Determinación de la actividad enzimática extracelular microbiana en aguas, suelos y sedimentos de los que utilizan y alto rendimiento de microplacas Ensayos

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Summary

Procedimientos basado en una microplaca se describen para el análisis colorimétrico o fluorométrico de la actividad enzimática extracelular. Estos procedimientos permiten el rápido ensayo de tal actividad en un gran número de muestras del medio ambiente dentro de un marco de tiempo manejable.

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Jackson, C. R., Tyler, H. L., Millar, J. J. Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays. J. Vis. Exp. (80), e50399, doi:10.3791/50399 (2013).

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Abstract

Gran parte de la ciclo de los nutrientes y el procesamiento de carbono en ambientes naturales se produce a través de la actividad de las enzimas extracelulares liberados por microorganismos. Por lo tanto, la medición de la actividad de estas enzimas extracelulares puede dar una visión de los tipos de procesos a nivel de ecosistema, como la descomposición de la materia orgánica o mineralización del nitrógeno y el fósforo. Los ensayos de actividad de la enzima extracelular en muestras ambientales normalmente implican la exposición de las muestras a sustratos colorimétricos o fluorométricos artificiales y el seguimiento de la tasa de hidrólisis del sustrato. Aquí se describen los métodos de microplacas basado para estos procedimientos que permiten el análisis de un gran número de muestras dentro de un corto período de tiempo. Las muestras se dejan reaccionar con sustratos artificiales dentro de microplacas de 96 pocillos o de pozo profundo bloques de la microplaca, y la actividad enzimática se determina posteriormente por absorción o fluorescencia del producto final resultante usando un Reade típica de microplacasr o fluorómetro. Tales procedimientos de alto rendimiento no sólo facilitan las comparaciones entre sitios espacialmente separados o ecosistemas, sino que también reducen sustancialmente el coste de dichos ensayos, reduciendo los volúmenes totales de reactivos necesarios por muestra.

Introduction

Los microorganismos tales como bacterias y hongos obtienen los nutrientes y de carbono a partir de compuestos orgánicos complejos a través de la producción de enzimas extracelulares. Estas enzimas hidrolizan típicamente polímeros en subunidades más pequeñas que se pueden tomar en la célula. Por lo tanto, a nivel ecológico, estas enzimas extracelulares microbianos son responsables de gran parte de la mineralización de nutrientes y la descomposición de la materia orgánica que se produce en entornos naturales. Las enzimas tales como celobiohidrolasa (CBH) y β-glucosidasa son importantes para la degradación de la celulosa y el trabajo al unísono para catalizar la hidrólisis de la celulosa a glucosa 1,2, que proporciona un sustrato de carbono utilizable para la absorción y asimilación microbiana. La enzima fosfatasa libera grupos fosfatos inorgánicos solubles de organofosfatos, esencialmente mineralizantes fosfato y su puesta a disposición para su uso por la mayoría de los organismos 3. Otras enzimas, tales como N-acetilglucosaminidasa (la NAGase), son IMPORTANTESt en la degradación de la quitina y puede hacer tanto el carbono y el nitrógeno disponible para la adquisición microbiana 4.

Uno de los procedimientos para el ensayo de actividad de la enzima microbiana extracelular en ambientes naturales es el uso de p-nitrofenil artificial de sustratos enlazados (p NP), un enfoque que se desarrolló originalmente para detectar la actividad fosfatasa de suelo 5. Este enfoque se basa en la detección de un producto final coloreado, p-nitrofenol, que se libera cuando el sustrato artificial es hidrolizado por la enzima apropiada. El p-nitrofenol puede posteriormente cuantificar colorimétricamente midiendo su absorbancia a alrededor de 400-410 nm. Este método ya se ha aplicado para detectar otras enzimas tales como la NAGase 6, y se ha utilizado en varios estudios en busca de actividad de la enzima microbiana extracelular en los suelos y sedimentos 7-9.

Un enfoque alternativo que era originally desarrollado para evaluar la actividad glucosidasa extracelular en ambientes acuáticos 10,11 hace uso de (MUB) sustratos ligados 4 metilumbeliferona. El producto final liberado (4-metilumbeliferona) es altamente fluorescente y puede detectarse utilizando un fluorómetro con un ajuste de excitación / emisión de alrededor de 360/460 nm. Una variedad de sustratos artificiales MUB enlaces-están disponibles, permitiendo la medición fluorométrica de la actividad de al menos el mayor número de enzimas (por ejemplo, β-glucosidasa, celobiohidrolasa, Nagase, fosfatasa) como puede ensayarse usando el procedimiento colorimétrico-NP sustrato p. Otras enzimas extracelulares microbianos, tales como la aminopeptidasa de leucina en proteínas degradantes, se pueden ensayar fluorométricamente utilizando 7-amino-4-metil-cumarina (COU) sustratos enlazados. Tanto MUB-y sustratos COU vinculados se han utilizado para determinar la actividad de la enzima en varias muestras terrestres y acuáticos 12,13.

Mientras que los estudios anteriores han described microplaca fluorométrico o colorimétrico se acerca para determinar la actividad enzimática extracelular 14, hay una necesidad de una presentación clara de cómo llevar a cabo dichos ensayos. Aquí se demuestra los procedimientos para la realización de técnicas de alto rendimiento de la microplaca para el análisis de la actividad enzimática extracelular en suelos y sedimentos, utilizando el enfoque sustratos NP-linked p colorimétrico y en aguas naturales mediante la técnica fluorescente sustratos MUB enlazada. Nos centramos en la medición de las actividades de β-glucosidasa, la NAGase, y fosfatasa como estas enzimas pueden estar vinculados a carbono, de nitrógeno, de fósforo y el ciclismo, respectivamente. Sin embargo, los procedimientos descritos aquí se pueden aplicar a la medición de otros enzimas extracelulares utilizando diferentes sustratos artificiales.

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Protocol

Análisis colorimétrica de la actividad enzimática extracelular en suelos y sedimentos

1. Preparación del substrato y Soluciones tampón para análisis colorimétricos de actividad enzimática

  1. H Preparar 50 mM de tampón de acetato (pH 5.0-5.5) mediante la mezcla de 50 ml de 0.1 M de ácido acético (2,87 ml de ácido acético glacial en 500 ml de agua), 150 ml de acetato de sodio 0,1 M, y 200 ml de agua destilada 2 O. Ajustar el pH a 5,0-5,5 con ácido acético 0,1 M si es necesario.
  2. Preparar una solución de 1 M de hidróxido de sodio (NaOH) en H2O destilada
  3. Preparar soluciones de sustrato NP-linked p en 50 mM de tampón acetato. Para ensayo de fosfatasa preparar 5 mM p NP-fosfato en 50 mM de tampón acetato; para ensayar la β-glucosidasa preparar 5 mM p NP-β-glucopiranósido; para someter a ensayo la NAGase preparar 2 mM de PNP-β-N-acetylglucosaminide. Preparar todas las soluciones de sustrato en estériles de 15 ml o 50 ml tubos de centrífuga. Las soluciones pueden ser almacenadas a 4 ° C durante 2-3 semanas.

2. Determinación de un estándar para convertir Absorbancia Concentración de p NP

  1. Preparar soluciones estándar de p-nitrofenol en 50 mM de tampón acetato. Las concentraciones deben variar desde 0,025 hasta 1 mM.
  2. Transferencia tres repeticiones de 100 l de cada concentración a una clara microplaca de 96 pocillos. Añadir 10 l de NaOH 1 M y 190 l de H2O destilada a cada pocillo.
  3. Absorbancia Récord en 410 nm utilizando un lector de microplacas.
  4. Concentraciones se multiplican en la curva estándar de 0,3 para obtener moles p NP por cada 300 l de volumen de reacción. Trazar una curva de absorbancia frente micromoles de p NP. La pendiente de la curva sirve como el factor de conversión (C) que se relacionan la absorbancia a micromoles de p NP en cada reacción de la enzima.

3. Realizar el ensayo enzimático

  1. Para suelos, preparar una suspensión de cada muestra a ensayar en un tubo de centrífuga de 15 ml estéril a una Concentrción de aproximadamente 1 g / ml -1 utilizando 50 mM de tampón acetato. Para los sedimentos, añadir tampón de acetato suficiente para hacer la pasta fácilmente pipettable. El volumen exacto de suspensión necesaria variará de acuerdo con el número de enzimas ensayadas, pero se recomienda un mínimo de 5 ml. Vortex cada suspensión hasta que todos los grumos de suelo o los sedimentos se han dispersado y anote el volumen final.
  2. Re-vórtice cada suspensión y pipeta de inmediato 150 l en cada uno de los seis pozos en un bloque de 96 pocillos para pozos profundos (Figura 1). Es importante mezclar bien y con frecuencia con el fin de mantener a las partículas del suelo en suspensión. Deje por lo menos dos pozos por bloque vacías para servir como control de sustrato. Nota: el clip final de puntas de pipeta con tijeras antes de pipetear como suelos fangosos tienden a obstruir las propinas. Preparar un bloque de 96 pocillos para cada enzima a ensayar.
  3. Verter aproximadamente 5 ml de tampón de acetato en un depósito pipeta y utilizar una pipeta de 8 canales a añadir 150 l de la memoria intermedia a la LAST dos pozos de cada muestra (estos serán controles de tampón de muestra) y los dos pocillos de control sustrato (Figura 1)
  4. Vierta aproximadamente 10 ml de la solución apropiada NP-sustrato p en un depósito pipeta y utilizar una pipeta de 8 canales a añadir 150 l de la solución de sustrato a las primeras cuatro pocillos de cada muestra y los dos pocillos de control sustrato (Figura 1). Tenga en cuenta el tiempo que la reacción se inicia tan pronto como se añade la solución de sustrato.
  5. Incubar las placas a temperatura ambiente (22 ° C) durante 0,5-4 h. Tiempo de incubación exacta variará dependiendo del nivel de actividad en las muestras y la enzima a ensayar. Para la mayoría de los suelos y sedimentos, fosfatasa y β-glucosidasa requieren tiempos de incubación de 0,5 a 1,5 horas, mientras que la NAGase y otras enzimas requieren tiempos de incubación de> 2 h.
  6. Mientras que los ensayos están incubando preparar clara microplacas de 96 pocillos a interpretar la extinción. Preparar una microplaca para cada bloque de pozos profundos (es decir, para cada direcciónnzyme ensayada). Pipetear 10 l 1 M NaOH y 190 l de agua destilada en cada pocillo de la microplaca. Nota: NaOH ralentiza la reacción enzimática y eleva el pH que mejora el color de la p NP liberado durante la reacción.
  7. Después de la incubación, centrifugar los bloques de 96 pocillos a 2.000-5.000 g durante 5 min para sedimentar las partículas del suelo.
  8. Use una pipeta multicanal a retirar 100 l de cada pocillo, teniendo cuidado de evitar la pastilla, y la transferencia a las correspondientes bien en claro microplaca de 96 pocillos preparados.
  9. Encienda el lector de microplacas y configurar el software necesario. Absorbancia Récord en los 410 nm. Si la absorbancia de un pozo en particular está por encima del límite de detección lineal de la lector de placas, diluir así que 1:01 con agua y volver a medir. Si la absorbancia es todavía demasiado alta, el ensayo debe repetirse con un tiempo de incubación más corto.

4. Determinación de la masa seca de las muestras

  1. Pipetear 1 ml de cada sampl e mezcla en una cacerola de aluminio previamente pesado.
  2. Secar en una estufa de secado 75 ° C durante 48 horas y pesar. Reste el peso de la cacerola de este valor para obtener la masa seca del suelo o sedimento en 1 ml de la suspensión. Multiplicar por un factor de 0,15 para determinar la masa seca de la muestra en los 150 l añadidos a cada pocillo en el ensayo enzimático.

5. Cálculo de la actividad enzimática por la masa seca del suelo o sedimento

  1. Cálculo de absorbancia final de cada muestra sustrayendo la absorbancia de la muestra de control a partir de la absorbancia de la muestra de ensayo. Si los controles de sustrato tienen alta absorbencia (aproximadamente> 0.060) luego restar esos también.
  2. Cálculo de la actividad enzimática en moles h -1 g de masa seca -1 partir de la ecuación:

La actividad enzimática = / (masa C x tiempo de incubación x muestra seca) absorbancia final

Análisis fluorescente de la enzima extracelular Actividad en Natural Aguas

tle "> 1. Preparación de sustrato, Standard y Soluciones tampón para análisis fluorométricos de actividad enzimática

  1. Preparar 200 M soluciones de sustratos MUB enlaces-(por ejemplo, 4-MUB-β-glucopiranósido, 4-MUB-fosfato, 4-MUB-N-acetil-β-D-glucosaminida) disolviendo el sustrato apropiado en estéril (autoclave) destilada H2O en 15 ml estériles o tubos de 50 ml de centrífuga. Envuelva los tubos de papel de aluminio para evitar la luz y almacenar en el refrigerador antes de su uso. Los sustratos deben ser estables durante al menos 1 semana si se almacena de esta manera.
  2. Preparar un estándar MUB haciendo una solución madre de 100 mM 4-metilumbeliferona en agua destilada estéril 2 O. Almacene refrigerado en ámbar o botella envueltas en papel aluminio. Inmediatamente antes de su uso, diluir la solución 100 mM de stock de 1/10 en H2O estéril para hacer una solución de trabajo de 10 m para los ensayos enzimáticos.
  3. Preparar una solución madre de tampón de bicarbonato 100 mM disolviendo 8,4 g de NaHCO <sub> 3 en 1 LH 2 O y autoclave. Diluir esta solución madre 1/20 en H2O estéril según sea necesario para hacer una solución de trabajo de 5 mM para los ensayos enzimáticos.

2. La organización de muestras de agua en un 96 pocillos de microplacas Negro

  1. Organizar una microplaca para cada enzima siguiendo el ejemplo mostrado en la Figura 2. Tenga en cuenta que lo que permite la replicación adecuada, estándares, y los controles, este procedimiento puede ensayar la actividad de una única enzima para un máximo de nueve muestras de agua en uno de 96 pocillos de microplacas negro.
  2. Verter aproximadamente 5 ml de la primera muestra en un depósito de pipeta y utilizar una pipeta de 8 canales a pipette200 l en todos los pocillos de la columna 1 de la microplaca (s). Deseche las puntas de pipeta usadas y repetir según sea necesario para cada muestra de agua para llenar las columnas 1-9.

3. Configuración de la Muestra, Standard, Quench, y controles de sustrato

  1. Establecer controles para dar cuenta de las muestras, estándars, sustrato y enfriamiento en la misma microplaca negro como las muestras (Figura 2).
  2. Controles de muestra contienen agua de muestra y tampón de bicarbonato, y no se utilizan en los cálculos de actividad pero demostrarán la lectura de la consistencia a lo largo del curso del experimento. Los controles de enfriamiento consisten en agua de la muestra y una cantidad estándar de la etiqueta fluorescente y se utilizan para medir la difracción de la fluorescencia en la muestra de agua. Substrato y controles estándar se componen de tampón o bien-sustrato vinculado o la etiqueta fluorescente estándar, respectivamente, y bicarbonato.
  3. Vierta aproximadamente 5 ml de 5 mM de tampón de bicarbonato en un depósito de pipeta limpia. Pipetear 50 l de tampón en los pocillos de la microplaca 1 a 9 en filas D y E para formar dos pocillos replicados de controles de la muestra por muestra. Puntas de pipeta Cambio luego se transfieren 200 l de tampón de bicarbonato para pozos de 10 a 12 en las filas A y H.
  4. Reducir la iluminación ambiental por atenuar o apagar las lilos dere como el estándar fluorescente es sensible a la luz.
  5. Verter aproximadamente 5 ml de 10 mM 4-metilumbeliferona en un depósito de pipeta limpia. Pipetear 50 l en los pocillos de la microplaca de 1 a 12 en la fila H, y en los pozos 1 al 9 en filas G y F para formar tres réplicas de los controles de enfriamiento por muestra y los controles generales estándar. O coloque la microplaca en la oscuridad o cubrir con una tapa opaca para reducir la degradación de la luz de MUB.
  6. Encienda el fluorómetro y puesta en marcha cualquier software necesario para estar listo para leer antes de añadir el sustrato. Nota: algunas bombillas fluorómetro pueden requerir un tiempo de calentamiento de 3 minutos o más.
  7. Verter aproximadamente 5 ml de sustrato MUB vinculado-apropiado (por ejemplo 4-MUB-fosfato) en un depósito de pipeta limpia. Utilice una pipeta de 12 canales para pipetear 50 l en los pozos de la microplaca de 1 a 12 en la fila A, y en los pozos 1 a 9 en las líneas B y C para formar tres ensayos replicados de cada muestra y tres controles de sustrato. INMEDIATAMy vaya al paso 4.1, la fluorescencia de grabación.

4. Fluorescencia de grabación

  1. Leer la fluorescencia inicial inmediatamente después de la adición de sustrato a la microplaca. Después de leer la fluorescencia, se incuba la microplaca a temperatura ambiente (22 ° C) o bien en la oscuridad o cubierta con una tapa opaca para reducir la degradación de la luz MUB.
  2. El tiempo de incubación requerido para medir la actividad máxima de la enzima potencial en una muestra de agua dependerá de la concentración de la enzima dentro de la muestra. Dado que este es desconocida antes de que se completó el ensayo, la microplaca se tendrá que leer en múltiples pasos de tiempo. Típicamente, la lectura a intervalos de 10-15 minutos en el transcurso de 1 h es aceptable para muchas enzimas, aunque las muestras con actividad muy alta para ciertas enzimas pueden alcanzar su punto máximo antes de 10 min.
  3. Seguir leyendo la fluorescencia en microplacas a sus intervalos designados durante al menos 1 hora. Asegúrese de mantener la microplaca cubierta o en la oscuridad entre la lecturas.

5. Cálculo de la actividad enzimática por volumen de agua

  1. Para cada muestra en cada intervalo de tiempo de cálculo de las: fluorescencia media de la muestra inicial (pozos D y E), la fluorescencia de la muestra final media (pozos AC), la media de fluorescencia estándar (pozos H10-11), y la media apagan la fluorescencia de control (pozos FG).
  2. Para cada intervalo de tiempo, calcular la actividad enzimática en nmoles hr -1 ml-1 a partir de la ecuación:

La actividad enzimática = (media fluorescencia de la muestra - significará la fluorescencia de la muestra inicial) / ((media de fluorescencia / 0,5 mol) x estándar (media saciar la fluorescencia de control / media de fluorescencia) x estándar (0,2 ml) x (tiempo en horas))

  1. Examine los valores de actividad calculados para cada paso de tiempo. Determinar la actividad potencial final a partir de la etapa de tiempo con la actividad más alta. Si los valores de actividad siguen aumentando entonces pueden ser necesarias medidas de tiempo posteriores, si los valores de actividad caen througHout el transcurso de la carrera, a continuación, ejecute de nuevo con pasos de tiempo más cortos. Actividad final es en nmoles de sustrato consumido hr -1 ml -1, pero se puede escalar hasta expresar como micromoles hr -1 L -1.

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Representative Results

Los suelos y sedimentos acuáticos suelen tener niveles apreciables de actividad enzimática extracelular como resultado de las comunidades microbianas adjuntos (biofilms) que crecen en la superficie de las partículas. Figura 3 muestra cómo esta actividad cambia en función del tamaño de las partículas obtenidas del sedimento superficial de un tercer corriente de orden en el norte de Mississippi, EE.UU.. Un estudio previo ha demostrado que las comunidades bacterianas en las partículas de sedimento de esta corriente se pueden separar en tres grupos distintos basados ​​en el análisis molecular de su estructura de la comunidad: las partículas de 0,063 mm, los de 0,125, 0,25 y 0,5 mm de partículas, y los en 1 mm partıculas 15. Análisis de los patrones en la actividad enzimática extracelular apoya esta conclusión; con fosfatasa (figura 3A) es similar en 0,125, 0,25, y 0,5 mm de partículas, pero mucho más alto en las fracciones 1 y 0,063 mm cuando se mide utilizando la técnica de sustrato NP-ligado p. Other enzimas tales como β-glucosidasa (Figura 3B), y la NAGase (Figura 3C) muestran picos similares en las partículas más finas, pero no están elevados en partículas de 1 mm, destacando el hecho de que diferentes enzimas pueden mostrar diferentes distribuciones ambientales y estos pueden ser dilucidado utilizando este ensayo. Las barras de error relativamente bajos muestran que ensayos colorimétricos de la actividad enzimática en los sedimentos son reproducibles y por lo tanto susceptibles de análisis estadístico al comparar diferentes muestras ambientales.

Las aguas naturales tienden a tener menor actividad enzimática extracelular por ml de suelos o sedimentos hacen por g. Como tales, deben ensayarse fluorométricamente utilizando sustratos MUB enlaces-. Figura 4 muestra cómo la actividad de la fosfatasa enzimas (Figura 4A), β-glucosidasa (Figura 4B), y la NAGase (Figura 4C) varía con la profundidad en un lago de poca profundidad en el norte de Mississippi, EE.UU.A. El lago (Boondoggle Lake) es conocido por ser pobre en nutrientes 16, que también es sugerido por la relativamente alta actividad de la fosfatasa (figura 4A), una enzima que producen los microorganismos con el fin de adquirir el fosfato de los compuestos orgánicos. Para todos los tres de las enzimas ensayadas, las muestras recogidas en la superficie del agua (0 cm) y 50 cm de profundidad mostraron actividad similar, mientras que la actividad fue elevado en la muestra de 100 cm. Esta muestra fue tomada esencialmente a partir de la interfaz agua-sedimento, y la presencia de partículas de sedimento en la muestra probablemente explica la mayor actividad visto en esta muestra, especialmente para β-glucosidasa y la NAGase. Al igual que con los sustratos de la P NP, las barras de error muestran baja que, incluso con sólo tres lecturas repetidas, la reproducibilidad de los ensayos fluorométricos utilizando sustratos MUB es alta.

Tenga en cuenta que las unidades de la Figura 4 están en nmoles de sustrato consumidos mientras que los de la Figura 3son en moles de sustrato consumido, a pesar de que el tamaño de la unidad por es comparable (ya sea por ml o por g). Esto pone de relieve el hecho de que los suelos y los sedimentos tienden a tener mucho mayor actividad extracelular de aguas naturales (las actividades de cada enzima específica en la Figura 3 son aproximadamente de 10-100x más alto que las actividades de la enzima equivalente en la Figura 4). También demuestra el aumento de la sensibilidad de la técnica de sustrato MUB-ligado, y la necesidad de utilizar esta técnica para ensayar la actividad de la enzima extracelular en muestras de agua.

Figura 1
Figura 1. Diseño sugerido de bloques de 96 pozos profundos y para el ensayo de la actividad enzimática extracelular en suelos o sedimentos utilizando las p colorimétricos NP-linked substrate técnica. Cada pocillo debe recibir un total de 300 l, compuestos de suspensión de la muestra, la solución de sustrato, o tampón de acetato dependiendo de si se trata de una muestra de ejecución, el control de la muestra, o de control del sustrato.

Figura 2
Figura 2. Diseño sugerido de 96 pocillos negro microplacas para el ensayo de la actividad enzimática extracelular en muestras de agua utilizando la técnica de sustrato MUB vinculado-fluorométrico. Nueve muestras se pueden organizar verticalmente en la placa (A) ocupando cada uno ocho pozos. Estos ocho pozos se utilizan para carreras de ejemplo, controles de la muestra, y apagan los controles mientras que los pozos restantes se utilizan para los controles de sustrato y normas MUB (B).

Figura 3 Figura 3. Actividad enzimática extracelular en diferentes tamaños de partículas de sedimentos superficiales recogidas de un pequeño arroyo en el norte de Mississippi, EE.UU.. Cada fracción de tamaño de partícula se ensayó para la actividad de la fosfatasa (A), β-glucosidasa (B), y la NAGase (C) tras la p-NP sustrato procedimiento colorimétrico. La actividad se informó en micromoles de sustrato consumido -1 hr g de peso seco de sedimento -1 y es la media (+ SE) de tres lecturas repetidas por fracción de tamaño de partícula.

Figura 4
Figura 4. Actividad enzimática extracelular en el agua tomada en tres diferentes profundidades (0, 50, y 100 cm) a partir de un lago de poca profundidad en el norte de Mississippi, EE.UU.. agua se ensayó para la actividad de la fosfatasa (A), β-glucosidasa (B), y la NAGase (C) después de la MUB-sustrato procedimiento fluorométrico. La actividad se informó en nmoles de sustrato consumidos h -1 ml de agua -1 y es la media (+ SE) de tres lecturas repetidas por muestra.

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Discussion

La determinación de la actividad de una variedad de enzimas extracelulares microbianas en suelos y sedimentos puede proporcionar información útil sobre las tasas de mineralización de nutrientes y de procesamiento de materia orgánica 17. Sin embargo, los suelos pueden varían en sus niveles de humedad, por lo que es importante normalizar la actividad de peso en seco del suelo. Esto requiere una etapa de secado adicional (normalmente dos días) más allá de la simple medición de la actividad enzimática. Por lo tanto, en contraste con los ensayos de actividad enzimática en muestras de agua que proporcionan resultados casi instantáneos, ensayos fiables de la actividad de la enzima en el suelo y los sedimentos toman unos pocos días. Para algunos suelos, incluso puede ser más adecuado a la actividad por gramo de materia orgánica o libre de cenizas masa seca expresar, lo que requiere un paso adicional de incineración (por lo general 2 horas a 500 ° C) más allá del proceso de secado. Independientemente, el paso más crítico en el ensayo colorimétrico de la actividad enzimática del suelo o sedimento es la retirada del sobrenadante desde el bloque de pozo profundo fespués de centrifugación al final del periodo de incubación. Debido a que este procedimiento se basa en la medición de la absorbancia, incluso la presencia de un par de partículas de suelo perdidas en la microplaca final puede dar lugar a resultados falsos. Velocidades de centrifugado más altas (> 5.000 xg) podría ayudar a mitigar este problema, pero en nuestros rotores de centrifugación experiencia que aceptan microplacas general tienen límites de rotación por debajo de este umbral, y de los propios bloques no puede tolerar velocidades mucho más altas. Esencialmente, este paso de pipeteado en particular requiere una combinación de la atención y la velocidad de usar una pipeta de múltiples canales para transferir rápidamente la cantidad requerida de sobrenadante desde el bloque de pozo profundo de la microplaca.

Los ensayos de actividad de la enzima extracelular en muestras de agua no tienen ni la necesidad de un período de secado ni la etapa de centrifugación, este último debido a que tanto la reacción enzima-sustrato y la medición de la fluorescencia del producto final se producen en la misma microplaca. Como tal, estos unssays suelen ser más rápidas y en un principio puede parecer más fácil de ejecutar. Sin embargo, tienen sus propias limitaciones en que, siempre que sea posible, el estándar MUB y sustratos MUB vinculados no deben ser expuestos a la luz. En nuestra experiencia, bajando las luces tanto un posible durante el pipeteado e incubando las microplacas en la oscuridad (o cubierta con una tapa opaca) es una necesidad. Debido a que estos ensayos también requieren las placas para ser leído en múltiples puntos de tiempo, esto a menudo resulta en la necesidad de conmutación muy rápida entre las placas cuando el ensayo de múltiples enzimas en el mismo tiempo. Por ejemplo, con el fin de ensayar nueve muestras de agua para la actividad de seis enzimas simultáneamente (es decir, utilizando seis diferentes microplacas), se hace necesario para leer una placa cada 2 min durante 1 h con el fin de asegurarse de que cada placa individual se leyó cada 10 -15 min (en este caso, cada 12 min). Se debe tener cuidado de no perder de la placa de concreto que se lea, así como para garantizar que no se derrama líquido from la placa, ya que se transfiere dentro y fuera de la fluorómetro de microplacas. Cuando el ensayo de múltiples enzimas a la vez, también es importante tener en cuenta el tiempo que toma para que el lector de microplacas a leer realmente el plato y escalonar la lectura de intervalos como corresponde. Una preocupación final con el ensayo de fluorescencia de la actividad enzimática extracelular en muestras de agua es cuando se trabaja con muestras que son turbias. Las muestras de agua que contienen partículas en suspensión debe agitarse antes de verter inicialmente en el depósito de la pipeta y mezclar de nuevo mediante la retirada y expulsión con la pipeta antes de ser embarcados en la microplaca. Los números más altos de partículas en una muestra también típicamente resulta en un mayor enfriamiento de la señal fluorescente, y la importancia de los controles de enfriamiento para cada muestra no se puede enfatizar lo suficiente.

Mientras sustratos y MUB p vinculados-NP suelen mostrar valores máximos similares V para las enzimas del medio ambiente, los valores de Kmpueden ser diferentes, y enzimas como la β-glucosidasas y fosfatasas pueden tener una mayor afinidad por los sustratos MUB vinculados que sus NP-linked análogos p 14. Por lo tanto, los sustratos MUB vinculados es probable que sean más sensibles que los vinculados a la p NP, lo que sugiere que sería una mejor opción a utilizar en la medición de la actividad enzimática en suelos y sedimentos. Sin embargo, el producto final fluorogénico que se mide durante los ensayos MUB está sujeto a potencial de extinción en algunos extractos de suelo, y las lecturas de fluorescencia puede ser inestable en el tiempo 12. Suelos y sedimentos también tienden a tener una mayor actividad de la enzima extracelular de las aguas naturales, por lo que el aumento de la sensibilidad de los ensayos MUB vinculados fluorométricas pueden ofrecer pocas ventajas sobre los métodos colorimétricos p NP dados los problemas potenciales con temple al analizar ciertos suelos. Como nota al margen, los sustratos NP-linked p y la norma p NP sí son generalmente más affordable que sus contrapartes MUB; una razón adicional para su uso si se aplican restricciones presupuestarias.

Tal vez el aspecto más importante de ser capaz de analizar la actividad enzimática microbiana extracelular en ambientes acuáticos y terrestres es que mientras estas técnicas miden procesos fisiológicos microbianos, estos procesos tienen una influencia directa sobre las transformaciones a nivel de ecosistemas de carbono y nutrientes. Las tasas de descomposición de la materia orgánica se han vinculado directamente a la actividad de celulasas extracelulares en los sedimentos 18,19, por lo que las mediciones rápidas de la actividad de la enzima potencialmente facilitar la determinación de la instantánea en las tasas de descomposición in situ en muestras ambientales. Utilizando enfoques altos de la microplaca rendimiento permite la medición simultánea de la actividad de la enzima en un mayor número de muestras que los enfoques más típicos solo tubo, de modo que la variación en la actividad enzimática (y, por extensión, en los procesos de nivel de ecosistema) en respOnse a factores tales como la profundidad 20 o perturbaciones ambientales 9,21 puede ser examinado. Del mismo modo, los ensayos de enzimas que intervienen en el ciclo de nutrientes, tales como la fosfatasa y la NAGase, pueden proporcionar ideas sobre la limitación de nutrientes en entornos específicos, por ejemplo, la importancia relativa de fósforo orgánico en nitrógeno orgánico durante el desarrollo del suelo 8.

Debido a que las actividades enzimáticas se midieron en muestras ambientales de más de treinta años, las comparaciones entre los estudios que utilizaron los metanálisis avanzados se están convirtiendo en posible. Estos estudios sugieren que, en las tasas de descomposición de la materia orgánica y la mineralización de nutrientes a escala global, la actividad enzimática y, por tanto, están vinculados con el pH, la disponibilidad de sustrato, y la estequiometría de nutrientes 17. Al mismo tiempo, el uso de un protocolo basado en una microplaca ha comenzado a permitir el análisis de patrones de escala fina en la actividad enzimática utilizando técnicas de mapeo geoestadísticos 22

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

La financiación de los aspectos de este trabajo fue proporcionada por diversas fuentes, incluyendo el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos del Acuerdo de Cooperación Específico 58-6408-1-595 y la Fundación Nacional de Ciencia (premio 1.049.911).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS AND MATERIALS
Glacial acetic acid Various suppliers
Sodium acetate Various suppliers
Sodium hydroxide Various suppliers
p-Nitrophenol Fisher BP612-1 Alternates available
p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate Sigma N3234 pNP-substrate
pNP-β-glucopyranoside Sigma N7006 pNP-substrate
pNP-β-N-acetylglucosaminide Sigma N9376 pNP-substrate
Clear 96-well microplates Fisher 12-563-301 Alternates available
96-well deep well blocks Costar 3958 Alternates available
Aluminum weigh pans Various suppliers
Sterile 15 ml centrifuge tubes Various suppliers
Sterile 50 ml centrifuge tubes Various suppliers
4-Methylumbelliferone Sigma M1381
4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate Sigma M8883 MUB-substrate
4-MUB-glucopyranoside Sigma M3633 MUB-substrate
4-MUB-N-acetylglucosaminide Sigma M2133 MUB-substrate
Sodium bicarbonate Various suppliers
Black 96-well microplate Costar 3792
Pipette reservoir Various suppliers
EQUIPMENT
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge rotor Eppendorf A-4-81 For microplates/deep-well blocks
Microplate reader BioTek Synergy HT Alternates available
Microplate fluorometer BioTek FLx 800 Alternates available
8-channel pipettor Various suppliers

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References

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