在使用高通量微孔板测定水,土壤,沉积物和微生物测定胞外酶活性的

Environment

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Summary

基于微板程序描述了用于胞外酶活性的比色或荧光分析。这些程序允许在大量环境样品等活动的管理的时间范围内的快速检测。

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Jackson, C. R., Tyler, H. L., Millar, J. J. Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays. J. Vis. Exp. (80), e50399, doi:10.3791/50399 (2013).

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Abstract

大部分的养分循环和碳处理的自然环境是通过微生物释放胞外酶的活性。因此,这些胞外酶的活性的测定可以给见解生态系统水平的过程,如有机物分解或氮和磷的矿化速率。环境样品中的胞外酶活性的测定通常涉及暴露样品到人工比色或荧光底物和跟踪底物水解的速率。在这里,我们描述了基于微板的方法,这些方法允许对大量样品的一个短的时间内进行分析。样品被允许与人工基质内的96孔微孔板或深孔微孔板块进行反应,并且酶的活性,随后通过吸收所产生的终产物的荧光或使用典型的微孔板里德确定r或荧光。这种高通量的程序不仅有利于空间上不同的网站或生态系统之间的比较,而且还通过减少每个样品所需的试剂整体体积大大减少这种试验的费用。

Introduction

微生物如细菌和真菌通过生产胞外酶的取得从复杂的有机化合物的营养物质和碳。这些酶通常水解的聚合物为可以被取入细胞小亚基。因此,在生态层面上,这些微生物胞外酶是负责大部分的养分矿化和发生在自然的环境中有机物的分解。酶,例如纤维二糖水解(CBH)和β-葡糖苷酶是纤维素降解和工作重要一致来催化纤维素水解成葡萄糖1,2,它提供了对微生物的吸收和同化一个可利用的碳底物。酶磷酸酶释放的有机磷易溶于无机磷酸基团,基本上矿化磷酸盐和使其可用于大多数生物3使用。其他酶,如N-乙酰氨基(NAG酶),是的importan吨中几丁质的降解,可以使碳和氮供微生物采集4。

一项所述的程序,用于在自然环境中的微生物胞外酶活性的测定是使用人工硝基苯基( NP)相连的基板,该最初被开发,以检测土壤磷酸酶活5的方法。此方法依赖于有色终产物, 硝基苯酚,当人工基板通过适当的酶水解时释放的检测。 硝基苯酚的随后可以通过测量其吸光度约为400-410 nm的比色定量。这种方法已经被应用到检测其它酶如NAG酶6,并已应用于各种研究着眼于在土壤和沉积物7-9微生物胞外酶活性。

这是originall一种替代方法Ý用于评估细胞外糖苷酶的活性在水生环境10,11是利用4 -甲基伞形酮(MUB)相连的底物。释放(4 - 甲基伞形酮)的最终产物是高荧光的,并且可以使用与周围四百六十分之三百六纳米的激发/发射设置一个荧光计来检测。各种MUB联的人工基质的情况下,允许至少为许多酶( β-葡糖苷酶,纤维二糖水解,NAG酶,磷酸酶)的活性的荧光测定作为可使用p NP-衬底比色步骤进行测定。其它微生物的胞外酶,如蛋白降解的亮氨酸氨肽酶,可以使用7 - 氨基-4 - 甲基香豆素(COU)键合底物荧光计进行测定。既MUB-和COU联基板已被用来确定各种陆地和水中的样品12,13中酶的活性。

虽然以前的研究单位描述离子束增强沉积荧光或比色微孔板方法来确定胞外酶的活性14,有必要建立一个清晰的介绍了如何进行这样的试验。在这里,我们展示了进行高通量微孔板技术的使用比色p NP联基板的做法土壤和沉积物,并在使用荧光MUB联基板技术自然水域胞外酶的活性分析程序。我们专注于β-葡糖苷酶,NAG酶和磷酸酶的活性的测量,因为这些酶可以分别连接到碳,氮,磷和骑自行车。然而,此处描述的步骤可以应用到使用不同的人工基质的其他胞外酶的测定。

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Protocol

胞外酶活性土壤和沉积物中的比色分析

1。对酶活性的比色分析底物的制备及缓冲溶液

  1. 通过混合50毫升0.1M乙酸(2.87毫升冰醋酸在500毫升水中)制备50mM醋酸缓冲液(pH 5.0-5.5),加入150ml的0.1M醋酸钠,和200毫升蒸馏水的H 2 O。如有必要,调整pH值至5.0-5.5用0.1M乙酸。
  2. 在蒸馏H 2 O制备的1M氢氧化钠(NaOH)的溶液
  3. 在50mM醋酸缓冲液制备p NP-连接的底物溶液。为了测定磷酸酶制备5mM对NP-磷酸盐,在50mM乙酸盐缓冲液;以测定β-葡糖苷酶制备5mM对NP-β-吡喃葡糖苷;以测定NAG酶制备2毫米的pNP-β-N-acetylglucosaminide。准备在无菌的15毫升或50ml离心管中所有衬底的解决方案。解决方案可以被存储在4℃下2-3周。

2。测定标准的转换吸光度 p的NP浓度

  1. 在50mM醋酸缓冲液制备的硝基苯酚的标准溶液。浓度范围应为0.025-1毫米。
  2. 转移100μl的各浓度重复三次,以清晰的96孔微板。加10μl1 M氢氧化钠和190微升蒸馏水H 2 O至每口井。
  3. 在410nm下用酶标仪记录吸光度。
  4. 乘法浓度在标准曲线0.3得到每300微升反应体积微摩尔p NP。绘制吸光度曲线与p NP的微摩尔。该曲线的斜率作为转换系数(C),这将涉及到的吸光度在各酶反应微摩尔p NP的。

3。进行酶分析

  1. 对于土壤,制备各样品的浆液在concentr待测定在无菌15ml离心管振动性为1g /毫升-1用50mM醋酸缓冲液约的。对于沉积物,补充足够的醋酸盐缓冲液,使料浆容易pipettable。所需浆料的​​确切量将根据酶测定的数目而变化,但至少为5毫升的建议。每个涡浆,直到土壤或沉积物的所有团块纷纷散去,并注意最终体积。
  2. 再涡流各浆料并立即吸取150微升到每个6孔96孔深孔块( 图1)上。重要的是要彻底涡流和频繁,以保持土壤的颗粒在悬浮液中。离开每块至少有两个井空作为底物的控制。注:剪辑的移液器吸头与之前的移液剪刀年底的土壤泥浆容易堵塞的提示。准备一台96井区的每种酶进行检测。
  3. 倒入大约5毫升的醋酸缓冲液入吸管水库和使用8道移液器到150微升的缓冲液加入至升AST各样品2孔(这将样品缓冲液对照组)和2基板对照孔( 图1)
  4. 倾大约10毫升正常 P NP-底物溶液成吸管水库和使用8道移液器至150微升底物溶液加至前四个孔中每一个样品和两个基板对照孔( 图1)。注意时间作为反应只要加入底物溶液开始。
  5. 孵育板在室温(22℃)为0.5-4小时。确切的温育时间将取决于样品中的活性水平和待测定的酶而有所不同。对于大多数土壤和沉积物,磷酸酶和β-葡萄糖苷酶需要0.5-1.5小时的孵育时间,而NAG酶和其他酶需要> 2小时孵育时间。
  6. 虽然试验是孵化制订明确的96孔微孔板读吸光度。准备一台微孔板的每个深孔块( 每封nzyme测定)。移液管加入10μl的1M NaOH和190微升蒸馏水到微孔板的每个孔中。注意:氢氧化钠减慢酶促反应,并且提高,从而提高了反应过程中释放的P NP的颜色的pH值。
  7. 培养后,离心分离96孔块在2,000-5,000×g离心5分钟以沉淀土壤颗粒。
  8. 使用多道移液器从每孔撤出100微升,请小心操作以免颗粒,并将其传输到编制明确的96孔板对应得很好。
  9. 打开酶标仪,并设立任何必要的软件。在410nm处记录吸收值。如果一个特定的孔的吸光度高于酶标仪的线性检测限,淡化了良好1:1的水和重新测量。如果吸光率仍然太高,该测​​定应反复用更短的孵育时间。

4。样品的干质量的测定

  1. 移液器各1ml SAMPL的 Ë浆到一个预先称重的铝盘中。
  2. 干在75℃烘箱中干燥48小时后称量。从这个值减去锅的重量,得到土壤或沉积物的干质量的1毫升的浆料。通过0.15的因子相乘,以确定在150微升的酶测定加入到每孔样品的干质量。

5。每个土壤干质量或沉积物酶活性的计算

  1. 减去从样品测定吸光度采样控制吸光度计算出每个样品的最终吸光度。如果基板的控制有较高的吸收率(约> 0.060),然后减去者也。
  2. 计算酶的活性在微摩尔小时-1 g干质量-1从以下公式计算:

酶的活性=最终吸光度/(C X孵育时间×样品干重)

胞外酶活性的天然水域的荧光分析

对酶活性的荧光分析幔“> 1。底物的制备,标准和缓冲溶液

  1. 通过在无菌溶解适当的衬底制备200μM的溶液MUB联的底物( 4 - MUB-β-吡喃葡糖苷,4 - MUB-磷酸盐,4 - MUB-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷)的(高压灭菌)蒸馏水H 2 O的在无菌的15毫升或50ml离心管中。包装在铝箔管,以排除光线并存储在使用之前冰箱。基材应至少1周是稳定的,如果以这种方式存储。
  2. 通过使100微米4 -甲基伞形酮在无菌蒸馏水H 2 O的原液准备MUB标准冷藏储存在琥珀色或箔纸包裹的瓶子。在使用前立即由1/10稀释为100μM原液到无菌H 2 O的使10μM的用于酶测定的工作溶液。
  3. 通过溶解8.4克碳酸氢钠<作好准备的100毫米碳酸氢盐缓冲液的原液子> 3到1 LH 2 O和高压灭菌。根据需要使5毫米的酶的测定工作液稀释此原液的1/20到无菌H 2 O

2。在96孔黑色微孔板组织水样

  1. 组织微板的每个酶按照图2所示的例子。请注意,以允许足够的复制,标准和控制,这个程序可以测定单个酶的活性达九水样在一个96孔微孔板黑色。
  2. 倒入大约5毫升第一样品放入吸管水库和使用8道移液器以微升pipette200到所有的水井在微孔板(S)的第1列的。丢弃用过的枪头,并根据需要对每个水样,以填补列1-9重复。

3。设置样品,标准,淬火和控制基板

  1. 设置控件占样品,标准秒,基板和淬火在相同的黑色微孔板的样品( 图2)。
  2. 样品对照样品含有水和碳酸氢盐缓冲液中,并没有在活性计算中使用,但将演示读取整个实验过程中保持一致。淬火控制包括样品的水和荧光标记的标准量的和用于测量荧光的样品水的衍射。基板和标准控件要么基板联或标准的荧光标记,分别与碳酸氢盐缓冲液的组成。
  3. 倒入大约5毫升5 mM的碳酸氢盐缓冲液到一个干净的移液管水库。吸取50μL缓冲到微孔板1通过9排D和E形成两个复制的每个样品采样控制井。变化的枪头然后行转移200微升碳酸氢盐缓冲液中,以井10到12 A和H。
  4. 通过调光或关闭李降低环境照明亮灯作为荧光标准对光敏感。
  5. 倒入大约5毫升10微米4 - 甲基伞形酮到一个干净的移液管水库。吸取50μL进微孔板1通过行H 12,和成井1到9成排G和F,形成每个样品淬火控制和整体水平控制三个重复。无论是将微孔板在黑暗中或覆盖用不透明的盖子,以减少MUB的光降解。
  6. 打开的荧光计和设置任何必要的软件以准备加入底物之前阅读。注意:某些荧光灯泡可能需要3分钟以上的预热时间。
  7. 倒入大约5毫升适当MUB联基板( 4-MUB -磷酸)放入干净的移液管水库。使用12通道移液器吸取到50微升到微孔板1通过A排12,进水井1至9中的行B和C形成三个重复测定每个样品和三个基板的控制。立即出现Ÿ继续执行步骤4.1,记录荧光。

4。记录荧光

  1. 基板除了微孔板后立即读出初始荧光。阅读荧光后,孵育微孔板在室温(22℃),无论是在黑暗中或覆盖着不透明的盖子,以减少MUB的光降解。
  2. 以测量水样品中的最大的潜在酶活性所需的温育时间将依赖于酶浓度的样品内。由于这是未知的测定完成之前,该微板将要读出的多个时刻的步骤。通常情况下,在10〜15分钟的间隔读了1个小时的过程中是可以接受的许多酶,虽然与某些酶的活性非常高的样品可以在10分钟之前见顶。
  3. 继续阅读荧光微孔板在你指定的时间间隔至少1小时。一定要保持微孔板盖或读数之间的暗秒。

5。每个供水量酶活性的计算

  1. 在每个时间间隔中的每个样本计算:平均初始样品的荧光(孔D和E),平均最终样品的荧光(井AC),平均标准荧光(孔H10-11),且平均急冷控制荧光(井FG)。
  2. 对于每个时间间隔,计算在纳摩尔小时酶活-1毫升-1由以下公式计算:

酶活性=(平均样品荧光 - 平均初始样品荧光)/((平均标准的荧光/ 0.5摩尔)×(平均淬火控制荧光/均值标准的荧光)×(0.3毫升)×(时间以小时为单位))

  1. 检查计算每个时间步骤中的活性值。从最高的活动时间步长决定最终的潜在活性。如果活性值继续增加再后来的时间步长,可能需要,如果活性值下降throug豪特的运行过程中,然后用更短的时间的步骤再次运行。最终活性是在衬底消耗小时-1毫升-1的纳摩尔但可以按比例增加,表示为微摩尔小时-1·L-1。

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Representative Results

土壤和水体沉积物通常有胞外酶的活性明显的水平附着的微生物群落(生物膜),颗粒的表面上生长的结果。 图3显示了本次活动依赖于从第三表层沉积物得到颗粒的大小如何变化在密西西比州北部,美国订单源源不断。先前的研究已经表明,在此流泥沙颗粒的细菌群落可以分为基于他们的社会结构的分子分析三个不同的群体:那些在0.063毫米颗粒,那些在0.125,0.25,和0.5毫米的颗粒,而这些1毫米的颗粒15。支持这一结论的胞外酶活性的模式数据;与磷酸酶( 图3A),即相似于0.125,0.25和0.5毫米的颗粒,但在1和0.063毫米馏分当使用p NP-连接基板技术测定高得多。 Ø热敏酶,如β-葡糖苷( 图3B),和NAG酶( 图3C)表示的最细的颗粒相似的峰,但升高1毫米的颗粒,突出的事实,不同的酶可表现出不同的环境分布和这些可阐明使用该法。相对较低的误差线显示,比较不同环境样品时,酶的活性在沉积物比色法测定重复性好,因此适合进行统计分析。

天然水域往往有每毫升低于胞外酶的活性比土壤或沉积物每克做。因此,它们应该被荧光计使用MUB联的基质进行测定。 图4显示了酶的磷酸酶( 图4A)的活性,β-葡糖苷( 图4B),和NAG酶( 图4C)随深度而变化的浅湖在密西西比州北部,美国答湖(皮绳湖)被称为是营养差16,也是由磷酸酶( 图4A)的活性比较高建议,一种酶,微生物,以便从有机化合物收购磷矿生产。对于所有三个测定的酶,在水的表面(0厘米)和50厘米深度采集的样品表现出相似的活性,而活性升高100厘米的样品中。该样品基本上取自水 - 沉积物界面和沉淀颗粒的样品中是否存在可能占了较高的活性看出本示例中,特别是对β-葡糖苷酶和NAG酶。作为与p NP基板,低误差棒表明,即使只有三个重复读数,使用MUB基板上的荧光测定法的重现性高。

注意,单位为图4是基板的纳摩尔消耗而那些用于图3是在衬底消耗的微摩尔,即使每单位面积可比(无论是每毫升或每克)。这突出了一个事实,即土壤和沉积物倾向于具有比天然水域高得多的胞外活性( 图3中每一个特定的酶的活性是约大于图4中的等效酶的活性10 - 100倍以上)。它也显示了MUB联基板技术,使用这种技术用于测定胞外酶的活性水样中的必要性的敏感性增加。

图1
图1。 96孔深孔板中使用比色p NP联s的土壤或沉积物中胞外酶活性的测定建议布局ubstrate技术。各孔应接受总共300微升的,由样品浆料中,底物溶液,或醋酸盐缓冲液的取决于它是否是一个样本来说,样本控制,或控制衬底。

图2
图2。 96孔黑色建议布局微孔板的胞外酶的活性用荧光MUB联基板技术水样中检测。九个样品可垂直于板(一)各占据八口井布置。这八个孔用于样品运行,采样控制,和淬火的控制,同时保持井用于基板的控制和MUB标准(B)。

图3 图3。对不同规模从一条小溪在北密西西比,美国收集表层沉积物颗粒的胞外酶的活性。每个粒度组分测定磷酸酶(A),β-葡萄糖苷酶(B)的活性,NAG酶(C)以下的p NP-底物显色过程。活性被报道在微摩尔底物消耗小时-1克沉淀物-1的干质量,并为每个粒度级分三组重复读数的平均值(+ SE)。

图4
图4。水在三个DIF采取外酶活性ferent深度(0,50,和100公分)从一个浅湖在北美国密西西比州。水测定磷酸酶(A),β-葡萄糖苷酶(B)的活性,NAG酶(C)以下的MUB基板荧光程序。活性被报道在纳摩尔衬底消耗h -1的毫升水和-1是每样本3重复读数的平均值(+ SE)。

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Discussion

确定各种土壤和沉积物中微生物胞外酶的活性可以有效地洞察养分的矿化与有机物处理17的速率。然而,土壤可以在其水分含量而有所不同,所以标准化活动,以土壤干重是很重要的。这就要求(通常两天)超越了简单的测量酶活性的附加干燥步骤。因此,相对于酶活性的水样,接近瞬时的结果提供了在测定中,在土壤和沉积物酶活性的可靠的检测需要几天。对于一些土壤,它甚至可能是更合适的,表达为每克活性有机物或无灰干重,需要一个额外的灰化步骤(通常为2小时,在500℃)以外的烘干程序。无论如何,在土壤或沉积物酶活性的比色测定法中最关键的步骤是将上清液从深阱方框f撤跟据一个离心培养期的结束。因为这个过程依赖于测量吸光度,几个流浪土壤颗粒甚至在最后的微孔板的存在可能会导致虚假的结果。较高的离心速度(> 5,000 XG)可能有助于缓解这个问题,但在我们的经验离心机转子接受微孔板通常有低于这个阈旋转极限,而块本身可能不会容忍更高的速度。本质上,这个特定的移液步骤需要小心和速度的组合,以使用多通道移液器以快速地从深阱块传送所需的上清液的量为微量。

胞外酶活性的水样中的测定既没有必要干燥时间,也不是离心步骤,后者因为无论是酶 - 底物反应和最终产品的荧光的测量发生在相同的微孔板。因此,这些一ssays通常更快,最初可能会出现更容易运行。但是,他们有自己的局限性在于,只要有可能,在MUB标准和MUB联基材不应该暴露在光线下。在我们的经验,调暗灯光尽可能多的可能的移液过程中和温育微孔板在黑暗中(或覆盖有一个不透明的盖子)是必要的。因为这些测定也需要在板读取在多个时间点,这同时测定多种酶时常常会导致板之间需要非常快速的切换。例如,为了测定9水样本进行的同时( 用六种不同的微板)6的酶的活性,有必要读出的板,每2分钟1小时,以确保每个单独的板读取每10 -15分钟(在这种情况下,每12分钟)。必须小心,以保持特定的板被读的轨道,以及以确保没有液体溢出的往复米的板,因为它被转移进和流出的微孔板荧光计。当测定多种酶一次,同样重要的是要记住,它需要的酶标仪实际读板,并相应地错开读间隔时间。与样品是浑浊工作时与水样中胞外酶活性的荧光检测的最终关注的是。含有悬浮颗粒的水样前应首先涌入吸管水库动摇和退出和退出与被加载到微孔板前移液器再次混合。较高的数字样本中的颗粒也通常会导致荧光信号的较大的淬火,以及淬火控制每个样品的重要性,不能充分强调。

虽然MUB- p NP联基材通常显示为环保酵素,对K M值类似V 最大价值可以不同,和酶,如β-葡糖苷酶和磷酸酶可能对MUB联衬底更高的亲和力比它们 p NP-连接的类似物14。因此,MUB联的底物是可能比那些链接到P NP,这表明它们将是一个较好的选择测量土壤和沉积物中的酶活性时,使用更敏感。然而,它是在MUB实验测得的荧光最终产品,须在某些土壤提取物潜在淬火和荧光读数可能不稳定随着时间的推移12。土壤和沉积物中也往往有比天然水域较高外酶的活性,使荧光MUB联检测的敏感性增加可能会提供一点优势分析某些土壤时给出淬火的潜在问题的色度​​p NP方法。作为一个方面说明,在P NP联基板和p NP标准本身一般都比较afforda竹叶提取比他们MUB同行;一个额外的理由为他们的使用,如果预算限制适用。

也许能够测定微生物胞外酶的活性在水生和陆生环境中最重要的方面是,虽然这些技术测量微生物的生理过程,这些过程对碳和养分的生态系统层面转变有直接的影响。有机物的分解率已经直接关系到沉积物中18,19胞外纤维素酶的活性,使酶的活性快速的测量可能有助于瞬间原位分解速率环境样品中的测定。使用高通量微孔板方法允许在更大的样本数酶活性的同时测量超过典型的单管的方法,所以在酶活性的变化(通过扩展的生态系统级进程)在RESPONSE等因素深度20或环境扰动9,21可以进行检查。同样,参与养分循环的酶,如磷酸酶和NAG酶的检测,可以土壤发育8时提供深入了解营养限制在特定的环境中,例如,有机磷的相对重要性,以有机氮。

由于酶活性进行了测量环境样品中超过三十年,采用先进的荟萃分析研究之间的比较正在成为可能。这些研究表明,在有机物质的分解和养分矿化的全球范围内,酶活性,并因此率,被栓至pH,底物的可用性,营养物质和化学计量17。同时,利用一个微板为基础的协议的开始,以允许使用地质统计制图技术22的酶活性细尺度模式的分析

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Disclosures

作者宣称,他们有没有竞争的财务权益。

Acknowledgments

资助这项工作的各个方面是由各种来源,包括农业部美国农业部的具体合作协议58-6408-1-595和美国国家科学基金会(奖1049911)提供。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS AND MATERIALS
Glacial acetic acid Various suppliers
Sodium acetate Various suppliers
Sodium hydroxide Various suppliers
p-Nitrophenol Fisher BP612-1 Alternates available
p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate Sigma N3234 pNP-substrate
pNP-β-glucopyranoside Sigma N7006 pNP-substrate
pNP-β-N-acetylglucosaminide Sigma N9376 pNP-substrate
Clear 96-well microplates Fisher 12-563-301 Alternates available
96-well deep well blocks Costar 3958 Alternates available
Aluminum weigh pans Various suppliers
Sterile 15 ml centrifuge tubes Various suppliers
Sterile 50 ml centrifuge tubes Various suppliers
4-Methylumbelliferone Sigma M1381
4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate Sigma M8883 MUB-substrate
4-MUB-glucopyranoside Sigma M3633 MUB-substrate
4-MUB-N-acetylglucosaminide Sigma M2133 MUB-substrate
Sodium bicarbonate Various suppliers
Black 96-well microplate Costar 3792
Pipette reservoir Various suppliers
EQUIPMENT
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge rotor Eppendorf A-4-81 For microplates/deep-well blocks
Microplate reader BioTek Synergy HT Alternates available
Microplate fluorometer BioTek FLx 800 Alternates available
8-channel pipettor Various suppliers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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