उच्च Throughput Microplate assays का उपयोग जल, मिट्टी, और तलछट में माइक्रोबियल कोशिकी एंजाइम गतिविधि का निर्धारण

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Summary

Microplate आधारित प्रक्रियाओं बाह्य एंजाइम गतिविधि का वर्णमिति या fluorometric विश्लेषण के लिए वर्णित हैं. इन प्रक्रियाओं एक प्रबंधनीय समय सीमा के भीतर पर्यावरण के नमूनों की बड़ी संख्या में इस तरह की गतिविधि की तीव्र परख के लिए अनुमति देते हैं.

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Jackson, C. R., Tyler, H. L., Millar, J. J. Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays. J. Vis. Exp. (80), e50399, doi:10.3791/50399 (2013).

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Abstract

प्राकृतिक वातावरण में पोषक तत्व सायकलिंग और कार्बन प्रसंस्करण की ज्यादातर सूक्ष्मजीवों द्वारा जारी कोशिकी एंजाइमों की गतिविधि के माध्यम से होता है. इस प्रकार, इन बाह्य एंजाइमों की गतिविधि की माप ऐसे कार्बनिक पदार्थ के अपघटन या नाइट्रोजन और फास्फोरस खनिज के रूप में पारिस्थितिकी तंत्र स्तर प्रक्रियाओं, की दरों में अंतर्दृष्टि दे सकते हैं. पर्यावरण के नमूने में बाह्य एंजाइम की गतिविधि assays आमतौर पर कृत्रिम वर्णमिति या fluorometric substrates के लिए नमूनों को प्रकाश में लाने और सब्सट्रेट hydrolysis की दर पर नज़र रखने शामिल है. यहाँ हम एक छोटी समय सीमा के भीतर नमूनों की बड़ी संख्या के विश्लेषण की अनुमति है कि इन प्रक्रियाओं के लिए microplate आधारित विधियों का वर्णन. नमूने microplate ब्लॉक microplates या गहरे कुएं 96 अच्छी तरह से भीतर कृत्रिम substrates के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति दी जाती है, और एंजाइम गतिविधि बाद एक ठेठ microplate Reade का उपयोग परिणामस्वरूप अंत उत्पाद का अवशोषण या प्रतिदीप्ति द्वारा निर्धारित किया जाता हैआर या fluorometer. इस तरह के उच्च throughput प्रक्रियाओं स्थानिक अलग साइटों या पारिस्थितिकी प्रणालियों के बीच तुलना की सुविधा है, लेकिन यह भी काफी नमूना प्रति जरूरत समग्र अभिकर्मक संस्करणों को कम करने से इस तरह के assays की लागत को कम करने के लिए न केवल.

Introduction

इस तरह के बैक्टीरिया और कवक के रूप में सूक्ष्मजीवों कोशिकी एंजाइमों के उत्पादन के माध्यम से जटिल कार्बनिक यौगिकों से पोषक तत्वों और कार्बन प्राप्त करते हैं. इन एंजाइमों आमतौर पर सेल में रखा जा सकता है कि छोटे यूनिटों में पॉलिमर hydrolyze. इसलिए, एक पारिस्थितिकी स्तर पर, इन माइक्रोबियल कोशिकी एंजाइमों पोषक खनिज और प्राकृतिक वातावरण में होता है कि कार्बनिक पदार्थ के अपघटन के अधिक के लिए जिम्मेदार हैं. ऐसे cellobiohydrolase (CBH) और β-ग्लुकोसिडेस के रूप में एंजाइमों माइक्रोबियल तेज और आत्मसात के लिए एक इस्तेमाल कार्बन सब्सट्रेट प्रदान करता है जो 1,2 ग्लूकोज में सेल्यूलोज की hydrolysis, उत्प्रेरित करने के लिए एक सुर में सेलूलोज गिरावट और काम के लिए महत्वपूर्ण हैं. एंजाइम फॉस्फेट organophosphates से घुलनशील अकार्बनिक फॉस्फेट समूहों, अनिवार्य रूप से फॉस्फेट mineralizing और सबसे जीवों 3 द्वारा उपयोग के लिए उपलब्ध बनाने विज्ञप्ति. जैसे एन acetylglucosaminidase (Nagase) के रूप में अन्य एंजाइमों, importan हैंकाइटिन गिरावट में टी और कार्बन और सूक्ष्म अधिग्रहण 4 के लिए उपलब्ध नाइट्रोजन दोनों कर सकते हैं.

प्राकृतिक वातावरण में माइक्रोबियल बाह्य एंजाइम गतिविधि की परख के लिए प्रक्रियाओं की एक कृत्रिम पी nitrophenyl (पी एन पी) जुड़ा हुआ substrates, मूल रूप से मिट्टी फॉस्फेट गतिविधि 5 पता लगाने के लिए विकसित किया गया था कि एक दृष्टिकोण का इस्तेमाल होता है. यह दृष्टिकोण कृत्रिम सब्सट्रेट उचित एंजाइम द्वारा hydrolyzed है जब जारी किया गया है जो एक रंग का अंत उत्पाद, पी nitrophenol, का पता लगाने पर निर्भर करता है. पी nitrophenol बाद में चारों ओर 400-410 एनएम पर अपनी absorbance को मापने के द्वारा colorimetrically मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. इस विधि के बाद से इस तरह के Nagase के रूप में 6 अन्य एंजाइमों का पता लगाने के लिए लागू किया गया है, और मिट्टी और अवसादों 7-9 में माइक्रोबियल बाह्य एंजाइम की गतिविधि को देख विभिन्न अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है.

Originall था कि एक वैकल्पिक दृष्टिकोणY 10,11 4-methylumbelliferone (MUB) जुड़ा हुआ substrates का उपयोग करता है जलीय वातावरण में बाह्य ग्लुकोसिडेस गतिविधि का आकलन करने के लिए विकसित की है. (4 methylumbelliferone) जारी अंत उत्पाद अत्यधिक फ्लोरोसेंट है और 360/460 एनएम के आसपास एक उत्तेजना / उत्सर्जन की स्थापना के साथ एक fluorometer का उपयोग कर पाया जा सकता है. MUB से जुड़े कृत्रिम substrates के एक किस्म पी एनपी सब्सट्रेट वर्णमिति प्रक्रिया का उपयोग assayed किया जा सकता है के रूप में कम से कम के रूप में कई एंजाइमों (जैसे β-ग्लुकोसिडेस, cellobiohydrolase, Nagase, फॉस्फेट) की गतिविधि की fluorometric माप की अनुमति उपलब्ध हैं. ऐसे प्रोटीन अपमानजनक leucine Aminopeptidase के रूप में अन्य सूक्ष्म बाह्य एंजाइमों, 7 अमीनो-4-methylcoumarin (COU) जुड़ा हुआ substrates का उपयोग fluorometrically assayed किया जा सकता है. MUB और COU से जुड़े substrates दोनों विभिन्न स्थलीय और जलीय नमूने 12,13 में एंजाइम गतिविधि का निर्धारण किया गया है.

पिछले अध्ययनों descr है जबकिibed fluorometric या वर्णमिति microplate बाह्य एंजाइम गतिविधि 14 निर्धारित करने के लिए दृष्टिकोण, ऐसे assays का संचालन करने के लिए एक स्पष्ट प्रस्तुति के लिए एक की जरूरत है. यहाँ हम वर्णमिति पी एनपी से जुड़े substrates के दृष्टिकोण का उपयोग कर मिट्टी और अवसादों में और फ्लोरोसेंट MUB से जुड़े substrates तकनीक का उपयोग कर प्राकृतिक जल में बाह्य एंजाइम गतिविधि के विश्लेषण के लिए उच्च throughput microplate तकनीक के संचालन के लिए प्रक्रियाओं का प्रदर्शन. इन एंजाइमों क्रमशः, कार्बन, नाइट्रोजन, फास्फोरस और साइकिल के लिए बांधा जा सकता है के रूप में हम β-ग्लुकोसिडेस, Nagase, और फॉस्फेट की गतिविधियों की माप पर ध्यान केंद्रित. हालांकि, यहां वर्णित प्रक्रियाओं अलग कृत्रिम substrates का उपयोग अन्य बाह्य एंजाइमों की माप के लिए लागू किया जा सकता है.

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Protocol

मिट्टी और अवसादों में बाह्य एंजाइम गतिविधि का वर्णमिति विश्लेषण

1. एंजाइम गतिविधि का वर्णमिति विश्लेषण के लिए सब्सट्रेट और बफर समाधान की तैयारी

  1. 50 मिलीलीटर 0.1 एम एसिटिक एसिड (2.87 मिलीलीटर 500 मिलीलीटर पानी में हिमनदों एसिटिक एसिड) के मिश्रण से 50 मिमी एसीटेट बफर (पीएच 5.0-5.5) तैयार, 150 मिलीलीटर 0.1 एम सोडियम एसीटेट, और 200 मिलीलीटर आसुत एच 2 ओ यदि आवश्यक हो तो 0.1 एम एसिटिक एसिड के साथ 5.0-5.5 पीएच को समायोजित करें.
  2. आसुत एच 2 ओ में 1 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) के एक समाधान तैयार
  3. 50 मिमी एसीटेट बफर में पी एनपी से जुड़े सब्सट्रेट समाधान तैयार करें. फॉस्फेट 50 मिमी एसीटेट बफर में 5 मिमी पी एनपी फॉस्फेट तैयार परख के लिए, β-ग्लुकोसिडेस 5 मिमी पी एनपी β-glucopyranoside तैयार परख; Nagase 2 मिमी PNP-β-N-acetylglucosaminide तैयार परख करने के लिए. बाँझ 15 मिलीलीटर या 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में सभी सब्सट्रेट समाधान तैयार करें. समाधान 2-3 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.

2. पी एन पी एकाग्रता के लिए Absorbance बदलने के लिए एक मानक का निर्धारण

  1. 50 मिमी एसीटेट बफर में पी nitrophenol के मानक समाधान तैयार करें. सांद्रता मिमी .025-1 सीमा होनी चाहिए.
  2. एक स्पष्ट 96 अच्छी तरह से microplate पर स्थानांतरण प्रत्येक एकाग्रता के 100 μl के तीन replicates. प्रत्येक अच्छी तरह से एच 2 ओ आसुत 10 μl 1 एम NaOH और 190 μl जोड़ें.
  3. एक microplate रीडर का उपयोग कर 410 एनएम पर रिकॉर्ड absorbance.
  4. 0.3 से मानक वक्र में बढ़ सांद्रता 300 μl प्रतिक्रिया मात्रा प्रति μmoles पी एन पी पाने के लिए. पी एन पी के μmole बनाम absorbance के एक वक्र प्लॉट. वक्र की ढलान प्रत्येक एंजाइम की प्रतिक्रिया में पी एन पी के μmole को absorbance संबंधित होगा कि रूपांतरण कारक (सी) के रूप में कार्य करता है.

3. एंजाइम परख का आयोजन

  1. मिट्टी के लिए, एक concentr में एक बाँझ 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में assayed हो प्रत्येक नमूने की एक घोल तैयारलगभग 1 ग्राम / मिलीलीटर -1 50 मिमी एसीटेट बफर का उपयोग करने का व्यावहारिक. अवसादों के लिए, गारा आसानी pipettable बनाने के लिए पर्याप्त एसीटेट बफर जोड़ें. जरूरत घोल की सही मात्रा assayed एंजाइमों की संख्या के हिसाब से अलग अलग होंगे, लेकिन 5 मिलीलीटर की एक न्यूनतम सिफारिश की है. भंवर मिट्टी या तलछट के सभी clumps फैलाया और अंतिम मात्रा ध्यान दें जब तक प्रत्येक घोल.
  2. पुन: भंवर प्रत्येक घोल और तुरंत एक 96 अच्छी तरह से deepwell ब्लॉक (चित्रा 1) पर छह कुओं में से प्रत्येक में 150 μl विंदुक. यह निलंबन में मिट्टी के कणों रखने के लिए अच्छी तरह से और अक्सर भंवर करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक सब्सट्रेट नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए खाली ब्लॉक के अनुसार कम से कम दो कुओं छोड़ दें. नोट: मिट्टी slurries सुझावों रोकना करते हैं के रूप में पूर्व pipetting को कैंची से पिपेट सुझावों के अंत क्लिप. Assayed हो प्रत्येक एंजाइम के लिए एक 96 अच्छी तरह से ब्लॉक तैयार करें.
  3. एक पिपेट जलाशय में एसीटेट बफर के लगभग 5 एमएल डालो और एल के लिए बफर के 150 μl जोड़ने के लिए एक 8 चैनल pipettor का उपयोगAST प्रत्येक नमूने की दो कुओं (इन नमूना बफर नियंत्रण हो जाएगा) और दो ​​सब्सट्रेट नियंत्रण कुओं (चित्रा 1)
  4. एक पिपेट जलाशय में उचित पी एनपी सब्सट्रेट समाधान के लगभग 10 मिलीलीटर डालो और चित्रा (1) प्रत्येक नमूने के पहले चार कुओं और दो ​​सब्सट्रेट नियंत्रण वेल्स को सब्सट्रेट समाधान के 150 μl जोड़ने के लिए एक 8 चैनल pipettor का उपयोग करें. प्रतिक्रिया के रूप में जल्द ही सब्सट्रेट समाधान जोड़ा जाता है के रूप में शुरू होता है के रूप में समय ध्यान दें.
  5. 0.5-4 घंटे के लिए आरटी (22 डिग्री सेल्सियस) पर प्लेटें सेते हैं. सटीक ऊष्मायन समय गतिविधि नमूनों में स्तर और assayed हो एंजाइम के आधार पर अलग अलग होंगे. Nagase और अन्य एंजाइमों> 2 घंटा की ऊष्मायन समय की आवश्यकता होती है, जबकि अधिकांश मिट्टी और अवसादों के लिए, फॉस्फेट और β-ग्लुकोसिडेस, 0.5-1.5 घंटे की ऊष्मायन बार की आवश्यकता है.
  6. Assays absorbance के पढ़ने के लिए microplates स्पष्ट 96 अच्छी तरह से तैयार incubating रहे हैं. (यानी प्रत्येक ई के लिए प्रत्येक deepwell ब्लॉक के लिए एक microplate तैयार करेंnzyme) assayed. पिपेट 10 μl 1 एम NaOH और microplate के प्रत्येक कुएं में आसुत जल के 190 μl. नोट: NaOH enzymatic प्रतिक्रिया धीमा कर देती है और प्रतिक्रिया के दौरान जारी पी एन पी के रंग को बढ़ाता है जो पीएच उठाती है.
  7. ऊष्मायन के बाद, मिट्टी के कणों गोली 5 मिनट के लिए 2,000-5,000 XG पर 96 अच्छी तरह से ब्लॉक अपकेंद्रित्र.
  8. गोली से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है, हर अच्छी तरह से 100 μl वापस लेने के लिए एक multichannel विंदुक का प्रयोग करें, और तैयार स्पष्ट 96 अच्छी तरह से microplate पर अच्छी तरह से संगत को हस्तांतरण.
  9. Microplate रीडर को चालू करें और किसी भी आवश्यक सॉफ्टवेयर की स्थापना की. 410 एनएम पर रिकॉर्ड absorbance. एक विशेष अच्छी तरह के absorbance, प्लेट रीडर के रैखिक पता लगाने सीमा से ऊपर है पानी और फिर से मापने के साथ कि अच्छी तरह से 1:01 पतला है. Absorbance अभी भी बहुत अधिक है, परख एक छोटी ऊष्मायन समय के साथ दोहराया जाना चाहिए.

4. नमूने की सूखी मास का निर्धारण

  1. प्रत्येक कॉम्पैक्ट की पिपेट 1 मिलीलीटर एक preweighed एल्यूमीनियम पैन में ई घोल.
  2. 48 घंटे के लिए एक 75 डिग्री सेल्सियस सुखाने ओवन में सूखी और वजन. घोल का 1 मिलीलीटर में मिट्टी या तलछट की सूखी जन प्राप्त करने के लिए इस मान से पैन का वजन घटाना. एंजाइम परख में अच्छी तरह से प्रत्येक में जोड़ा 150 μl में नमूने के शुष्क जन निर्धारित करने के लिए 0.15 का एक पहलू से गुणा करें.

5. सूखी मिट्टी का मास या तलछट प्रति एंजाइम गतिविधि की गणना

  1. नमूना परख absorbance से नमूना नियंत्रण absorbance घटाकर प्रत्येक नमूने की अंतिम absorbance की गणना. सब्सट्रेट नियंत्रण उच्च absorbance है (मोटे तौर पर> 0.060) तब भी उन घटाना.
  2. Μmoles घंटा -1 जी शुष्क जन -1 समीकरण से एंजाइम गतिविधि की गणना:

एंजाइम गतिविधि = अंतिम absorbance / (एक्स सी ऊष्मायन समय एक्स नमूना शुष्क जन)

प्राकृतिक जल में बाह्य एंजाइम गतिविधि का फ्लोरोसेंट विश्लेषण

एंजाइम गतिविधि का fluorometric विश्लेषण के लिए TLE "> 1. सब्सट्रेट, मानक तैयार करना, और बफर समाधान

  1. बाँझ में उपयुक्त सब्सट्रेट भंग करके MUB से जुड़े substrates (जैसे 4-MUB-β-glucopyranoside, 4 MUB फॉस्फेट, 4 MUB-N-acetyl-β-D-glucosaminide) के 200 माइक्रोन समाधान तैयार (autoclaved) आसुत बाँझ 15 मिलीलीटर या 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में एच 2 हे. प्रकाश बाहर और उपयोग करने से पहले फ्रिज में स्टोर करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में ट्यूब लपेटें. इस तरह से संग्रहीत अगर Substrates कम से कम 1 सप्ताह के लिए स्थिर होना चाहिए.
  2. बाँझ आसुत एच 2 ओ में 100 माइक्रोन 4-methylumbelliferone के एक शेयर समाधान बनाकर एक MUB मानक तैयार करें स्टोर एम्बर या पन्नी लिपटे बोतल में प्रशीतित. उपयोग करने के लिए तुरंत पहले, एंजाइम assays के लिए 10 माइक्रोन का एक काम समाधान बनाने के लिए बाँझ एच 2 ओ में 1/10 से 100 माइक्रोन स्टॉक समाधान जलमिश्रित.
  3. NaHCO <की 8.4 ग्राम भंग द्वारा 100 मिमी बाइकार्बोनेट बफर के एक शेयर समाधान तैयारउप> 3 1 एलएच 2 हे और वाष्पदावी में. एंजाइम assays के लिए 5 मिमी की एक काम कर समाधान कराने के लिए जरूरत के रूप में बाँझ एच 2 ओ में इस शेयर समाधान 1/20 पतला.

2. एक 96 अच्छी तरह से काले Microplate पर आयोजन पानी के नमूने

  1. चित्रा 2 में दिखाया उदाहरण निम्न प्रत्येक एंजाइम के लिए एक microplate व्यवस्थित करें. पर्याप्त प्रतिकृति, मानकों, और नियंत्रण के लिए अनुमति देता है, यह प्रक्रिया एक 96 अच्छी तरह से काला microplate पर नौ पानी के नमूनों के लिए एक एंजाइम की गतिविधि परख सकते हैं नोट.
  2. एक पिपेट जलाशय में पहला नमूना के लगभग 5 एमएल डालो और microplate (एस) के स्तंभ 1 में कुओं की सभी में μl pipette200 एक 8 चैनल pipettor का उपयोग करें. खेतों में पिपेट सुझावों त्यागें और स्तंभों 1-9 भरने के लिए प्रत्येक पानी के नमूने लिए आवश्यक के रूप में दोहराएँ.

3. नमूना स्थापना, मानक, बुझाना, और सब्सट्रेट नियंत्रण

  1. मानक के नमूने, के लिए खाते में नियंत्रण स्थापितएस, सब्सट्रेट और नमूने के रूप में ही काला microplate (चित्रा 2) पर शमन.
  2. नमूना नियंत्रण नमूना पानी और बाइकार्बोनेट बफर होते हैं, और गतिविधि गणना में इस्तेमाल नहीं कर रहे, लेकिन प्रयोग के दौरान पूरे स्थिरता पढ़ने का प्रदर्शन करेंगे. बुझाना नियंत्रण नमूना पानी और फ्लोरोसेंट टैग का एक मानक राशि से मिलकर और नमूना पानी में प्रतिदीप्ति के विवर्तन को मापने के लिए किया जाता है. सब्सट्रेट और मानक नियंत्रण सब्सट्रेट से जुड़े या मानक फ्लोरोसेंट टैग, क्रमशः, और बाइकार्बोनेट या तो बफर के बने होते हैं.
  3. एक साफ पिपेट जलाशय में 5 मिमी बाइकार्बोनेट बफर के लगभग 5 एमएल डालो. पिपेट microplate कुओं में बफर के 50 μl 1 पंक्तियों में 9 के माध्यम से डी और ई दो नमूना प्रति नमूना नियंत्रण के कुओं को दोहराने के लिए फार्म. बदले विंदुक युक्तियाँ तो पंक्तियों में 10 से 12 तक के वेल्स को बिकारबोनिट बफर के 200 μl हस्तांतरण एक और एच.
  4. ली dimming या बंद करके परिवेश प्रकाश व्यवस्था में कमीफ्लोरोसेंट मानक के रूप में ghts प्रकाश के प्रति संवेदनशील है.
  5. एक साफ पिपेट जलाशय में 10 माइक्रोन 4-methylumbelliferone के लगभग 5 एमएल डालो. पिपेट microplate कुओं में 50 μl पंक्ति में एच 12 के माध्यम से 1, और कुओं में पंक्तियाँ जी और एफ में 9 के माध्यम से 1 नमूना प्रति बुझाना नियंत्रण और समग्र मानक नियंत्रण के तीन प्रतिकृति बनाने के लिए. अंधेरे में microplate जगह या MUB की रोशनी गिरावट को कम करने के लिए एक अपारदर्शी ढक्कन के साथ कवर या तो.
  6. Fluorometer पर मुड़ें और सेट अप सब्सट्रेट जोड़ने से पहले पढ़ने के लिए तैयार होने के लिए किसी भी आवश्यक सॉफ्टवेयर. नोट: कुछ fluorometer बल्ब 3 मिनट या अधिक की एक वार्म अप समय की आवश्यकता हो सकती है.
  7. एक साफ पिपेट जलाशय में उपयुक्त MUB से जुड़े सब्सट्रेट (जैसे 4-MUB फॉस्फेट) के लगभग 5 एमएल डालो. प्रत्येक नमूने के लिए तीन दोहराने assays और तीन सब्सट्रेट नियंत्रण के लिए फार्म 1 पंक्तियाँ बी और सी में 9 के माध्यम से 1 पंक्ति किसी में 12 के माध्यम से microplate कुओं में 50 μl पिपेट, और कुओं में करने के लिए एक 12 चैनल pipettor का प्रयोग करें. ImmediatelY 4.1, रिकॉर्डिंग प्रतिदीप्ति कदम आगे बढ़ना.

4. रिकॉर्डिंग प्रतिदीप्ति

  1. तुरंत microplate सब्सट्रेट इसके बाद प्रारंभिक प्रतिदीप्ति पढ़ें. प्रतिदीप्ति पढ़ने के बाद, में या तो आर टी (22 डिग्री सेल्सियस) पर microplate सेते अंधेरे या MUB की रोशनी गिरावट को कम करने के लिए एक अपारदर्शी ढक्कन के साथ कवर किया.
  2. एक पानी के नमूने में अधिकतम संभावित एंजाइम की गतिविधि को मापने के लिए आवश्यक ऊष्मायन समय नमूना भीतर एंजाइम एकाग्रता पर निर्भर करेगा. परख पूर्ण होने से पहले इस अज्ञात है, microplate कई बार कदम पर पढ़ा जा करना होगा. कुछ एंजाइमों के लिए बहुत उच्च गतिविधि के साथ नमूनों 10 मिनट पहले अधिक हो सकता है, हालांकि आमतौर पर, 1 घंटा के पाठ्यक्रम पर 10-15 मिनट के अंतराल पर पढ़ने, कई एंजाइमों के लिए स्वीकार्य है.
  3. कम से कम 1 घंटे के लिए अपने निर्दिष्ट अंतराल पर microplate में प्रतिदीप्ति पढ़ना जारी रखें. Microplate कवर रखने के लिए यकीन है कि या पढ़ने के बीच अंधेरे में रहोएस.

5. पानी की मात्रा प्रति एंजाइम गतिविधि की गणना

  1. प्रारंभिक नमूना प्रतिदीप्ति (कुओं डी और ई) मतलब है, मतलब अंतिम नमूना प्रतिदीप्ति (कुओं एसी), मतलब मानक प्रतिदीप्ति (कुओं एच 10-11), और मतलब नियंत्रण प्रतिदीप्ति बुझाने (कुओं: प्रत्येक समय अंतराल पर प्रत्येक नमूना के लिए गणना FG).
  2. प्रत्येक समय अंतराल के लिए, nmoles घंटा में एंजाइम गतिविधि गणना -1 मिलीलीटर -1 समीकरण से:

एंजाइम गतिविधि = (नमूना प्रतिदीप्ति मतलब है - प्रारंभिक नमूना प्रतिदीप्ति मतलब) / (() घंटा में समय (एक्स) 0.2 मिलीलीटर (मानक प्रतिदीप्ति) एक्स मतलब / नियंत्रण प्रतिदीप्ति बुझाने के मतलब (मानक प्रतिदीप्ति / 0.5 mol) एक्स मतलब है)

  1. हर बार कदम के लिए गणना की गतिविधि मूल्यों की जाँच करें. उच्चतम गतिविधि के साथ समय कदम से अंतिम संभावित गतिविधि का निर्धारण. गतिविधि मूल्यों में वृद्धि करने के लिए जारी रखते हैं तो बाद में समय कदम उठाने की आवश्यकता हो सकती है, गतिविधि मूल्यों throug गिरावटHout रन बेशक, तो कम समय के साथ कदम फिर से चलाते हैं. अंतिम गतिविधि सब्सट्रेट भस्म घंटा -1 -1 मिलीलीटर की nmoles में है लेकिन घंटा -1 एल -1 μmoles के रूप में व्यक्त करने के लिए बढ़ाया जा सकता है.

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Representative Results

मिट्टी और जलीय अवसादों आम तौर पर जुड़ी माइक्रोबियल समुदायों (biofilms) कणों की सतह पर बढ़ रही है की एक परिणाम के रूप में बाह्य एंजाइम गतिविधि का सराहनीय स्तर है. इस गतिविधि एक तिहाई की सतह तलछट से प्राप्त कणों के आकार के आधार पर परिवर्तन कैसे 3 से पता चलता है उत्तरी मिसिसिपी, संयुक्त राज्य अमेरिका में आदेश धारा. पिछले एक अध्ययन में इस धारा से तलछट कणों पर बैक्टीरियल समुदायों उनके समुदाय संरचना की आणविक विश्लेषण के आधार पर तीन अलग समूहों में विभाजित किया जा सकता है पता चला है कि: 0.063 मिमी कणों, 0.125 पर उन, 0.25, और 0.5 मिमी कणों पर उन, और उन 1 मिमी पर 15 कण. बाह्य एंजाइम गतिविधि में पैटर्न के विश्लेषण से यह निष्कर्ष का समर्थन करता है, फॉस्फेट (चित्रा 3) के साथ 0.125, 0.25, और 0.5 मिमी कणों पर भी इसी तरह किया जा रहा है लेकिन पी एनपी से जुड़े सब्सट्रेट तकनीक का उपयोग करके मापा जब 1 और 0.063 मिमी भिन्न पर बहुत अधिक. हेऐसे β-ग्लुकोसिडेस (3B चित्रा), और Nagase (चित्रा -3 सी) के रूप में वहाँ एंजाइमों बेहतरीन कणों पर भी इसी चोटियों को दिखाने, लेकिन विभिन्न एंजाइमों विभिन्न पर्यावरण वितरण दिखा सकते हैं और इन किया जा सकता है कि इस तथ्य पर प्रकाश डाला, 1 मिमी कणों पर ऊंचा नहीं कर रहे हैं इस परख का उपयोग कर elucidated. अपेक्षाकृत कम त्रुटि सलाखों के विभिन्न पर्यावरणीय नमूनों की तुलना करते समय अवसादों पर एंजाइम गतिविधि का वर्णमिति assays प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए इस प्रकार के लिए उत्तरदायी होते हैं.

प्राकृतिक जल मिट्टी या अवसादों ग्राम प्रति की तुलना में प्रति मिलीलीटर कम बाह्य एंजाइम गतिविधि हो जाते हैं. जैसे, वे MUB से जुड़े substrates का उपयोग fluorometrically assayed किया जाना चाहिए. एंजाइमों फॉस्फेट (चित्रा -4 ए) की गतिविधि, β-ग्लुकोसिडेस (चित्रा 4 बी), और Nagase (चित्रा 4C) एक उथले झील में गहराई के साथ बदलता रहता है कि कैसे 4 से पता चलता है उत्तरी मिसिसिपी, अमेरिका मेंए झील (boondoggle झील) भी फॉस्फेट (चित्रा -4 ए) के अपेक्षाकृत उच्च गतिविधि द्वारा सुझाव दिया गया है, जो पोषक तत्व गरीब 16, सूक्ष्मजीवों कार्बनिक यौगिकों से फॉस्फेट का अधिग्रहण करने के क्रम में उत्पादन एक एंजाइम है कि माना जाता है. गतिविधि 100 सेमी नमूने में ऊपर उठाया गया था जबकि assayed एंजाइमों तीनों के लिए, पानी की सतह (0 सेमी) और 50 सेमी गहराई पर एकत्र नमूनों, इसी तरह की गतिविधि देखी गई. यह नमूना अनिवार्य रूप से पानी में तलछट इंटरफेस से ली गई है, और नमूने में तलछट कणों की मौजूदगी की संभावना विशेष रूप से β-ग्लुकोसिडेस और Nagase के लिए, इस नमूने में देखा उच्च गतिविधि के लिए खातों की गई थी. पी एन पी substrates के साथ के रूप में, कम त्रुटि पट्टियाँ भी सिर्फ तीन दोहराने रीडिंग के साथ, MUB substrates का उपयोग fluorometric assays के reproducibility उच्च पता चलता है कि.

चित्रा 4 के लिए इकाइयों चित्रा 3 के लिए उन जबकि खपत सब्सट्रेट के nmoles में हैं कि नोटप्रति यूनिट आकार (प्रति मिलीलीटर या ग्राम प्रति या तो) के लिए तुलनीय है, भले ही भस्म सब्सट्रेट के μmoles में हैं. यह मिट्टी और अवसादों प्राकृतिक जल बहुत अधिक से अधिक बाह्य गतिविधि (चित्रा 3 में प्रत्येक विशिष्ट एंजाइम की गतिविधियों लगभग 4 चित्र में बराबर एंजाइम की गतिविधियों की तुलना में 10 100x ज्यादा हैं) हो जाते हैं तथ्य यह है कि प्रकाश डाला गया. यह भी MUB से जुड़े सब्सट्रेट तकनीक, और पानी के नमूनों में बाह्य एंजाइम गतिविधि परख के लिए इस तकनीक का उपयोग करने की आवश्यकता की वृद्धि की संवेदनशीलता को दर्शाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. वर्णमिति पी एनपी से जुड़े है का उपयोग कर मिट्टी या अवसादों में बाह्य एंजाइम गतिविधि की परख के लिए 96 अच्छी तरह से अच्छी तरह से गहरी ब्लॉकों का सुझाव लेआउटubstrate तकनीक. हर अच्छी तरह से यह एक नमूना रन, नमूना नियंत्रण, या सब्सट्रेट नियंत्रण है कि क्या आधार पर नमूना घोल, सब्सट्रेट समाधान, या एसीटेट बफर से बना 300 μl की कुल प्राप्त करना चाहिए.

चित्रा 2
चित्रा 2. Fluorometric MUB से जुड़े सब्सट्रेट तकनीक का उपयोग पानी के नमूनों में बाह्य एंजाइम गतिविधि की परख के लिए microplates 96 अच्छी तरह से काले रंग का सुझाव लेआउट. नौ नमूने प्लेट (ए) आठ कुओं कब्जे में प्रत्येक पर खड़ी व्यवस्था की जा सकती है. इन आठ कुओं नमूना रन, नमूना नियंत्रण के लिए प्रयोग किया जाता है, और शेष कुओं सब्सट्रेट नियंत्रण और MUB मानकों (बी) के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि नियंत्रण बुझाने कर रहे हैं.

चित्रा 3 चित्रा 3. उत्तर मिसिसिपी, संयुक्त राज्य अमेरिका में एक छोटी सी स्ट्रीम से एकत्र सतह तलछट कणों के विभिन्न आकारों पर कोशिकी एंजाइम गतिविधि. प्रत्येक कण आकार अंश फॉस्फेट (ए), β-ग्लुकोसिडेस (बी) की गतिविधि के लिए assayed, और Nagase (सी) का पालन किया गया पी एन पी सब्सट्रेट वर्णमिति प्रक्रिया. गतिविधि तलछट -1 की μmoles सब्सट्रेट भस्म घंटा -1 जी शुष्क जन में सूचना दी और कण आकार अंश प्रति तीन दोहराने रीडिंग का मतलब (+ एसई) है.

चित्रा 4
चित्रा 4. तीन अलग में लिया पानी में बाह्य एंजाइम गतिविधिअलग गहराई (0, 50, और 100 सेमी) उत्तरी मिसिसिपी में एक उथले झील से, संयुक्त राज्य अमेरिका. जल फॉस्फेट (ए), β-ग्लुकोसिडेस (बी) की गतिविधि के लिए assayed, और Nagase (सी) MUB सब्सट्रेट पीछा कर रहा था fluorometric प्रक्रिया. गतिविधि पानी -1 की nmoles सब्सट्रेट भस्म घंटे -1 मिलीलीटर में सूचना दी और नमूना प्रति तीन दोहराने रीडिंग का मतलब (+ एसई) है.

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Discussion

मिट्टी और तलछट में माइक्रोबियल कोशिकी एंजाइमों की एक किस्म की गतिविधि निर्धारण पोषक खनिज और कार्बनिक पदार्थ प्रसंस्करण 17 की दरों में उपयोगी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. हालांकि, मिट्टी उनके नमी के स्तर में भिन्न हो सकते हैं, तो यह मिट्टी सूखी वजन करने के लिए गतिविधि मानकीकृत करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह बस एंजाइम की गतिविधि को मापने के परे (आमतौर पर दो दिनों के) एक अतिरिक्त सुखाने कदम की आवश्यकता है. इस प्रकार, तात्कालिक परिणामों के निकट प्रदान कि पानी के नमूनों में एंजाइम की गतिविधि assays के विपरीत, मिट्टी और अवसादों में एंजाइम गतिविधि का विश्वसनीय assays में कुछ दिन लग. कुछ मिट्टी के लिए, यह भी सूखने प्रक्रिया से परे एक अतिरिक्त ashing कदम (500 डिग्री सेल्सियस पर आम तौर पर 2 घंटा) की आवश्यकता होती है, कार्बनिक पदार्थ या राख मुक्त शुष्क जन के प्रति ग्राम गतिविधि व्यक्त करने के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है. भले ही, मिट्टी या तलछट एंजाइम गतिविधि का वर्णमिति परख में सबसे महत्वपूर्ण कदम गहरे अच्छी तरह से ब्लॉक एफ से सतह पर तैरनेवाला की वापसी हैऊष्मायन अवधि के अंत में centrifugation ollowing. इस प्रक्रिया absorbance को मापने पर निर्भर करता है, क्योंकि अंतिम microplate में कुछ आवारा मिट्टी के कणों की भी उपस्थिति नकली परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. हायर centrifugation गति (> 5,000 XG) इस समस्या को कम करने में मदद, लेकिन microplates स्वीकार करते हैं कि हमारे अनुभव अपकेंद्रित्र रोटार में आम तौर पर इस सीमा से नीचे घूर्णी सीमा है, और ब्लॉकों खुद को बहुत अधिक गति बर्दाश्त नहीं कर सकते हो सकता है. अनिवार्य रूप से, इस विशेष pipetting कदम जल्दी microplate को गहरे अच्छी तरह से ब्लॉक से सतह पर तैरनेवाला के लिए आवश्यक राशि हस्तांतरण करने के लिए एक मल्टी चैनल pipettor उपयोग करने के लिए देखभाल और गति का एक संयोजन की आवश्यकता है.

एंजाइम सब्सट्रेट प्रतिक्रिया और अंत उत्पाद की प्रतिदीप्ति की माप दोनों एक ही microplate में होते हैं, क्योंकि पानी के नमूनों में बाह्य एंजाइम गतिविधि assays की एक सुखाने की अवधि के लिए की जरूरत है और न ही centrifugation कदम, बाद न तो है. इस तरह, इन एक जैसाssays आम तौर पर तेजी से कर रहे हैं और शुरू में चलाने के लिए आसान दिखाई दे सकते हैं. हालांकि, वे जब भी संभव हो, MUB मानक और MUB से जुड़े substrates के प्रकाश के संपर्क में नहीं होना चाहिए, कि में अपनी सीमाएं हैं. हमारे अनुभव में, pipetting दौरान जितना एक संभव रोशनी मद्धिम और अंधेरे (या एक अपारदर्शी ढक्कन के साथ कवर) में microplates incubating एक जरूरत है. इन assays भी कई बार अंक में पढ़ा जा करने के लिए प्लेटों की आवश्यकता होती है क्योंकि एक ही समय में कई एंजाइमों परख करने की क्रिया है, यह अक्सर प्लेटों के बीच बहुत तेजी से स्विच करने की आवश्यकता में यह परिणाम है. उदाहरण के लिए, एक साथ (यानी छह अलग microplates का उपयोग) छह एंजाइमों की गतिविधि के लिए नौ पानी के नमूनों परख करने के क्रम में, यह प्रत्येक व्यक्ति की थाली में हर 10 में पढ़ा है कि यह सुनिश्चित करने के क्रम में एक थाली 1 घंटे के लिए हर 2 मिनट पढ़ने के लिए आवश्यक हो जाता है -15 मिनट (इस मामले में, हर 12 मिनट). केयर पढ़ा जा रहा विशेष थाली का ट्रैक रखने के लिए, साथ ही कोई तरल fro गिरा दिया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिएयह और के बाहर microplate fluorometer में स्थानांतरित कर रहा है के रूप में थाली हूँ. एक ही बार में कई एंजाइमों परख करने की क्रिया है, यह मन में microplate रीडर वास्तव प्लेट पढ़ने के लिए और तदनुसार अंतराल पढ़ने डगमगाते के लिए लगता है कि यह समय रखने के लिए भी महत्वपूर्ण है. परेशान हैं कि नमूनों के साथ कार्य करते समय पानी के नमूनों में बाह्य एंजाइम गतिविधि का फ्लोरोसेंट परख के साथ अंतिम चिंता का विषय है. निलंबित कण होते हैं कि पानी के नमूनों शुरू में पिपेट जलाशय में गिरने से पहले हिल और पूर्व microplate पर लादा जा रहा है pipettor साथ वापस लेने और बाहर खदेड़ना द्वारा फिर से मिलाया जाना चाहिए. एक नमूने में कणों की उच्च संख्या भी आम तौर पर फ्लोरोसेंट संकेत के अधिक से अधिक शमन में यह परिणाम है, और प्रत्येक नमूने के लिए बुझाना नियंत्रण के महत्व पर बल पर्याप्त नहीं किया जा सकता.

MUB और पी एन पी से जुड़े substrates आम तौर पर पर्यावरण एंजाइमों, कश्मीर मीटर मूल्यों के लिए इसी तरह के वी अधिकतम मान प्रदर्शित करते हैंअलग कर सकते हैं, और इस तरह के β-glucosidases और फास्फेटेजों के रूप में एंजाइमों उनके पी एनपी से जुड़े analogs 14 से MUB से जुड़े substrates के लिए उच्च संबंध हो सकता है. इसलिए, MUB से जुड़े substrates वे मिट्टी और अवसादों में एंजाइम की गतिविधि को मापने के लिए उपयोग करें जब एक बेहतर विकल्प होगा पता चलता है कि जो पी एनपी से जुड़े उन लोगों की तुलना में अधिक संवेदनशील होने की संभावना है. हालांकि MUB assays के दौरान मापा जाता है कि fluorogenic अंत उत्पाद कुछ मिट्टी के अर्क में संभावित शमन के अधीन है, और प्रतिदीप्ति रीडिंग समय 12 से अधिक अस्थिर हो सकता है. मिट्टी और अवसादों भी प्राकृतिक जल से अधिक बाह्य एंजाइम गतिविधि हो जाते हैं, तो fluorometric MUB से जुड़े assays की वृद्धि की संवेदनशीलता कुछ मिट्टी का विश्लेषण करते समय शमन के साथ संभावित समस्याओं को देखते हुए वर्णमिति पी एनपी तरीकों पर थोड़ा लाभ प्रदान कर सकता है. एक तरफ ध्यान दें, पी एन पी से जुड़े substrates और पी एनपी मानक के रूप में खुद को आम तौर पर अधिक afforda हैंउनके MUB समकक्षों की तुलना में ble, उनके उपयोग के लिए एक अतिरिक्त कारण बजटीय मजबूरी लागू होते हैं.

शायद जलीय और स्थलीय वातावरण में माइक्रोबियल बाह्य एंजाइम गतिविधि परख करने में सक्षम होने का सबसे महत्वपूर्ण पहलू इन तकनीकों माइक्रोबियल शारीरिक प्रक्रियाओं को मापने जबकि, इन प्रक्रियाओं कार्बन और पोषक तत्वों की पारिस्थितिकी तंत्र स्तर परिवर्तनों पर सीधा प्रभाव पड़ रहा है. एंजाइम गतिविधि का तेजी से माप संभावित पर्यावरणीय नमूनों में सीटू अपघटन दरों में तात्कालिक के निर्धारण की सुविधा है, ताकि कार्बनिक पदार्थ के अपघटन की दरें सीधे, अवसादों 18,19 में बाह्य cellulases की गतिविधि से जोड़ा गया है. उच्च throughput microplate दृष्टिकोण का उपयोग कर अधिक ठेठ एकल ट्यूब दृष्टिकोण से नमूनों की बड़ी संख्या में एंजाइम गतिविधि का एक साथ माप के लिए अनुमति देता है, एंजाइम गतिविधि में भिन्नता तो (और पारिस्थितिकी तंत्र के स्तर प्रक्रियाओं में विस्तार से) resp मेंइस तरह की गहराई 20 या पर्यावरण perturbations 9,21 जैसे कारकों को onse की जांच की जा सकती है. इसी प्रकार, फॉस्फेट और Nagase के रूप में पोषक तत्व सायकलिंग में शामिल एंजाइमों, के assays, मिट्टी विकास 8 के दौरान जैविक नाइट्रोजन के लिए, उदाहरण के लिए, विशिष्ट वातावरण में कार्बनिक फास्फोरस के सापेक्ष महत्व पोषक तत्व सीमा में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं.

एंजाइम की गतिविधियों पर तीस साल के लिए पर्यावरणीय नमूनों में मापा गया है, उन्नत मेटा विश्लेषण का उपयोग पढ़ाई के बीच तुलना अब संभव हो रहे हैं. इस तरह के अध्ययन कार्बनिक पदार्थ के अपघटन और पोषक खनिज का वैश्विक स्तर, एंजाइम गतिविधि है, और इसलिए दरों पर, पीएच, सब्सट्रेट उपलब्धता, और पोषक stoichiometry 17 से बंधे हैं, सुझाव देते हैं. इसी समय, एक microplate आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग geostatistical मानचित्रण तकनीक 22 का उपयोग एंजाइम गतिविधि में ठीक पैमाने पैटर्न के विश्लेषण की अनुमति के लिए शुरू हो गया है

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस काम के पहलुओं के लिए अनुदान कृषि के संयुक्त राज्य अमेरिका विभाग विशिष्ट सहकारी समझौते 58-6408-1-595 और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (पुरस्कार 1049911) सहित विभिन्न स्रोतों द्वारा प्रदान किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS AND MATERIALS
Glacial acetic acid Various suppliers
Sodium acetate Various suppliers
Sodium hydroxide Various suppliers
p-Nitrophenol Fisher BP612-1 Alternates available
p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate Sigma N3234 pNP-substrate
pNP-β-glucopyranoside Sigma N7006 pNP-substrate
pNP-β-N-acetylglucosaminide Sigma N9376 pNP-substrate
Clear 96-well microplates Fisher 12-563-301 Alternates available
96-well deep well blocks Costar 3958 Alternates available
Aluminum weigh pans Various suppliers
Sterile 15 ml centrifuge tubes Various suppliers
Sterile 50 ml centrifuge tubes Various suppliers
4-Methylumbelliferone Sigma M1381
4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate Sigma M8883 MUB-substrate
4-MUB-glucopyranoside Sigma M3633 MUB-substrate
4-MUB-N-acetylglucosaminide Sigma M2133 MUB-substrate
Sodium bicarbonate Various suppliers
Black 96-well microplate Costar 3792
Pipette reservoir Various suppliers
EQUIPMENT
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge rotor Eppendorf A-4-81 For microplates/deep-well blocks
Microplate reader BioTek Synergy HT Alternates available
Microplate fluorometer BioTek FLx 800 Alternates available
8-channel pipettor Various suppliers

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References

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