée lorsqu'il s'agit d'inoculum très haut titre.

3. L'infection de souris

  1. Achetez des souris BALB / c / By / J (Stock # 0010026) et C57BL/6/J (Stock# 000644) de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) et à utiliser à 6-9 semaines d'âge.
  2. Rapide les souris d'une journée (24 heures) avant l'infection par le retrait de l'aliment et en plaçant la souris sur un plancher surélevé (1 pouce) de fil (# 3 mailles; Allentown) pour empêcher la coprophagie. Laisser une litière dans la cage pour absorber l'urine, mais pas assez pour élever les excréments hangar. Autoriser l'accès illimité à l'eau.
  3. Infecter la souris au début du cycle d'obscurité, en travaillant sous une hotte à flux laminaire équipée d'une ampoule de lumière rouge. Transfert d'un simple clic de souris à un (sans literie) cage vide. Utilisation d'une pince stérile, transférer le morceau de pain contaminé au fond de la cage vide. En règle générale, la souris va ramasser le morceau de pain et de le consommer entièrement dans 2-10 min. Si la souris ne mange pas le pain tout de suite, retourner la cage d'accumuler et de laisser la souris au repos pendant 20-30 min. La majorité des animaux va manger le pain dans ce délai, toutefois, les souris peuvent être laissés au repos, sans accès à l'OTsa nourriture ou de l'eau pour un maximum de 2 heures.
  4. Après l'infection, retournez la souris dans sa cage d'origine et de reconstituer le chow souris. Continuer à loger les souris sur planchers de fil soulevée pendant la durée de l'expérience.

4. Surveiller le niveau de bactéries excrétées dans les fèces

  1. tubes d'étiquettes et de pré-pesée microcentrifuge à utiliser pour la collecte de matières fécales.
  2. Travailler rapidement après avoir récupéré une cage de souris, placez chaque souris dans un bécher de 500 ml en plastique. En règle générale les souris expulser 1-4 boulettes de selles dans les 5 min.
  3. Utilisez une pince stérile pour transférer les matières fécales de tubes correctement étiquetés.
  4. Peser chaque tube et de calculer le poids des selles en soustrayant le poids du tube vide. Poids typiques de pelotes fécales vont de 10 à 30 mg.
  5. Ajouter PBS dans chaque tube (200 mg μl/30 fèces) et utiliser un cure-dent stérile pour écraser les les pelotes fécales.
  6. Vortex chaque tube pendant 30 secondes, puis préparer des dilutions en série et la plaque sur BHI / L+ G agar. Comptez le nombre de colonies et calculer UFC / mg fèces.

5. Traitement des tissus intestinaux infectés

  1. Euthanasier les souris, de façon aseptique récolter l'estomac et les intestins de chaque souris comme un simple tissu et recueillir dans des plats vides mm 100 Pétri.
  2. Séparer l'intestin grêle, du caecum et du côlon et le placer dans des plats séparés 60 mm stockées sur la glace. L'intestin grêle peuvent être divisés par longueur en trois parties égales rapprochant le duodénum, ​​le jéjunum et l'iléon pour faciliter le retrait du contenu luminal. Les tiers de tissu peuvent alors être traitées soit ensemble (pour UFC par entières intestin grêle) ou séparément. Tissus humides avec ~ 0,5 ml de PBS stérile pour garder souple et prévenir les déchirures lors de la manipulation.
  3. Remplir une seringue de 10 ml avec 8 ml de PBS stérile et attacher une aiguille de calibre 25. Utilisez des pinces stériles pour faire sortir le contenu luminal dans un bécher de déchets (ou un tube stérile de 50 ml si la collecte des bactéries luminales). Grippesh 4 ml de PBS à travers une extrémité du tissu, utilisez des pinces pour faire sortir le contenu, puis retournez le tissu et répéter à l'autre bout.
  4. Pour quantifier le nombre de Listeria dans le contenu luminal, centrifuger les bouffées regroupées pour 20 min à 12000 xg, suspendre le culot dans 0,5 à 1,0 ml d'eau stérile.
  5. Pour quantifier le nombre total de quantité associée à la cellule Listeria, ouvert tous les tissus lavés en coupant longitudinalement avec lame de bistouri stérile, puis faire plusieurs coupes latérales de découper le tissu en petits fragments. Remarque: cette étape est essentielle pour veiller à ce que le tissu intestinal ne pas s'enrouler autour de la lame d'homogénéisation. Transférer les morceaux intestinaux dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant 2 ml d'eau stérile.
  6. Stériliser un homogénéiseur tissulaire (Fisher PowerGen 1000) en plaçant la sonde dans l'éthanol à 70% à la puissance de 60% pendant 30 secondes. Attendez que l'éthanol à l'air sec, ou le processus dans l'eau stérile pendant 10 sec. Homogénéiser chaque tiuestion pendant 1 min. Répéter le traitement avec de l'eau stérile entre chaque échantillon, et d'utiliser l'éthanol à 70% entre les groupes d'échantillons.
  7. Préparer des dilutions en série de chaque échantillon dans de l'eau stérile et la plaque sur BHI / L + G agar.

6. Traitement des personnes infectées dans les ganglions mésentériques

  1. ganglions lymphatiques récolte aseptique, placer dans un plat 60 mm stérile sur la glace, et d'utiliser des pinces stériles pour enlever tout le gras ci-joint. Attendez-vous à trouver 3-6 nœuds par souris.
  2. Préparer écrans en treillis métallique en coupant 1,5-2 pouces morceaux carrés d'acier inoxydable # 80 mesh. Faire une petite incision dans chaque coin, et rabattre les quatre côtés, créant un lit surélevé. Trempez-les dans 95% d'éthanol et ensuite la flamme pour stériliser, et les placer dans une boîte de Pétri de 60 mm contenant 0,75 ml d'eau stérile. Après chaque utilisation, les écrans peuvent être recyclés en les trempant dans l'éthanol à 70% pendant 20 minutes, frotter avec une brosse pour enlever les tissus inclus, ébullition pendant 20-30 min dans NaOH 2N, puis rincer abondamment à l'eau.
  3. Utilisez le pistonà partir d'une stérile seringue de 3 ml pour écraser les nœuds à travers le tamis. Assurez-vous de pousser vers le bas sur l'écran pour le fond du plat de sorte qu'il entre en contact avec l'eau dans le plat.
  4. Passer de 0,75 ml d'eau stérile à travers l'écran, puis pipette de haut en bas plusieurs fois pour rincer l'écran. Transfert suspension de cellules dans un tube de centrifugation.
  5. Vortex chaque échantillon vigoureusement pendant 30 secondes pour lyser les cellules. Préparer des dilutions en série et la plaque soit sur BHI / L + G agar.

7. Le traitement des rates infectées, foies et de la vésicule biliaire

  1. Saisir la rate avec des pinces stériles et libérer en faisant deux entailles, une à chaque extrémité. Placer dans un tube de 15 ml contenant 2,5 ml d'eau stérile. (Note: tubes à fond rond peuvent être plus faciles à utiliser avec le dispositif d'homogénéisation.)
  2. Localisez la vésicule biliaire (un petit sac rempli de liquide jaune attaché au foie) et snip soigneusement avec des ciseaux stériles à se détacher de foie sans éclater. Transfer à un microtube contenant 1 ml d'eau stérile.
  3. Prélever stérilement le foie, en veillant à éliminer tous les lobes, et les transférer dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant 2,5 ml d'eau stérile.
  4. Homogénéiser la rate et le foie telles que décrites ci-dessus pendant 30 secondes sur la puissance de 60%. vessies Forgall, utiliser des ciseaux stériles pour déchirer dans le tube de centrifugation, puis vortex vigoureusement pendant 30 secondes.
  5. Préparer des dilutions en série et la plaque de chaque échantillon de chaque BHI ou BHI / L + G agar.

8. Traitement des cerveaux infectés

  1. De travail à partir du côté arrière de la souris, couper la peau et du tissu au-dessus du goulot, et à travers les deux oreilles à un angle de 45 °. Utilisez une pince stérile pour détacher le volet en forme de U de la peau en tirant vers le nez et exposer le crâne et les os du visage.
  2. Immobiliser le crâne en tenant la crête osseuse entre les yeux avec une pince, et utiliser des ciseaux pour faire des coupes profondes dans les bords latéraux du crâne. SoyezAttention à ne couper que le tissu cérébral et la moelle pas. Ensuite, couper la crête osseuse entre les yeux. Utilisez une pince pour tenir le sommet du crâne et tirez vers l'arrière (vers le cou) pour exposer le cerveau.
  3. Soulevez délicatement le cerveau de sa cavité en utilisant une pince stérile et les placer dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant 1,5 ml d'eau stérile.
  4. Homogénéiser pendant 20 secondes sur la puissance de 60% tel que décrit ci-dessus. Préparer des dilutions en série et la plaque soit sur BHI ou BHI / L + G agar.

9. Procédure complémentaire: fractionnement des tissus intestinaux

9.1 isolement de bactéries dans la fraction de mucus

  1. Pour chaque tissu intestinal, préparer 3 tubes contenant 3 ml de 6 mm N-acétylcystéine (NAC; Sigma # A-9165).
  2. Placez la rougeur et couper longitudinalement tissus dans le premier tube pendant 1-2 min, en remuant vigoureusement toutes les 20-30 secondes. En utilisant des pinces stériles, ramasser le tissu et presser doucement sur le côté du tube pour enlever l'excès de savon mouid.
  3. Répétez l'étape 9.1.2 deux fois plus en utilisant les tubes du CNA restants. Retirez le tissu intestinal et mettre de côté pour un traitement ultérieur.
  4. Piscine du CNA lave (total de 9 ml) et centrifuger pendant 20 min à 12000 x g.
  5. Reprendre le culot dans de l'eau stérile, vortex pendant 30 secondes, préparer des dilutions en série et la plaque sur BHI / L + G.

9.2 isolement de bactéries dans la cellule épithéliale Fraction (CE)

  1. Découpez chaque tissu en petits morceaux avec des ciseaux stériles et les placer dans un tube de 50 ml contenant 5 ml de RPMI (Invitrogen # 21870) supplémenté avec 5% de FBS (RP-5), 5 mM EDTA et 1 mM DTT. Incuber ° C pendant 20 min sous agitation à 37.
  2. Transférer les morceaux intestinales dans un nouveau tube contenant 5 ml RP5/EDTA/DTT et incuber pendant 20 min sous agitation à 37 ° C. Enregistrer le support du premier tube et mettre de côté à 37 ° C. Répétez ce processus une fois de plus pour un total de trois incubations 20 min dans RP5/EDTA/DTT. Si procéder à la lamina propria isoétape de règlement, transférer les morceaux restants dans l'intestin vide tube de 50 ml.
  3. Combiner les trois lavages de RP5/EDTA/DTT (volume total de 15 ml) et centrifuger à basse vitesse (1200 xg) à culot cellulaire.
  4. Pour quantifier les bactéries extracellulaires, recueillir le surnageant et centrifuger pendant 20 min à 12000 x g. Reprendre le culot dans 0,5 à 1,0 ml d'eau stérile et des dilutions en série de plaques sur BHI / L + G agar.
  5. Pour énumérer les bactéries intracellulaires, remettre le culot CE dans 5 ml de RP-5 contenant 25 pg / ml de gentamicine. Incuber la suspension de cellules individuelles pendant 30 min à 37 ° C plus 7% de CO 2 de tuer tout reste extracellulaire L. monocytogenes. Laver les cellules deux fois dans du PBS, de suspendre dans 0,5 ml d'eau stérile, et le vortex pendant 30 secondes pour lyser les cellules. Préparer des dilutions en série dans l'eau et la plaque sur BHI / L + G.
    Note: Les cellules recueillies à ce stade seront également contenir des cellules à partir des plaques de Peyer le sous-jacent. Si vous le souhaitez, le Peyer visible estLes patches peuvent être éliminés des tissus intestinaux avant de curage et de coupe longitudinale.

9.3 isolement de bactéries dans la lamina propria (LP) Fraction

  1. Rincer l'excès de DTT / EDTA à partir des morceaux intestinales par addition de 25 ml de PBS stérile au tube. Agiter vigoureusement, transférer dans un nouveau tube et répéter deux fois.
  2. Transférer les morceaux intestinales dans un tube de 50 ml contenant 4 ml de solution de digestion composé de RP-5 additionné de 1 mg / ml collagénase de type IV et de 40 pg / ml DNAse I. incuber pendant 40 min sous agitation à 37 ° C.
  3. Transférer les morceaux non digérés dans un nouveau tube contenant une solution de digestion de 4 ml et répéter une ou deux fois jusqu'à ce que les morceaux de tissus sont complètement digérées. Enregistrer chacune des solutions de digestion, qui contiennent des cellules LP libérées, à 37 ° C.
  4. Centrifuger les solutions de digestion communs à basse vitesse (1200 xg) à culot cellulaire. Traiter le surnageant et le culot cellulaire séparément comme le descrIBED ci-dessus pour énumérer les bactéries intracellulaires et extracellulaires, respectivement.

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Representative Results

Colonies de L. monocytogenes seront visibles sur BHI / L + G plaques après 36-48 heures d'incubation à 37 ° C. Les colonies ont un aspect blanc crème en forme de dôme lisse (figure 1A). La croissance sera inhibée pour la majorité de la flore intestinale, mais il n'est pas rare de voir des colonies qui ne sont pas L. monocytogenes, en particulier lorsque le placage de l'intestin grêle ou du colon directement sans dilution significative (figure 1B). Les colonies suspectes peuvent être confirmés par étalement sur ​​plaques Listeria Chromagar TM. L. monocytogenes apparaissent comme des colonies bleues entourées d'un halo blanc sur ces plaques (figure 1C). La limite de détection pour L. monocytogenes dans chaque tissu dépend du volume d'eau utilisé pour homogénéiser le tissu. Les volumes d'échantillons présentés dans le tableau 1 représentent le volume minimal nécessaire pour traiter efficacement chaque tissu. Homogénats de rate, gtous vessie, du cerveau ou de l'intestin fractionné peuvent être conservés à 4 ° C pendant 1-2 jours et ré-étalées si nécessaire. Colon, l'intestin grêle ou homogénats de foie peuvent inhiber certains L. monocytogenes à moins que l'échantillon est dilué suffisamment (figure 1D), et ces broyats ne donne pas CFU compte similaire si re-plaqué après stockage à 4 ° C.

Nous avons montré précédemment que BALB / c / Par / J souris (BALB) étaient significativement plus susceptibles de listériose d'origine alimentaire que C57BL / 6 (B6) des souris 16. Un inoculum de 10 7 UFC est suffisante pour établir une infection intestinale chez la souris BALB, mais au moins 10 8 UFC est nécessaire pour coloniser le tractus gastro-intestinal des souris B6 (Figure 2). Comme le montre la figure 2, la charge bactérienne dans l'intestin, la rate, le foie et la vésicule biliaire sera proportionnelle à la dose de provocation donné aux souris. Des études préliminaires suggèrent que 5 x 10 9 UFC estrapprocher de la DL 50 pour BALB / c / Par / J souris en utilisant ce modèle 16.

Figure 1
Figure 1. la croissance de la colonie de représentant sur ​​des plaques de gélose sélective. A) L. colonies monocytogenes après une croissance de 48 hr sur BHI / L + G agar. B) BHI / L + G agar inhibe la croissance de la plupart microbiote intestinal, mais certaines colonies non Listeria (flèche) peut être observée à basses dilutions. La plaque de gélose montré ici contient 100 pi d'une dilution 10 -1 sur la moitié de la plaque, et 50 pi de chacune des 10 -2 et 10 -3 dilutions d'un broyat du côlon. C) L. colonies monocytogenes peut être confirmée par une croissance sur des plaques de gélose Listeria CHROM. L. monocytogenes apparaissent en bleu avec un halo blanc autour de la colonie. D) Il n'est pas rare de see une inhibition de L. monocytogenes, ce qui entraîne dans les colonies de différentes tailles, dans le bas de dilution soit intestinal ou plaques homogénats de foie sur BHI / L + G agar.

Figure 2
Figure 2. dose-réponse de l'infection d'origine alimentaire chez les souris BALB / c / par / J et C57BL / 6. femelles BALB / c / par / J (BALB) et C57BL / 6 (B6) souris ont été infectées avec 10 9 (n = 7), 10 8 (n = 8), 10 7 (n = 6) et 10 6 (n = 4) Lm InlA m et le nombre d'UFC dans chaque tissu a été déterminé 5 dpi. Valeurs moyennes + / - écart-type sont représentés. Les données regroupées provenant de deux expériences différentes ont été analysées. Les lignes pointillées indiquent la limite de détection dans chaque organe.

Tissue Le volume d'échantillon (ml) une La limite de détection (CFU)
L'intestin grêle 2.0 50
Caecum 2.0 50
Colon 2.0 50
Ganglions lymphatiques mésentériques 1.5 15
Spleen 2.5 50
Foie 2.5 50
vésicule biliaire 0.5 10
Cerveau 1.5 15

Tableau 1. Limite de détection pour L. monocytogenes dans les broyats de tissus. un volume total de l'échantillon moyen constitué d'eau stérile, plus le tissu homogénéisé.

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Discussion

Souris consanguines sont pas uniformément réceptif à l'alimentation, à tous les moments de la journée, et leur volonté de manger le pain contaminé dépendront à la fois sur le type de souche et l'âge des souris 17. Dans notre expérience, 6-9 semaine vieilles souris B6 sont réceptifs à l'alimentation, à tout moment de la journée, mais les souris BALB ne seront pas toujours manger le morceau de pain que si elle est offerte au cours de leur cycle sombre. Le cycle de la lumière de la pièce utilisée pour loger les animaux peut être modifié de sorte que la phase d'obscurité coïncide avec la journée normale de travail pour le personnel de laboratoire. Cependant, les souris doivent être administrés au moins deux semaines pour s'acclimater au cycle de la lumière altérée avant l'infection. Au cours de l'infection, seules lampes rouges doivent être utilisés soit dans la chambre elle-même ou dans la hotte à flux laminaire.

Dans l'élaboration de ce modèle, le pain a été choisi comme source de nourriture pour transmettre L. monocytogenes en grande partie parce que le pain est absorbant. Ainsi, il était facile de saturer petits morceaux avec ee inoculum bactérien et s'assurer que chaque souris ingéré la même dose. Cependant, ce modèle pourrait facilement être adapté pour utiliser d'autres sources de nourriture. En effet, c'est le seul modèle de souris qui peut être utilisé pour tester directement l'effet de la composition des aliments ou des conditions de stockage sur l'infectivité bactérienne. L. monocytogenes peut facilement s'adapter à la croissance forte teneur en sel, faible pH, ou à des températures froides 1,2,18, mais on ne sait pas si ces conditions de croissance altèrent la capacité des bactéries à établir une infection intestinale.

Environ 10 minutes sont nécessaires pour récolter tous les organes infectés à partir d'un simple clic de souris. La vésicule biliaire est facilement rompu, il est donc préférable de le retirer. Les ganglions mésentériques sont plus faciles à repérer quand les intestins n'ont pas été perturbés, ils doivent donc être retirés prochaine. Les intestins peuvent être récoltés en un seul tissu en coupant juste au-dessous de l'estomac et juste au-dessus de l'annexe, puis séparés en duodénum, ​​le jéjunum, ILEUm, caecum et du côlon, juste avant le rinçage et l'homogénéisation. La rate et le foie sont généralement enlevés prochain, et le cerveau est récolté après avoir récupéré les organes de la cavité péritonéale, comme il est nécessaire de tourner la souris dessus pour accéder à la boîte crânienne. Lorsque vous travaillez avec plusieurs souris, tous les tissus doivent être conservés sur la glace jusqu'à sa transformation. Pour la plupart des tissus, une plaque de gélose a été utilisée pour déterminer le nombre total de CFU présents dans le tissu. La plaque a été divisée en trois tiers, et un échantillon 50-100 ul de trois dilutions distinctes du broyat de tissu a été plaqué sur chaque troisième.

Les méthodes décrites ici permettront d'identifier le nombre total de L. monocytogenes dans chaque tissu de la souris, et pas seulement les organismes intracellulaires. Le style de vie intracellulaire unique de L. monocytogenes est pensé pour être un facteur de virulence essentiel lors de l'infection 18,19. Toutefois, L. monocytogenes sont facultatives, pas obligatoires, les agents pathogènes intracellulaires, et there n'existe pas de rapports publiés définitives pour indiquer le pourcentage de Listeria qui résident effectivement dans les cellules in vivo. La plupart des études précédentes utilisant L. oral infection monocytogenes s'est appuyé sur la gentamicine traitement des tissus de l'intestin pour inhiber la croissance du microbiote intestinal. Pré-traitement par la gentamicine a le potentiel d'éliminer extracellulaire L. monocytogenes, permettant de récupérer uniquement les bactéries intracellulaires, mais il n'est pas clair dans quelle mesure la gentamicine est capable de pénétrer les tissus intestinaux entiers in vitro. Le protocole complémentaire décrite ici permet de déterminer à la fois les bactéries intracellulaires et extracellulaires dans la couche de mucus, de l'épithélium, et le compartiment de la lamina propria de tissus intestinaux infectées. Dans cette procédure, la gentamicine est utilisé pour traiter des suspensions cellulaires simples, s'assurer que toutes les bactéries récupérées étaient à l'intérieur des cellules dans les tissus.

Trois lavages avec NAC re typiquementdéplacé la majorité de la muqueuse des tissus intestinaux, et les lavages communs ne contenaient pas de cellules eucaryotes (viables ou morts), tel que déterminé par coloration au bleu trypan. Lavages supplémentaires n'ont pas donné de mucus visible tel que déterminé par Diff-Quik coloration des préparations de lames cytospine. La cellularité de la CE et les fractions LP peut également être confirmée par Diff-Quik ou Giemsa. La fraction CE devrait être composé de cellules épithéliales principalement, qui peuvent facilement être distingués de ces lymphocytes intra-épithéliaux présents dans l'épithélium intestinal. La fraction de LP est plus diversifiée, contenant un mélange de cellules mononucléaires qui modifie la composition après l'infection lorsque les monocytes inflammatoires infiltrent le tissu.

Le modèle d'origine alimentaire de la listériose peut être utilisé avec une grande variété de L. isolats monocytogenes, y compris la souris adaptée InlA m exprimant souche 15 décrit ici, le type EGDe sauvage et mutant de délétion Derivateurs de ces souches 16. Dans une étude précédente, nous avons montré que le niveau de colonisation intestinale n'a pas varié significativement entre ces souches, cependant, les isolats qui n'ont pas exprimé un ligand d'affinité élevée pour murine E-cadhérine a eu un léger défaut dans la diffusion vers les ganglions lymphatiques mésentériques et rate 16. De même, toute souche de souris peut être utilisée pour l'infection, ce qui en fait un système modèle attrayant pour étudier à la fois la pathogenèse bactérienne et les réponses à l'infection hôte. Enfin, même si nous n'avons pas encore testé cette directement, nous proposons que les procédures de base utilisées ici devraient être largement applicable à d'autres pathogènes alimentaires bactériennes, telles que Salmonella, Yersinia, Escherichia, Campylobacter et les espèces Citrobacter.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents. Toutes les expériences décrites ici ont été réalisées en conformité avec le Bureau de l'Animal de Laboratoire Bien-être (OLAW) avec l'approbation du ICAUC à l'Université du Kentucky.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par des subventions des National Institutes of Health (AI079442 et AI091918) attribués à SEFD

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain Heart Infusion Agar Difco BD-241830
Lithium chloride Sigma L9650
Glycine Omnipur 4840
EDTA Gibco 15575-038
DTT Sigma D5545
Collagenase, type IV Worthington LS004089
DNAse I Worthington LS002007
Diff-Quik Dade-Behring B4132-1A
PowerGen 1000 homogenizer Fisher 14-261-06
stainless steel type 304 mesh #80 Small Parts, Inc. CX-0080-C
Cytospin Statspin M801-22

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References

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