높은 처리량 마이크로 분석 실험을 사용하여 워터스, 토양 및 퇴적물에있는 미생물 세포 외 효소 활성의 결정

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Summary

마이크로 플레이트 기반 절차는 세포 외 효소 활성의 형광 또는 비색 분석을 위해 설명된다. 이러한 절차는 관리 기간 내에 환경 시료 다수 이러한 활동의​​ 신속한 분석을 허용한다.

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Jackson, C. R., Tyler, H. L., Millar, J. J. Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays. J. Vis. Exp. (80), e50399, doi:10.3791/50399 (2013).

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Abstract

자연 환​​경의 영양 순환과 탄소 처리의 대부분은 미생물에 의해 발표 세포 효소의 활동을 통해 발생합니다. 따라서, 이러한 세포 외 효소의 활성 측정은 유기물 분해 또는 질소와 인 광물 등의 생태계 수준의 프로세스의 속도에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 환경 시료에서 세포 외 효소 활성의 분석은 일반적으로 인공 측색 또는 형광 기질에 샘플을 노출하고, 기판의 가수 분해 속도를 추적 포함한다. 여기에서 우리는 짧은 기간 내에 다수의 샘플의 분석을 할 수있는 절차를 마이크로 기반의 방법을 설명한다. 샘플은 마이크로 블록 마이크로 플레이트 또는 디프 웰 96 - 웰 내에 인공 기질과 반응 할 수 있으며, 효소 활성이어서 전형적인 마이크로 플레이트를 사용 Reade에 얻어진 최종 생성물의 흡수 또는 형광에 의해 결정된다R 또는 형광 분석기. 이러한 높은 처리 절차는 공간적으로 분리 된 사이트 또는 생태계 간의 비교를 용이하게, 또한 실질적으로 샘플 당 필요한 시약 전체적인 부피를 감소시킴으로써 그러한 분석법의 비용을 줄일뿐만 아니라.

Introduction

박테리아 및 곰팡이 등의 미생물 세포 효소의 생산을 통해 복잡한 유기 화합물의 영양분과 탄소를 얻을 수 있습니다. 이러한 효소는 전형적 셀로 취할 수 작은 소단위로 중합체를 가수 분해한다. 따라서, 생태 학적 수준에서, 이러한 미생물의 세포 외 효소는 영양 광물 및 자연 환경에서 발생하는 유기물 분해의 대부분에 대한 책임이 있습니다. 이러한 cellobiohydrolase (CBH) 및 β-글루코시다 제 등의 효소는 미생물의 흡수와 동화에 대한 utilizable 탄소 기판을 제공 1,2 포도당 셀룰로오스의 가수 분해를 촉진하기 위해 한마음으로 셀룰로오스 분해 작업을 위해 중요하다. 효소 포스는 유기 인계에서 수용성 무기 인산염 그룹, 기본적으로 인산염 광물 화하고 대부분의 생물 3에서 사용할 수있게 만들을 출시. 이러한 N-acetylglucosaminidase (나가세)와 같은 다른 효소는 importan 아르키틴 분해에 t, 탄소 및 미생물 인수 4에 해당하는 질소의 양을 만들 수 있습니다.

자연 환경에서 미생물의 세포 외 효소 활성의 분석을위한 절차 중 하나는 인공 P-니트로 페닐 (p의 NP) 연결된 기판 원래 토양 포스 파타 아제 활성을 검출하기 위해 개발 된 방법의 사용이다. 이 방법은 인공 기판이 해당 효소에 의해 가수 분해 될 때 방출되는 컬러 최종 제품, P-니트로 페놀의 검출에 의존한다. P-니트로 페놀은 이후 약 400 ~ 410 nm에서 흡광도를 측정하여 색도계로 정량화 할 수있다. 이 방법은 시간과 같은 나가세 6와 같은 다른 효소를 검출하도록 적용되고 있으며, 토양 및 퇴적물 7-9 미생물 세포 외 효소 활성을 찾고 다양한 연구에 사용되었다.

originall의 있었다 다른 방법Y는 10,11 4 - 메틸 움 (MUB) 연결된 기판을 이용한다 수중 환경에서 세포 글루코시다 제 활성을 평가하기 위해 개발 하였다. (4 - 메틸 움) 릴리스 최종 생성물은 높은 형광이며 460분의 360 nm의 주변의 여진 / 배출 설정으로 형광 분석기를 사용하여 검출 될 수있다. MUB 연결된 인공 기판의 다양한 P는 NP-기판 비색 절차를 사용하여 정량 할 수있는 이상으로 많은 효소 (예 : β-글루코시다 아제, cellobiohydrolase, 나가세, 인산 가수 분해 효소)의 활동의 형광 측정을 허용, 사용할 수 있습니다. 이러한 단백질 분해 로이신 아미노 펩 티다 제와 같은 기타 미생물 세포 외 효소, 7 - 아미노 -4 - 메틸 쿠마린 (COU) 연결된 기판을 사용 fluorometrically 정량 할 수있다. MUB과 커플 연결 기판은 모두 다양한 육상 및 수생 샘플 (12, 13)의 효소 활성을 결정하는 데 사용되었다.

이전의 연구는 descr가있는 반면IBED 형광 또는 비색 마이크로 플레이트는 세포 외 효소 활성 (14)을 결정하기 위하여 접근 등의 분석을 수행하는 방법에 대한 명확한 프리젠 테이션에 대한 필요성이있다. 여기서 우리는 비색 P의 NP-결합 기판 방식을 사용하여 토양과 퇴적물 및 형광 MUB 연결된 기판 기술을 사용하여 자연수의 세포 외 효소 활성의 분석을위한 높은 처리량의 마이크로 기술을 수행하기위한 절차를 보여준다. 이 효소는 각각 탄소, 질소 및 인 순환에 연결 될 수있는 우리는 β-글루코시다 아제, 나가세, 및 포스 파타 아제의 활동의 측정에 초점을 맞 춥니 다. 그러나, 여기에 기재된 절차는 서로 다른 인공 기질을 사용하는 다른 세포 외 효소의 측정에 적용 할 수있다.

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Protocol

토양 및 퇴적물의 세포 외 효소 활성의 비색 분석

1. 효소 활성의 비색 분석 용 기판 및 버퍼 솔루션의 제조

  1. 50 ㎖의 0.1 M 아세트산 (2.87 ㎖를 500 ㎖의 물에 빙초산)를 혼합하여 50 mM의보기 아세테이트 완충액 (pH 5.0-5.5)를 준비하고, 150 ㎖의 0.1 M 아세트산 나트륨 및 200 ㎖의 증류수 H 2 O. 필요한 경우 0.1 M 아세트산으로 5.0-5.5로 산도를 조정합니다.
  2. 증류 H 2 O. 1 M 수산화 나트륨 (NaOH를)의 용액을 준비
  3. 50 mM의 아세테이트 버퍼에 P는 NP-연결된 기판 솔루션을 준비합니다. 인산 가수 분해 효소는 50 mM의 아세테이트 버퍼에 5 밀리미터 P는 NP-인산염을 준비을 검정, β-글루코시다 아제가 5 밀리미터 P는 NP-β-글루 코피 라노를 준비 분석 실험하기 위해, 나가세가 2 ㎜ PNP-β-N-acetylglucosaminide을 준비 분석 실험 할 수 있습니다. 멸균 15 ML 50 ML의 원심 분리기 튜브의 모든 기판 솔루션을 준비합니다. 솔루션 2 ~ 3 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.

2. P는 NP 농도를 흡광도를 변환하는 표준의 결정

  1. 50 mM의 아세테이트 버퍼에 P-니트로 페놀 표준 용액을 준비합니다. 농도는 MM의 0.025-1 다양합니다.
  2. 분명 96 - 웰 마이크로 플레이트로 전송 각 농도 100 μL의 세 개의 반복을. 각 웰에 H 2 O를 증류수 10 ㎕의 1 M NaOH를 190 μl를 추가합니다.
  3. 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 410 nm에서 흡광도를 기록.
  4. 0.3로 표준 곡선에 곱하기 농도는 300 ㎕의 반응 부피 당 μmoles P는 NP를 얻을 수 있습니다. P는 NP의 μmole 대 흡광도의 곡선을 그린다. 곡선의 기울기는 각 효소 반응에서 P는 NP 건 μmole하는 흡광도 관해서 것이다 변환율 (C)로서 기능한다.

3. 효소 분석을 실시

  1. 토양, concentr에서 멸균 15 ㎖의 원심 분리 관으로 측정 될 각 샘플의 슬러리를 조제대략 1 ㎍ / ㎖ -1 50 mM의 아세테이트 버퍼를 사용 ATION. 퇴적물의 경우, 슬러리 쉽게 pipettable 할 수있을 정도로 충분한 아세테이트 버퍼를 추가합니다. 필요한 슬러리의 정확한 양이 정량 효소의 수에 따라 달라질 수 있지만, 5 ㎖의 최소 권장합니다. 소용돌이 토양 또는 퇴적물의 모든 덩어리가 분산 최종 볼륨을주의 할 때까지 각 슬러리.
  2. 다시 소용돌이 각 슬러리 즉시 96 웰 deepwell 블록 (그림 1)에 6 각 웰에 150 μl를 피펫. 이 현탁액에 토양 입자를 유지하기 위하여 충분히 자주 와류 중요하다. 기판의 제어 역할을하는 빈 블록 당 적어도 두 개의 우물을 남겨주세요. 참고 : 토양 슬러리는 팁을 방해하는 경향 전에 피펫을 가위로 피펫 팁의 끝을 클립. 정량 할 각 효소에 대해 하나의 96 - 웰 블록을 준비합니다.
  3. 피펫 저수지로 아세테이트 버퍼의 약 5 ㎖를 붓고 L에 버퍼 150 μl를 추가하는 8 채널 피펫을 사용하여AST 각 샘플의 두 우물 (이 샘플 버퍼 컨트롤 예정) 및 두 기판 제어 우물 (그림 1)
  4. 피펫 저장조에 적합한 P NP-기질 용액 약 10 ㎖를 넣고 (도 1) 각 시료의 처음 네 개의 우물과 2 개의 기판 대조군 웰에 기질 용액 150 μL를 추가 8 - 채널 피펫을 사용한다. 반응이 빨리 기질 용액을 첨가로 시작으로 시간을 참고.
  5. 0.5-4 시간 동안 RT (22 ℃)에서 번호판을 품어. 정확한 배양 시간은 활동 샘플 수준과 정량하는 효소에 따라 달라집니다. 나가세와 다른 효소> 2 시간의 배양 시간을 필요로하는 반면 대부분의 토양과 퇴적물, 인산 및 β-글루코시다는 0.5 ~ 1.5 시간의 배양 시간이 필요합니다.
  6. 분석 흡광도를 읽을 마이크로 플레이트 분명 96 - 웰을 준비 배양하는 동안. (즉, 각 전자에 대한 각 deepwell 블록에 대해 하나의 마이크로 준비nzyme) 정량. 피펫 10 μL 1 M 수산화 나트륨과 마이크로 플레이트의 각 웰에 증류수 190 μL. 참고 : 수산화 나트륨은 효소 반응을 느리게하고, 반응시 방출되는 P는 NP의 색상을 향상시켜 pH를 발생시킵니다.
  7. 배양 후, 토양 입자 펠렛 5 분 동안 2,000-5,000 XG에서 96 - 웰 블록을 원심 분리기.
  8. 펠릿 않도록주의하면서, 각 우물에서 100 μl를 철회하는 멀티 채널 피펫을 사용하여 제조 된 명확한 96 - 웰 마이크로 플레이트에 잘 대응에 전송할 수 있습니다.
  9. 마이크로 플레이트 리더를 켜고 필요한 소프트웨어를 설정합니다. 410 nm에서 흡광도를 기록. 특정 웰의 흡광도는 플레이트 리더의 선형 검출 한계 이상 물과 재 측정 랑은 잘 1:1로 희석합니다. 흡광도가 여전히 너무 높은 경우, 분석은 짧은 배양 시간에 따라 반복한다.

4. 샘플의 건조 질량의 결정

  1. 각 SAMPL의 피펫 1 ㎖ preweighed 알루미늄 냄비에 전자 슬러리.
  2. 48 시간 동안 75 ° C의 건조 오븐에서 건조하고 무게. 슬러리의 1 ㎖에 흙이나 퇴적물의 건조 질량을 얻기 위해이 값에서 팬의 무게를 뺍니다. 효소 분석에서 각 웰에 첨가 150 μL에 샘플의 건조 질량을 결정하기 위해 0.15의 계수를 곱한다.

5. 건조 토양의 질량 또는 침전물 당 효소 활성의 계산

  1. 샘플 분석 흡광도에서 샘플 제어 흡광도를 뺀 각 샘플의 최종 흡광도를 계산합니다. 기판 컨트롤이 높은 흡광도가있는 경우 (약> 0.060) 다음 또한 사람들을 뺍니다.
  2. μmoles 인사 -1 들어 건조 질량 -1 방정식에서의 효소 활성을 계산합니다 :

효소 활성 = 최종 흡광도 / (C의 X 배양 시간의 X 샘플 건조 질량)

자연수의 세포 외 효소 활성의 형광 분석

효소 활성의 형광 측정 분석을위한 TLE "> 1. 기판, 표준의 준비, 및 버퍼 솔루션

  1. 멸균에 적합한 기판을 용해하여 MUB 연결된 기판 (예를 들어 4 - MUB-β-글루 코피 라노, 4 MUB - 인산, 4 MUB-N-아세틸-β-D-glucosaminide) 200 μM 솔루션을 준비합니다 (오토 클레이브) 증류수 멸균 15 ML 50 ML의 원심 분리기 튜브의 H 2 O. 빛을 제외하고 사용하기 전에 냉장고에 저장하는 알루미늄 호일에 튜브를 감싸십시오. 이러한 방식에서 저장하는 경우 기판은 적어도 1 주 동안 안정해야한다.
  2. 멸균 증류수 H 2 O 100 μM 4 - 메틸 움의 원액을 만들어 MUB 표준을 준비 상점은 황색 또는 호 - 병 포장에 냉장. 사용하기 직전에, 효소 분석을위한 10 μM의 작업 솔루션을 만들기 위해 멸균 H 2 O로 1 / 10로 100 μM 원액을 희석.
  3. 탄산 수소 나트륨 <8.4 g을 용해시켜 100 mM의 중탄산 완충액 원액을 준비서브> 3 1 LH 2 O 및 고압 증기 멸균에. 효소 분석을위한 5 mm의 작업 솔루션을 필요에 따라 멸균 H 2 O로이 원액 1 / 20을 희석.

2. 96 - 웰 블랙 마이크로에 조직 물 샘플

  1. 그림 2의 예를 다음 각 효소를 마이크로 플레이트를 구성합니다. 적절한 복제, 표준 및 제어를 허용,이 절차는 하나 96 - 웰 블랙 마이크로에 최대 9 개의 물 시료에 대해 하나의 효소의 활동을 분석 실험 할 수 있습니다.
  2. 피펫 저수지에 첫 번째 샘플의 약 5 ㎖를 붓고 마이크로 (들)의 열 1의 우물 모두에 μL pipette200하는 8 채널 피펫을 사용합니다. 사용 피펫 팁을 취소하고 열 1-9을 채우기 위해 각 물 샘플에 대해 필요에 따라 반복합니다.

3. 샘플을 설정, 표준, 끄다, 기판 제어

  1. 표준 샘플에 대한 계정 컨트롤을 설정의, 기판과 샘플과 동일한 블랙 마이크로 (그림 2)에서 담금질.
  2. 샘플 컨트롤 샘플 물, 중탄산 버퍼를 포함하고, 액티비티 계산에 사용되지 않지만 실험 과정에 걸쳐 일관성을 읽고 설명 할 것이다. 급랭 컨트롤 샘플 물, 형광 태그의 기본 량으로 구성하고 샘플 물 형광의 회절을 측정하는 데 사용된다. 기판 및 표준 컨트롤 기판 연결 또는 표준 형광 태그, 각각 중탄산염 하나의 버퍼로 구성되어 있습니다.
  3. 깨끗한 피펫 저수지에 5 mM의 중탄산염 버퍼의 약 5 ㎖를 붓는다. 피펫 마이크로 우물에 버퍼 50 μl의 1 행에서 9까지의 D와 E는 두 개의 샘플 당 샘플 컨트롤의 우물을 복제 형성한다. 변경 피펫 팁은 행의 (10 ~ 12) 우물에 수소 나트륨 완충액 200 μl를 전송 및 H.
  4. 리를 흐리게하거나 해제하여 주변 조명을 감소형광 표준으로 ghts은 빛에 민감합니다.
  5. 깨끗한 피펫 저수지에 10 μM 4 - 메틸 움의 약 5 ㎖를 붓는다. 피펫 마이크로 웰에 50 ㎕의 행 H 1부터 12까지, 그리고 우물에 행 G와 F에 1-9 샘플 당 급냉 컨트롤과 전체 표준 컨트롤의 세 개의 반복을 형성한다. 어둠 속에서 마이크로 플레이트를 배치하거나 MUB의 빛 저하를 줄이기 위해 불투명 뚜껑 커버 하나.
  6. 형광 분석기의 전원을 켜고 설정 업 기판을 추가하기 전에 읽을 준비가되어 필요한 소프트웨어를. 참고 : 일부 형광 전구가 3 분 이상 예열 시간을 필요로 할 수있다.
  7. 깨끗한 피펫 저수지에 해당 MUB 연결된 기판 (예를 들어, 4 - MUB - 포스페이트)의 약 5 ㎖를 붓는다. 각 샘플에 대한 세 가지 복제 분석 및 세 개의 기판 컨트롤을 형성하기 위해 1 행 B와 C에서 9까지의 1 행에 12를 통해 마이크로 우물에 50 μl를 피펫, 우물로하는 12 채널 피펫을 사용합니다. 이 immediatelY는 4.1, 기록 형광 단계로 진행합니다.

4. 기록 형광

  1. 바로 마이크로에 기판을 첨가 한 후, 초기 형광을 읽어보십시오. 형광을 읽은 후에 하나 RT (22 ° C)에서 마이크로 플레이트를 품어 어둡거나 MUB의 빛 저하를 줄일 수있는 불투명 한 뚜껑으로 덮여있다.에게
  2. 물 샘플에서 최대 전위 효소 활성을 측정하는 데 필요한 배양 시간은 샘플 내의 효소 농도에 의존 할 것이다. 분석이 완료되기 전에이 불명하기 때문에, 마이크로 플레이트는 다수의 시간 단계에서 판독되어야 할 것이다. 특정 효소에 대한 매우 높은 활성을 가진 샘플을 10 분 전에 피크 수 있지만 일반적으로 1 시간에 걸쳐 10 ~ 15 분 간격으로 읽는 많은 효소 허용됩니다.
  3. 적어도 1 시간에 지정된 간격으로 마이크로 형광 계속 읽기. 마이크로 덮여 유지해야하거나 독서의 어둠 속에서 수의.

5. 물 부피당 효소 활성의 산출

  1. 초기 샘플의 형광 (웰 D 및 E)를 의미하는, 평균 최종 샘플 형광 (웰 AC), 평균 표준 형광 (웰 H10-11), 평균 제어 형광 급냉 (웰 : 각각의 시간 간격으로 각각의 샘플을 계산할 FG).
  2. 각각의 시간 간격, 나노 몰의 시간의 효소 활성을 계산 -1 ML -1 방정식에서 :

효소 활성 = (샘플의 형광을 의미 - 초기 샘플의 형광을 의미) / (() 시간 시간 (X) 0.2 ㎖ (표준 형광) X를 의미 / 제어 형광을 해소 평균 (표준 형광 / 0.5 몰) X 평균)

  1. 각 시간 단계에서 계산 된 활동 값을 검사합니다. 가장 높은 활성 시간 단계에서 최종 잠재적 인 활동을 결정합니다. 활동 값이 계속 증가 할 경우, 나중에 단계가 필요할 수 있습니다 활동을 통해서 값이 떨어질 경우호우 실행의 과정은 다음 짧은 시간의 단계를 다시 실행합니다. 최종 활동은 기판 소비 시간 -1 -1 ML의 나노 몰에 있지만 시간 -1 L -1 μmoles로 표현하도록 확장 할 수 있습니다.

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Representative Results

토양과 수생 퇴적물 일반적 부착 미생물 군집 (생물막) 입자의 표면에 성장의 결과로 세포 외 효소 활성의 상당한 수준을 가지고.이 액티비티는 제 3 표면 침전물로부터 얻어지는 입자의 크기에 따라 변경하는 방법도 3 도표 북부 미시시피, 미국에서 주문 스트림. 이전의 연구는이 스트림에서 퇴적물 입자의 세균성 지역 사회가 사회 구조의 분자 분석을 기반으로 세 가지 그룹으로 분리 될 수있는 것으로 나타났습니다 : 0.063 mm 입자, 0.125에 그, 0.25, 0.5 mm 입자에 그, 그 1mm에 (15)는 입자. 세포 외 효소 활성의 패턴의 분석은 이러한 결론을 지원 포스파타제 (도 3a)와 0.125, 0.25, 및 0.5 mm의 입자에 유사한 것으로하지만, P는 NP-결합 기판 기술을 사용하여 측정시, 1 및 0.063 mm 분획에 훨씬 높다. O이러한 β-글루코시다 아제 (그림 3B), 그리고 나가세 (그림 3C)와 같은 거기 효소는 가장 정밀한 입자에 유사한 피크를 보여 주지만, 다른 효소가 서로 다른 환경 분포를 표시 할 수 있으며이 될 수 있다는 사실을 강조, 1mm의 입자에 상승되지 않습니다 이 분석을 이용하여 해명. 비교적 낮은 오차 막대는 서로 다른 환경 시료를 비교할 때 퇴적물에서 효소 활성의 비색 분석법은 재현성 및 통계 분석하는 것이 의무임을 보여준다.

천연 물은 토양이나 침전물이 g 당 할 이상 mL의 낮은 세포 외 효소 활성을 갖는 경향이있다. 따라서, 그들은 MUB 링크 된 기판을 사용하여 fluorometrically 정량되어야한다. 효소 포스 파타 아제 (그림 4A)의 활동이, β-글루코시다 아제 (그림 4B)와 나가세 (그림 4C)는 얕은 호수에 깊이에 따라 변화하는 방법 4는 그림 북부 미시시피, 미국A. 호수 (쓸데 호수)도 인산 가수 분해 효소 (그림 4A)의 상대적으로 높은 활동에 의해 제안 영양소별로 16, 미생물이 유기 화합물에서 인산염을 확보하기 위해 생산하는 것이 효소로 알려져있다. 활성 100cm 샘플에서 증가되었다 반면 정량 효소의 세 들어 물 표면 (0cm) 및 50cm 깊이에서 수집 샘플은 유사한 활성을 나타내었다. 이 샘플은 본질적으로 물이 침전물 인터페이스에서 가져온 샘플의 퇴적물 입자의 존재 가능성이 특히 β-글루코시다 아제와 나가세를 들어,이 예제에서 볼 수있는 높은 활성을 차지했다. P는 NP 기판과 같이, 낮은 오차 막대는 심지어 단지 세 복제에 판독하여, MUB 기판을 이용하여 형광 분석법의 재현성이 높은 것으로 나타났다.

그림 4 단위는 그림 3에 대한 그 반면 소비 기판의 나노 몰에 있습니다당 단위 크기가 (ML 당 또는 g 당 하나) 비교하더라도, 소비 기판 μmoles에있다. 이것은 토양과 퇴적물이 천연 수보다 훨씬 높은 세포 활동을 (그림 3의 각 특정 효소의 활동이 약 그림 4에 해당하는 효소의 활동을 10 - 100 배 더 높다)하는 경향이 있다는 사실을 강조한다. 또한 MUB 연결된 기판 기술 및 물 샘플에서 세포 외 효소 활성을 정량하기위한이 기술을 사용의 필요성의 증가 된 민감도를 보여준다.

그림 1
그림 1. 비색 P는 NP-링크의를 사용하여 토양 또는 퇴적물의 세포 외 효소 활성의 분석을위한 96 - 웰 깊은 우물 블록의 제안 레이아웃ubstrate 기술. 각 잘 샘플 실행, 예제 제어, 또는 기판의 컨트롤인지 여부에 따라 샘플 슬러리, 기질 용액, 또는 아세테이트 버퍼의 구성 300 μL의 총을 받아야한다.

그림 2
그림 2. 형광 MUB 연결된 기판 기술을 사용하여 물 샘플에서 세포 외 효소 활성의 분석을위한 마이크로 플레이트를 96 - 웰 블랙의 메이커 레이아웃. 나인 샘플 플레이트 (A) 팔 웰 점유 각에 수직으로 배치 될 수있다. 이 8 웰 샘플 실행 샘플 컨트롤에 사용하고, 나머지 우물 기판 컨트롤과 MUB 기준 (B)에 사용하는 동안 컨트롤을 해소됩니다.

그림 3 그림 3. 북쪽 미국 미시시피에있는 작은 스트림에서 수집 표면의 퇴적물 입자의 서로 다른 크기의 세포 외 효소 활성. 각각의 입자 크기 분획 포스 파타 아제 (A), β-글루코시다 제 (B)의 활동을 분석하고, 나가세 (C) 다음되었다 P NP-기판 비색 절차. 활동은 퇴적물 -1 μmoles 기판 소비 시간 -1 들어 건조 질량에보고 된 입자 크기 부분에 세 복제 측정 값의 평균 (+ SE)입니다.

그림 4
그림 4. 세 DIF에서 찍은 물에 세포 외 효소 활성ferent 깊이 (0, 50 및 100cm)은 북쪽으로 미시시피에서 얕은 호수에서, 미국. 물은 인산 (A), β-글루코시다 제 (B)의 활동을 분석하고, 나가세 (C) MUB 기판을 다음되었다 형광 절차. 활동 물 -1 나노 몰 기판 소비 H-1 ml의에보고하고 샘플 당 세 개의 복제 수치의 평균 (+ SE)입니다.

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Discussion

토양과 퇴적물에있는 미생물의 세포 외 다양한 효소의 활동을 결정하는 것은 영양 광물 및 유기물 처리 17의 속도로 유용한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 그러나 토양은 수분 수준이 다를 수 있으므로 토양 건조 중량으로 활동을 표준화하는 것이 중요합니다. 이것은 단순히 효소 활성을 측정 넘어 (전형적 이틀) 추가로 건조 공정을 필요로한다. 따라서, 즉각적인 결과를 제공하는 근처에 물 샘플에있는 효소 활성의 분석에 대비, 토양 및 퇴적물에있는 효소 활성의 신뢰할 수있는 분석은 몇 일이 소요된다. 일부 토양의 경우, 심지어는 건조 과정을 넘어 추가 애싱 단계 (500 ° C에서 일반적으로 2 시간)을 필요로하는 유기물 또는 재 무료 건조 질량의 그램 당 활동을 표현하는 것이 더 적절할 수있다. 관계없이, 토양 또는 퇴적물 효소 활성의 비색 분석에서 가장 중요한 단계는 딥 - 웰 블록 F로부터 상등액 철수이다배양 기간의 끝에서 원심 분리를 따르게. 이 절차는 흡광도를 측정에 의존하기 때문에, 최종 마이크로 몇 부유 토양 입자도 존재 허위 결과가 발생할 수 있습니다. 높은 원심 분리 속도 (> 5,000 XG)이 문제를 완화하는 데 도움이 있지만, 마이크로 플레이트 동의를 경험 원심 분리기 회 전자에 보통이 임계 값 아래 회전 한계가 있고, 블록 자체가 훨씬 더 높은 속도를 용납하지 않을 수도 있습니다. 본질적으로,이 특정 피펫 팅 단계는 빠르게 마이크로 플레이트에 딥 - 웰 블록에서 상청액의 필요량을 전송하는 멀티 채널 피펫을 사용하여 치료 및 속도의 조합이 필요하다.

효소 - 기질 반응과 최종 제품의 형광의 측정 모두 동일한 마이크로 플레이트에서 발생하기 때문에 물 샘플에서 세포 외 효소 활성 분석법 건조 시간에 대한 필요성이나 원심 분리 단계, 후자도 없다. 예,이 같은ssays은 일반적으로 빠르게하고 처음 실행 쉽게 나타날 수 있습니다. 그러나, 그들은 가능​​한 한 MUB 표준 및 MUB 연결된 기판 빛에 노출되지 않아야한다는 점에서 자신의 제한이 있습니다. 우리의 경험에서, 피펫 팅하는 동안 많은 가능한 조명을 흐리게 어두운 (또는 불투명 한 뚜껑으로 덮여)에서 마이크로 플레이트를 배양하는 것은 필요합니다. 이러한 분석은 또한 여러 시점에서 판독 될 플레이트를 필요로하기 때문에 동시에 여러 효소 시금 때, 이것은 종종 판 사이의 매우 빠른 전환의 필요성을 초래. 예를 들어, 동시에 (즉, 여섯 가지 마이크로 플레이트를 사용) 여섯 효소의 활성에 대한 구 물 샘플을 검정 위해서는, 각각의 플레이트가 모든 열을 판독되도록하기 위해 접시 1 시간 동안 매 2 분을 판독 할 필요하게 -15 분 (이 경우, 매 12 분). 용품은 판독되는 특정 플레이트 추적 할뿐만 아니라, 어떠한 액체가 유출 된 아프로되지 않도록주의해야한다이과의 밖으로 마이크로 플레이트 형광 분석기로 전송로 판을 해요. 한번에 여러 효소 시금 때 염두에 마이크로 플레이트 리더 실제로 플레이트를 판독하고 그에 따라 간격을 읽고 엇갈리게 데 걸리는 시간을 유지하는 것도 중요하다. 혼탁 있습니다 샘플 작업을 할 때 물 샘플에서 세포 외 효소 활성의 형광 분석과 최종 관심사입니다. 부유 입자를 포함하는 물 시료는 처음 피펫 저수지에 따르기 전에 흔들어 전에 마이크로에로드에 피펫으로 회수 및 배출 다시 혼합해야한다. 시료 입자의 높은 숫자는 일반적 형광 신호의 큰 담금질 결과, 각 시료에 대한 급랭 컨트롤의 중요성은 충분히 강조 할 수 없다.

MUB-및 P NP-연결된 기판은 일반적으로 환경 효소, K의 M 값에 대한 유사한 V의 최대 값을 표시하면서다를 수 있으며, 이러한 β-글루코시다 제 및 포스 파타 아제와 같은 효소는 P는 NP-연결된 아날로그 14보다 MUB 링크 된 기판에 대한 높은 친 화성을 ​​가질 수있다. 따라서 MUB 링크 된 기판들은 토양과 퇴적물에서 효소 활성을 측정 할 때 사용하는 것이 더 나은 선택이 될 것이라고 제안 P는 NP에 연결된 것보다 더 민감 할 가능성이있다. 그러나 MUB 분석하는 동안 측정되는 형광 최종 제품은 약간의 토양 추출물의 잠재적 인 냉각 될 수 있으며 형광 판독 시간 (12) 상에 불안정 할 수 있습니다. 토양 및 퇴적물은 자연의 물보다 더 높은 세포 외 효소 활성을 갖는 경향이 있으므로 형광 MUB 연계 분석의 감도를 증가 특정 토양을 분석 할 때 냉각과 함께 잠재적 인 문제에 주어진 비색 P는 NP 방법에 약간의 이점을 제공 할 수 있습니다. 보조 노트, P는 NP-연결된 기판과 p 순이익 기준으로 자체는 일반적으로 더 afforda 있습니다자신의 MUB 대응보다 적합한 용;으로 사용하기위한 추가 이유를 예산 감금이 적용되는 경우.

아마도 수생 지상파 환경에서 미생물의 세포 외 효소 활성을 검정 할 수있는의 가장 중요한 측면은 이들 기술이 미생물 생리적 과정을 측정하는 동안, 이러한 프로세스는 탄소 및 영양소의 에코 레벨 변환에 직접적인 영향을 가지고있다. 효소 활성의 빠른 측정이 잠재적으로 환경 시료에서 현장의 분해 속도의 순간의 결정을 용이하게하므로 유기 물질의 분해 속도는 직접, 퇴적물 (18, 19)에있는 세포 셀룰라아제의 활동에 연결되어있다. 높은 처리량 마이크로 접근법을 사용하는 것은 전형적인 단일 관 방식보다 샘플의 더 많은 수의 효소 활성의 동시 측정이 가능, 효소 활성의 그 편차가 너무 (및 에코 레벨 프로세스의 확장에 의해) RESP 소재같은 깊이 20 또는 환경 교란 9,21과 같은 요인에 온세을 조사 할 수 있습니다. 마찬가지로, 인산 및 나가세 등의 영양 순환에 관여하는 효소의 분석은 토양 개발 8시 유기 질소로, 예를 들어, 특정 환경에서 유기 인의 상대적 중요성을 양분 제한에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

효소의 활동이 30 년에 환경 시료에서 측정 되었기 때문에, 고급 메타 분석을 이용하여 연구 사이의 비교가 가능해되고있다. 이러한 연구는 유기물 분해 및 영양 광물의 글로벌 규모, 효소 활성, 따라서 속도, 산도, 기판의 가용성 및 영양 화학 양론 (17)에 연결되어,하는 것이 좋습니다. 동시에, 마이크로 기반 프로토콜의 사용은 지형 ​​통계 매핑 기법 (22)을 사용하여 효소 활성의 미세한 치수의 패턴의 분석을 허용하기 시작했다

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Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgments

이 작품의 측면에 대한 자금 조달은 미국 농무부 구체적인 협력 계약 58-6408-1-595과 국립 과학 재단 (상 1049911)를 포함하여 다양한 소스에 의해 제공되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS AND MATERIALS
Glacial acetic acid Various suppliers
Sodium acetate Various suppliers
Sodium hydroxide Various suppliers
p-Nitrophenol Fisher BP612-1 Alternates available
p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate Sigma N3234 pNP-substrate
pNP-β-glucopyranoside Sigma N7006 pNP-substrate
pNP-β-N-acetylglucosaminide Sigma N9376 pNP-substrate
Clear 96-well microplates Fisher 12-563-301 Alternates available
96-well deep well blocks Costar 3958 Alternates available
Aluminum weigh pans Various suppliers
Sterile 15 ml centrifuge tubes Various suppliers
Sterile 50 ml centrifuge tubes Various suppliers
4-Methylumbelliferone Sigma M1381
4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate Sigma M8883 MUB-substrate
4-MUB-glucopyranoside Sigma M3633 MUB-substrate
4-MUB-N-acetylglucosaminide Sigma M2133 MUB-substrate
Sodium bicarbonate Various suppliers
Black 96-well microplate Costar 3792
Pipette reservoir Various suppliers
EQUIPMENT
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge rotor Eppendorf A-4-81 For microplates/deep-well blocks
Microplate reader BioTek Synergy HT Alternates available
Microplate fluorometer BioTek FLx 800 Alternates available
8-channel pipettor Various suppliers

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References

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