Fastsettelse av Transport Valuta xenobiotics og nanomaterialer over placenta ved hjelp
1Department of Obstetrics, Perinatal Pharmacology, University Hospital Zurich, 2Laboratory for Materials - Biology Interactions, EMPA Swiss Federal Laboratories for Materials Testing and Research, 3Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Den

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Grafmüller, S., Manser, P., Krug, H. F., Wick, P., von Mandach, U. Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model. J. Vis. Exp. (76), e50401, doi:10.3791/50401 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Tiår siden den menneskelige morkaken var tenkt å være en ugjennomtrengelig barriere mellom mor og ufødte barn. Men oppdagelsen av thalidomid-induserte misdannelser og mange senere studier etterpå beviste det motsatte. I dag flere skadelige xenobiotics som nikotin, ble heroin, metadon eller narkotika samt miljøgifter beskrevet å overvinne denne barrieren. Med den økende bruk av nanoteknologi, er placenta som kan komme i kontakt med nye nanopartikler enten ved et uhell eller med vilje ved eksponering i tilfelle av mulige nanomedical anvendelser. Data fra dyreforsøk kan ikke ekstrapoleres til mennesker fordi morkaken er den mest artsspesifikke pattedyr organ en. Derfor, den ex vivo dual resirkulerende human placental perfusjon, utviklet av Panigel et al. 1967 2 og kontinuerlig modifisert av Schneider et al. 1972 3, kan tjene som en utmerket modell to studere overføring av xenobiotics eller partikler.

Her fokuserer vi på ex vivo dual resirkuleringsanlegg menneskelig placentaperfusjon protokollen og dens videre utvikling for å skaffe reproduserbare resultater.

Den placentae ble innhentet etter informert samtykke fra mødre fra ukompliserte sikt svangerskap gjennomgår keisersnitt. De foster eller mor fartøy av en intakt cotyledon ble kanylert og perfused minst fem timer. Som en modell partikkel fluorescensmerkede polystyren-partikler med størrelser på 80 og 500 nm i diameter ble tilsatt til den maternal krets. De 80 nm-partiklene var i stand til å krysse placenta, og gir et godt eksempel på et stoff som blir overført over placenta til fosteret mens de 500 nm partikler ble beholdt i placenta-vev eller mors krets. Den ex vivo menneskelig placentaperfusjon modellen er en av få modeller som gir pålitelig informasjon omtransport oppførselen til xenobiotics på et viktig vev barriere som leverer prediktive og klinisk relevante data.

Introduction

Placenta er et komplekst organ, som er ansvarlig for utveksling av oksygen, karbondioksyd, næringsstoffer og avfallsprodukter og samtidig i stand til å holde de to blod kretser av mor og foster den voksende skilt fra hverandre. I tillegg hindrer det avvisning av barnet ved mors immunsystem og utskiller hormoner for å opprettholde svangerskapet. Den cellulære barrieren er dannet av de cytotrophoblast celler som smelter og danner en sann syncytium uten sideveis cellemembraner 4,5. Hele placenta er organisert i flere cotyledons, som inneholder en fetal villøse treet og representerer en funksjonell enhet av morkaken.

Studiet av placenta funksjonen ble intensivert med oppdagelsen av thalidomid induserte misdannelser i 1960. Av åpenbare grunner translokasjon studier med gravide kvinner ikke kan utføres. Derfor har ulike alternative modeller er utviklet 6,7 ex vivo menneskelig placentaperfusjon modell utviklet av Panigel og medarbeidere 2,3.

Mange kvinner er utsatt for ulike xenobiotics som narkotika eller miljøgifter under svangerskapet 8. For noen stoffer som allerede var administrert regelmessig under svangerskapet, kan in vivo studier utføres ved sammenligning av morens blod konsentrasjon med det i navlestrengsblod. Men generelt er det bare begrenset informasjon om farmakokinetikk og-dynamikk hos fosteret og teratogenisiteten av disse stoffene.

For eksempel opiater som heroin lett krysser placenta og kan føre til intrauterin veksthemning, prematur fødsel eller spontan abort 9,10. Så, i tilfelle av manglende avholdenhet under svangerskapet en substitusjonsbehandling med metadon anbefales. Exvivo human placentaperfusjon modell viste at overføringen av metadon inn i fosterets sirkulasjon er ubetydelig 11, som korrelerer godt med den beregnede ledningen blod-til-mors blod konsentrasjon forholdet etter levering 12..

Nanoteknologi er et voksende felt, spesielt i medisin. Så, under den naturlig forekommende fine (<2,5 pm i diameter) og ultrafine partikler (<0,1 pm i diameter) i røyk av skogbranner, vulkan utbrudd og i ørken støv, eksponering mot konstruert nanomaterialer (minst en dimensjon <0,1 pm 13 ) er økende. Dette reiste spørsmål om toksikologiske potensialet av konstruerte nanomaterialer. Selv om ingen menneskelig fare kunne bevises ennå, er det viktigste eksperimentelle studier som indikerer at nanopartikler kan forårsake uønskede biologiske responser som fører til toksikologiske utfall 14. Nylig, indikerte noen studier at prenatal eksponering forluftforurensning er koblet til en høyere respiratorisk nød og luftveisinflammasjon hos nyfødte og barn 15,16. I tillegg kan små nanopartikler brukes som medikament bærere til spesifikt å behandle enten fosteret eller moren. Derfor blir det tydelig at omfattende studier av forskjellige xenobiotics eller nanomaterialer og deres evne til å krysse placenta er påkrevd. En faktisk oversikt over aktuelle studier på placenta permeabilitet til konstruert nanomaterialer er oppsummert i Menezes et al. 2011 17 og Buerki-Thurnherr et al. 2012 7.

Den ex vivo dual resirkulerende humant placentaperfusjon modellen gir en kontrollert og pålitelig system for å studere det placental transport av forskjellige endogene og eksogene forbindelser 3,11,12,18,19 og en rekke andre funksjoner i placenta lignende mekanismer som er ansvarlige for den utvikling av patologiske tilstander som preeklampsi <sup> 20-22. I denne protokollen fokuserer vi hovedsakelig på settet opp, håndtering og metode som gjør at studiet av akkumulering, effekter og translokasjon priser på et bredt sett av xenobiotics, nanopartikler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Klargjøre Perfusjonssystem

  1. Sett opp perfusjon system som består av et vannbad, en perfusjon kammer, to kolonner for oksygenering, to peristaltiske pumper, to boble feller, to flyt varmeovner og en trykksensor (figur 1). Koble disse komponentene med rørseksjoner sammensatt av silikon og polyvinylklorid materialer ifølge skjema i figur 2. Endelig er det to kretser som representerer fosterets og mors krets, henholdsvis.
  2. Slå på vannbad, flyten ovner og oppvarming for perfusjon kammeret. Temperaturen bør være 37 ° C.
  3. Varm opp perfusjon medium (NCTC-135 vevskulturmedium fortynnet 1:02 med Earles buffer (6,8 g / l natriumklorid, 0,4 g / l kaliumklorid, 0,14 g / L mononatrium-fosfat, 0.2 g / l magnesium-sulfat, 0,2 g / l kalsiumklorid, 2 g / L glukose) supplementert med glukose (1 g / L), dekstran 40 (10 g / L), bovint serumalbumin (10 g/ L), natrium-heparin (2500 IU / L), amoxicilline (250 mg / l) og natrium-bikarbonat (2,2 g / l), pH 7,4) i vannbadet.
  4. Fortløpende skyll den arterielle systemer av fosterets og mors krets med) 200 ml destillert vann, b) 50 ml 1% natriumhydroksid, c) 1% fosforsyre og d) igjen 200 ml destillert vann (flow rate: 15 - 20 ml / min).
  5. Koble fosterets kanyle (Ø 1,2 mm, butt nål skal være knyttet til en modifisert bevinget nål infusjonssett) til fosterets arteriell slangen.
  6. Skyll den arterielle systemer av fosterets og mors krets med perfusjon medium før alle rørene inneholder medium (flow rate: 15-20 ml / min). Under dette trinnet fylle opp boblen feller og fjerne alle bobler nedstrøms fra fellen. Deretter stopper pumpene. Det er veldig viktig at de afferente arterielle rør er alltid fri for bobler, ellers etter kanylering spesielt de fine fosterets fartøy kan sprekke.
  7. Skru på gass-strømmen. Mors kretsen er oksygenrikt with 5% karbondioksyd og 95% syntetisk luft og fosterets krets med 5% karbondioksyd og 95% nitrogen.
  8. Start opptaket av trykkføleren.

2. Kanylerør den Placenta

  1. Skaff intakt placentae fra ukompliserte sikt svangerskap etter primær keisersnitt. Skriftlig samtykke må gis (er innhentet i tilfelle av våre studier) av mødrene før levering og studien må godkjennes av den lokale etiske komité (var tilfelle i våre studier). Først visuell kontroll skal utføres av jordmødre å sikre en sunn og intakt placenta.
  2. Kanylering av morkaken er et kritisk punkt! Under perfusjon enhver liten forstyrrelse i vevet kan føre til en lekkasje mellom mor og foster sirkulasjon. Morkaken må hentes innen 30 min etter levering.
  3. Velg en intakt cotyledon ved den marginale sone av placenta uten synlige forstyrrelser på mors side. På chorionic plate,binder opp både knyttet grener av umbilical arterie og vene oppstrøms til senere kanylering side (mot navlestreng) ved hjelp av kirurgisk sutur materiale. Gjør alltid to knop.
  4. Cannulate fetal lunge først. Fosterets placenta arteries er alltid mindre og tynnere enn venene.
  5. Lag en sutur rundt fosterets lunge, men ikke knytte det opp umiddelbart. Hold fartøyet med en tang, klipp fartøyet nøye og sette liten kanyle (Ø 1,2 mm) i arterien. Deretter binde opp sutur (to knop).
  6. Fortsett med fosterets blodåre på samme måte, men bruker en større kanyle (Ø 1,5-1,8 mm, butt nål skal være knyttet til en modifisert bevinget nål infusjonssett).
  7. Slå på føtal pumpen (2 ml / min). Hvis det ikke er noen synlig lekkasje og blod springer ut av fosterets vene kanyle, sakte øke flyten opp til 4 ml / min. Observere trykket i fetal lunge, bør den ikke overstige 70 mm Hg. Hvis lekker ut på fosterets eller kompisrnal kanyle fest dem med en annen sutur.
  8. Plasser morkaken på tissue holder med fosterets side opp og trekk placenta membran og vev over toppene. Til slutt perfusjon cotyledon bør være i midten av hullet i vevet holderen.
  9. Stabilisere den delen der bare membranen holder morkaken med en silikon membran (Ø 1 mm) eller alternativt to parafilm stykker.
  10. Sett sammen tissue holder, stram skruene og kutte overhengende vev. Vær oppmerksom på at venøse og arterielle kanyler er ikke klemt, men i stedet lå i de små kanalene i vev holderen.
  11. Snu tissue holder opp ned, sette den inn i perfusjon kammer og legge dekselet. Nå bør den mors side være på toppen. Sjekk alltid om fosterets kretsen er fortsatt intakt og mediet strømmer ut av fosterets vein slangen.
  12. Slå på morens pumpen (12 ml / min.) Introdusere de tre sløv kanyler (Ø 0,8 mm) på the slutten av morens arterie slangen inn i intervillous plass ved å trenge inn i deciduale plate. For å returnere perfusatet til morens kretsen sette ett rør som venøs renne som er også forbundet med den maternal pumpen til den laveste posisjon i den øvre delen av kammeret perfusjon.
  13. Koble fosterets vene kanyle til fosterets vein tube.

3. Gjennomføre Pre-and Experimental fase av Perfusjons

  1. Å tillate vevet å gjenopprette fra iskemisk perioden etter levering, og for å skylle ut blod i intervillous plass, er et åpent pre-fasen av 20 min nødvendig. Det betyr at mors og fosterets vene ikke fører tilbake til den arterielle reservoaret inneholder perfusjon medium. Samle fosterets og mors venøs utstrømning i en flaske og kast den etter pre-fasen.
  2. For å vurdere integriteten av perfusjonen utføre en annen før-fase på 20 minutter, men i en lukket krets. Bruk to separate reservoarer med perfusjon mediumfor fosterets og mors krets og lukke kretsen av ledende fosterets venøs utstrømning tilbake i fosterstilling reservoaret og mors venøs utstrømning tilbake i mors reservoaret.
  3. For de viktigste perfusjon eksperiment forberede to flasker med 120 ml perfusjon medium (en for mors og ett for fosterets reservoar). Legg radiomerket 14 C-antipyrin (4 NCI / ml; fungerer som positiv kontroll; FORSIKTIG: radioaktivt stoff) og fluorescensmerkede xenobiotic eller nanopartikler som man ønsker å analysere i mors reservoaret. Bland mors perfusate godt.
  4. Starte forsøket ved å utveksle den rene perfusjon medium med de to preparerte kolber (foster eller mor reservoarer). Lukke kretsen av ledende fosterets venøs utstrømning tilbake i fosterstilling reservoaret og mors venøs utstrømning tilbake i mors reservoaret.
  5. Fortsett perfusjon for 6 timer og ta prøver regelmessig. Alltid resuspender medium i fosterstilling og morsreservoaret før uttak.
  6. Regulere trykket i fetal arterien (bør ikke overstige 70 mm Hg), pH i begge kretser (bør være i en fysiologiske området 7,2-7,4) og volumet av begge reservoarer (føtalt volumtap bør ikke overskride 4 ml / time) i løpet av perfusjon . Om nødvendig justeres pH-verdiene ved bruk av enten saltsyre eller natriumhydroksyd.
  7. Hvis volumet tap i fosterstilling reservoaret overstiger 4 ml / t det er en lekkasje i vevet, og man må stoppe perfusjon. Suksessrate på en perfusjon for 6 timer uten lekkasje er ca 15-20%.
  8. Stopp perfusjon etter 6 timer. Slå ut pumpene, vannbad, flow varmeovner og gass flyt.
  9. Fjern morkaken fra vevet holder, kutte perfused cotyledon (lysere enn unperfused vev) og veie det.
  10. Ta prøver fra unperfused (del av placenta, som ble kuttet i begynnelsen av, kan som allerede er tatt i løpet av den før-fase) og perfusjon vev (hver omtrent 1 g) og lagre dem ved -20 ° Cinntil homogenisering eller i flytende nitrogen for senere analyse. Fikse en annen vevsprøve i 4% formalin for histopatologisk evaluering. Prøvene skal omfatte alle lag av morkaken.
  11. Rens rørene etter perfusjon ved suksessivt å skylle den arterielle systemer av fosterets og morens krets med a) 200 ml destillert vann, b) 50 ml 1%-ig natriumhydroksyd, c) 50 ml 1% fosforsyre og d) en gang til 200 ml destillert vann (strømning: 15-20 ml / min).

Hele arbeidet prosedyren placenta perfusjon eksperimentet er vist i figur 3..

4. Analysere Samples

  1. Sentrifuger perfusatet prøvene i 10 min ved 800 x g før analyse for fjerning av resterende erytrocytter. Ta supernatanten til videre analyse. Prøvene kan stå over natten ved 4 ° C. For analyse av leptin og hCG produksjon kan prøvene lagres ved -20 ° C.
  2. For å evaluere permeabiliteten iplacenta analysere den 14 C-antipyrin ved væskescintillasjon. Bland 300 ul av fosterets og morens prøver med 3 ml scintillasjonscocktail og måle i 5 min i en betateller.
  3. For å vurdere overføring av fluorescerende nanopartikler eller xenobiotic av interesse lese fluorescens ved 485 nm eksitasjon og 528 nm utslipp i en mikroplateleser (indikert bølgelengder er for analyse av gul grønn etikett som vi brukte for nanopartikler).
  4. Å bestemme levedyktigheten til placenta vev under perfusjon måle glukose forbruk og laktat produksjon i fosterstilling og mors krets med en automatisert blod gass system. I tillegg evaluere produksjon av human placental hormoner choriongonadotropin (hCG) og leptin i det homogeniserte vevsprøver og perfusates ved hjelp av enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 4A viser profilene perfusjon av små polystyren-partikler (80 nm), som ble transportert over placenta sammenlignet med større polystyren-partikler (500 nm) som ikke ble overført til fosterets met. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittlig partikkel-konsentrasjonen til det gitte tidspunkt av minst tre uavhengige eksperimenter. For polystyren nanopartikler overgang i placenta er størrelse-avhengige 19. Etter tre timers av placenta perfusjon allerede 20-30% av opprinnelig lagt 80 nm polystyren partikler ble overført fra mors til fosterets krets, mens 500 nm polystyren partikler ikke ble vist i fosterstilling kretsen selv etter seks timer av perfusjon. Ikke desto mindre er den maternal konsentrasjonen av de 500 nm partikler avtagende. Fluorescens bilder på histologisk seksjon av vevet etter perfusjon viste at partiklene akkumuleres i tarmtottene av placenta (data ikke vist). Figur 4B 14C-antipyrin. Antipyrin som en liten lipofile molekylet er fordelt over placenta via passiv diffusjon og fungerer som kontroll for integriteten av kretsene. Etter 4-6 timer av perfusjon en likevekt mellom fosterets og mors antipyrin konsentrasjon bør bygges 23. Å vurdere og sammenligne placenta transport rate av xenobiotics fosterets til mors narkotika konsentrasjon (F / M) forholdet er vanligvis vises (figur 5).

Gjennom analyse av laktat-og placenta-hormon (humant choriongonadotropin og leptin) produksjon, så vel som glukose forbruk levedyktighet og funksjonaliteten av placental vev under perfusjonen kunne følges (figur 6). Verdiene for perfusjoner med xenobiotic bør alltid være i det samme området som verdiene fra kontroll perfusjon uten xenobiotic. I tillegg histop athological evaluering av perfusjon placenta-vev kan utføres. En sammenligning med ikke-perfusjon placental vev kan deretter avsløre patologiske endringer som følge av perfusjon (for eksempel bakteriell forurensning), og derfor kan tjene som en kvalitetskontroll-parameter.

Ytterligere representative resultater oppnådd med ex vivo dual resirkuleringsanlegg menneskelig placentaperfusjon modellen ble publisert nylig 11,19.

Figur 1
Figur 1. Ex vivo menneskelig placentaperfusjon oppsett. 1) Vann bad med mor og foster reservoarer, 2) perfusjon kammer, 3) boble felle, 4) oksygenator kolonner, og 5) flyt varmeapparat.

load/50401/50401fig2.jpg "/>
Figur 2. Skjematisk illustrasjon av ex vivo menneskelig placentaperfusjon modell FA: fetal lunge; FV:. Fosterets vene, MA: mors arterien; MV: mors vene; BT: boble felle; PS: trykksensor

Figur 3
Figur 3. Arbeider prosedyre av en ex vivo menneskelig placentaperfusjon eksperiment. Etter levering morkaken må kanylert innen 30 min. Før 6 hr eksperimentelle fase med resirkulasjon en åpen pre-fase og lukkede pre-fase bør utføres i minst 20 min hver.

Figur 4
Figur 4. Perfusjon profiler av polystyren partikler og 14 </ Sup> C-antipyrin 19.. Perfusjon profil av polystyrenpartikler i størrelsene 80 nm (n = 4) og 500 nm (n = 3). Utgangspunktet 25 ug / ml partikler og 4.2 NCI / ml 14 C-antipyrin ble tilsatt til den maternal krets. Mengden av partikler (A) og 14 C-antipyrin (B), ble målt i de maternale (M, faste symboler) og føtalt (F, åpent symbol) kretser etter indikerte tidspunkter. Som vises, er den gjennomsnittlige konsentrasjonen ± SE. Klikk her for å se større figur .

Figur 5
Figur 5. Størrelse-avhengige overføring av polystyren partikler over den menneskelige placenta 19. Forholdet mellom foster eller mor konsentrasjoner av 14 C-antipyrin og polystyren partiklene var calculated etter 180 minutter av placenta perfusjon. Dataene representerer middelverdien ± SE av minst tre uavhengige eksperimenter. Kontrollen kolonnen viser perfusjoner uten partikler, men med 14 C-antipyrin. (* P <0,05 sammenlignet med 80 nm forholdet verdi).

Figur 6
Figur 6. Levedyktighet av placenta-vev i løpet av 19 perfusjon. (A) Glukose forbruk og laktatproduksjon i perfusjon placenta. Vises er summen av endringer i total innhold i kretsene (foster og mors) over tid delt på vekten av perfused cotyledon. (B) Normalisert netto produksjon (NP delt innledende vev innhold T0) av placenta hormoner human choriongonadotropin og leptin. Dataene representerer middelverdien ± SE av ved løst tre uavhengige eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Under dual resirkuleringsanlegg perfusjon viste her, er det flere andre eksperimentelle som er mulig avhengig av spørsmålet som må besvares. Spesielt åpne placenta perfusjoner blir ofte brukt til å vurdere stoffet clearance ved steady-state konsentrasjon tre. Den resirkulerende perfusjon set-up kan også anvendes for å bekrefte aktiv transport av endogene eller eksogene substanser. For denne tilnærmingen samme konsentrasjon av xenobiotic må legges til mors og fosterets sirkulasjon. Antatt at det er aktiv transport mot konsentrasjonsgradienten, kan akkumulering av forsøksstoffet i enten et av de kretsene som observeres 24. Av notatet, er tillegg av forsøksstoffet bare til fosterets kretsen også mulig og kan avsløre mekanismen for transport over placenta av dette spesielle stoffet 25.

Protokollen har utviklet seg over time og kan variere mellom ulike forskningsgrupper spesielt om flow rate, sammensetningen av perfusjon medium, form av oksygenering og oppvarming 26,27. Spesielt strømningshastighet kan påvirke tidspunktet for når transplacentale overføringen skjer. For å kontrollere dette, er i tillegg en passivt transportert referanseforbindelse som antipyrin viktig. Overføringshastigheten av xenobiotic kan alltid sammenlignet med overføringshastighet på antipyrin (F / M ratio bør være over 0.75) 26. Siden antipyrin overføringen er hovedsakelig begrenset av strømningen og utveksling overflate, tar denne sammenligning forskjeller i flyt og størrelsen på den perfusjon cotyledon i betraktning som kan variere mellom forsøkene. I tillegg kunne FITC-dekstran bli tilsatt til fosterets krets for å tjene som kontroll for integriteten til barrieren 26. Fetal volumtap er også brukt som markør for barriere integritet. Vanligvis en fetal væsketap opptil 4 ml / t er tillatt 28, menre er ingen allment akseptert grense.

Selvfølgelig er det noen ulemper ved ex vivo menneskelig placentaperfusjon metode som inter-individuelle variasjoner og en lav suksessrate (15-20%). Videre kan en perfusjon periode på 6 hr ikke simulere en kronisk behandling og kan derfor ikke helt utelukke overføring av en xenobiotic etter lang tids eksponering. En annen begrensning i modellen er at hovedsakelig transplacental overføring på sikt vurderes mens transport hastigheten tidlig svangerskapsdiabetes aldre når bommen er tykkere gjenstår fortsatt ukjent. Faktisk er perfusjon av første trimester placentae mulig, men tilgjengeligheten av disse placentae er ganske begrenset. Likevel, inntil nå ex vivo placentaperfusjon metoden er den eneste modellen for å studere transport av ulike xenobiotics, nanopartikler i organiserte menneskelige placenta vev. Mens toxicodynamics i ex vivo human perfusjon modell kan analyseres bare i PLacental vev, kan dyreforsøk faktisk også gi informasjon om embryotoksisitet. Skjønt, på grunn av de anatomiske forskjeller i placenta barrieren mellom mennesker og gnagere disse resultatene ikke kan overføres til mennesker 4,5. En annen mulighet til å undersøke transplacental overføring kan være cellekultur modeller som primære cytotrophoblasts, choriocarcinoma cellelinjer, isolerte plasma membran blemmer eller placenta vev eksplantater 29. Den mest brukte modellen er BeWo cellelinje; disse cellene er avledet fra en ondartet svangerskapsdiabetes choriokarsinom og kan danne et konfluent monolag på en permeabel membran, slik at transport-studier kan utføres. Resultatene av transport studier der bruk av BeWo cellemodell korrelerer godt med resultatene oppnådd i ex vivo menneskelig placentaperfusjon 30. Imidlertid, for å studere hver detalj medikament transport (f.eks bidraget av en bestemt transport-protein) og metabolisme, kan BeWo cellemodell være mmalm mulig først og fremst fordi den er lettere å håndtere og utsatt for manipulering som ekspresjon av genetisk endrede transportører eller enzymer, men som gjelder generelle medikament heller ikke observert påliteligheten av denne modellen er begrenset. Det mangler blodstrøm og integriteten til monolaget må vurderes nøye, da det avhenger av flere faktorer som cellekultur forhold, seeding tetthet, eksponeringstid og membranen insert 6,29.

Ulike xenobiotics og også nanopartikler binder seg til ulike plasmaproteiner som i betydelig grad kan påvirke transplacental overføring 31, vurderer den binding til plasmaproteiner er derfor viktig. Den perfusjon medium inneholder bovint serumalbumin, den hyppigste plasmaprotein. Nylig viste en studie at overføringen prosenter av ulike stoffer oppnås med ex vivo menneskelig placentaperfusjon modellen korrelerer godt med in vivo ledningen blod til mødreblod konsentrasjonsforholdene Når overføringen forholdstall ble justert i henhold til omfanget av plasmaproteinbinding 12.

Totalt sett er ex vivo placentaperfusjon modell en gyldig og pålitelig metode for å studere transport over human placenta og forutsi in vivo transplacental passasje av xenobiotics og nanopartikler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgements

Dette arbeidet er støttet av den sveitsiske National Foundation, (NRP 64-programmet, gir ingen 4064-131232).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NCTC-135 medium ICN Biomedicals, Inc. 10-911-22C could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769)
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich, Fluka 71381
Potassium chloride (KCl) Hospital pharmacy also possible: Sigma (P9541)
Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O) Merck 106346
Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O) Sigma-Aldrich, Fluka 63139
Calcium chloride (CaCl, anhydrous) Merck 102388
D(+) Glucose (anhydrous) Sigma-Aldrich, Fluka 49138
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck 106329
Dextran from Leuconostoc spp. Sigma-Aldrich 31389
Bovine serum albumin (BSA) Applichem A1391
Amoxicilline (Clamoxyl) GlaxoSmithKline AG 2021101A
Sodium heparin B. Braun Medical AG 3511014
Sodium hydoxide (NaOH) pellets Merck 106498 CAUTION: corrosive
Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4) Merck 100573 CAUTION: corrosive
Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2 PanGas AG
Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2 PanGas AG
Antipyrine (N-methyl-14C) American Radiolabeled Chemicals, Inc. ARC 0108-50 μCi CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol)
Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus) Zinsser Analytic GmbH 1003100
Polystyrene particles 80 nm Polyscience, Inc. 17150
Polystyrene particles 500 nm Polyscience, Inc. 17152
EQUIPMENT
Water bath VWR 462-7001
Thermostat IKA-Werke GmbH Co. KG 3164000
Peristaltic pumps Ismatec ISM 833
Bubble traps (glass) UNI-GLAS Laborbedarf
Flow heater UNI-GLAS Laborbedarf
Pressure sensor + Software for analyses MSR Electronics GmbH 145B5
Notebook Hewlett Packard
Miniature gas exchange oxygenator Living Systems Instrumentation LSI-OXR
Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm) Ismatec MF0028
Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm) Ismatec SC0744
Blunt cannulae ( 0.8 mm) Polymed Medical Center 03.592.81
Blunt cannulae ( 1.2 mm) Polymed Medical Center 03.592.90
Blunt cannulae ( 1.5 mm) Polymed Medical Center 03.592.94
Blunt cannulae ( 1.8 mm) Polymed Medical Center 03.952.82
Parafilm VWR 291-1212
Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass) Internal technical department Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK
Surgical suture material (PremiCron) B. Braun Medical AG C0026005
Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly) Hospira, Inc. ASN 2102
Multidirectional stopcock (Discofix C-3) B. Braun Medical AG 16494C
Surgical scissors B. Braun Medical AG BC304R
Dissecting scissors B. Braun Medical AG BC162R
Needle holder B. Braun Medical AG BM200R
Dissecting forceps B. Braun Medical AG BD215R
Automated blood gas system Radiometer Medical ApS ABL800 FLEX
Multi-mode microplate reader BioTek Synergy HT
Liquid scintillation analyzer GMI, Inc. Packard Tri-Carb 2200
Scintillation tubes 5.5 ml Zinsser Analytic GmbH 3020001
Tissue Homogenizer OMNI, Inc. TH-220
pH meter + electrode VWR 662-2779

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ala-Kokko, T. I., Myllynen, P., Vahakangas, K. Ex vivo perfusion of the human placental cotyledon: implications for anesthetic pharmacology. Int. J. Obstet. Anesth. 9, 26-38 (2000).
  2. Panigel, M., Pascaud, M., Brun, J. L. Radioangiographic study of circulation in the villi and intervillous space of isolated human placental cotyledon kept viable by perfusion. J. Physiol. (Paris). 59, 277 (1967).
  3. Schneider, H., Panigel, M., Dancis, J. Transfer across the perfused human placenta of antipyrine, sodium and leucine. Am. J. Obstet. Gynecol. 114, 822-828 (1972).
  4. Enders, A. C., Blankenship, T. N. Comparative placental structure. Adv. Drug Deliv. Rev. 38, 3-15 (1999).
  5. Takata, K., Hirano, H. Mechanism of glucose transport across the human and rat placental barrier: a review. Microsc. Res. Tech. 38, 145-152 (1997).
  6. Saunders, M. Transplacental transport of nanomaterials. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 1, 671-684 (2009).
  7. Buerki-Thurnherr, T., von Mandach, U., Wick, P. Knocking at the door of the unborn child: engineered nanoparticles at the human placental barrier. Swiss Med. Wkly. 142, w13559 (2012).
  8. Gendron, M. P., Martin, B., Oraichi, D., Berard, A. Health care providers' requests to Teratogen Information Services on medication use during pregnancy and lactation. Eur. J. Clin. Pharmacol. 65, 523-531 (2009).
  9. Burns, L., Mattick, R. P., Lim, K., Wallace, C. Methadone in pregnancy: treatment retention and neonatal outcomes. Addiction. 102, 264-270 (2007).
  10. von Mandach, U. Drug use in pregnancy. Ther. Umsch. 62, 29-35 (2005).
  11. Malek, A., Obrist, C., Wenzinger, S., von Mandach, U. The impact of cocaine and heroin on the placental transfer of methadone. Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 61 (2009).
  12. Hutson, J. R., Garcia-Bournissen, F., Davis, A., Koren, G. The human placental perfusion model: a systematic review and development of a model to predict in vivo transfer of therapeutic drugs. Clin. Pharmacol. Ther. 90, 67-76 (2011).
  13. International Organization for Standardization (ISO). Technical Specification (ISO/TS) 27687. Nanotechnologies – Terminology and definitions for nano-objects – Nanoparticles, nanofibre and nanoplate. (2008).
  14. Pietroiusti, A. Health implications of engineered nanomaterials. Nanoscale. 4, 1231-1247 (2012).
  15. Latzin, P., Roosli, M., Huss, A., Kuehni, C. E., Frey, U. Air pollution during pregnancy and lung function in newborns: a birth cohort study. Eur. Respir. J. 33, 594-603 (2009).
  16. Lacasana, M., Esplugues, A., Ballester, F. Exposure to ambient air pollution and prenatal and early childhood health effects. Eur. J. Epidemiol. 20, 183-199 (2005).
  17. Menezes, V., Malek, A., Keelan, J. A. Nanoparticulate drug delivery in pregnancy: placental passage and fetal exposure. Curr. Pharm. Biotechnol. 12, 731-742 (2011).
  18. Muhlemann, K., Menegus, M. A., Miller, R. K. Cytomegalovirus in the perfused human term placenta in vitro. Placenta. 16, 367-373 (1995).
  19. Wick, P., et al. Barrier capacity of human placenta for nanosized materials. Environ. Health Perspect. 118, 432-436 (2010).
  20. Dancis, J. Why perfuse the human placenta. Contrib Gynecol. Obstet. 13, 1-4 (1985).
  21. May, K., et al. Perfusion of human placenta with hemoglobin introduces preeclampsia-like injuries that are prevented by alpha1-microglobulin. Placenta. 32, 323-332 (2011).
  22. Guller, S., et al. Protein composition of microparticles shed from human placenta during placental perfusion: Potential role in angiogenesis and fibrinolysis in preeclampsia. Placenta. 32, 63-69 (2011).
  23. Challier, J. C. Criteria for evaluating perfusion experiments and presentation of results. Contrib. Gynecol. Obstet. 13, 32-39 (1985).
  24. Kraemer, J., Klein, J., Lubetsky, A., Koren, G. Perfusion studies of glyburide transfer across the human placenta: implications for fetal safety. Am. J. Obstet. Gynecol. 195, 270-274 (2006).
  25. leal, J. K., et al. Modification of fetal plasma amino acid composition by placental amino acid exchangers in vitro. J. Physiol. 582, 871-882 (2007).
  26. athiesen, L., et al. Quality assessment of a placental perfusion protocol. Reprod. Toxicol. 30, 138-146 (2010).
  27. Myllynen, P., et al. Preliminary interlaboratory comparison of the ex vivo dual human placental perfusion system. Reprod Toxicol. 30, 94-102 (2010).
  28. Malek, A., Sager, R., Schneider, H. Maternal-fetal transport of immunoglobulin G and its subclasses during the third trimester of human pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 32, 8-14 (1994).
  29. Prouillac, C., Lecoeur, S. The role of the placenta in fetal exposure to xenobiotics: importance of membrane transporters and human models for transfer studies. Drug Metab. Dispos. 38, 1623-1635 (2010).
  30. Poulsen, M. S., Rytting, E., Mose, T., Knudsen, L. E. Modeling placental transport: correlation of in vitro BeWo cell permeability and ex vivo human placental perfusion. Toxicol. In Vitro. 23, 1380-1386 (2009).
  31. Mathiesen, L., Rytting, E., Mose, T., Knudsen, L. E. Transport of benzo[alpha]pyrene in the dually perfused human placenta perfusion model: effect of albumin in the perfusion medium. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 105, 181-187 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics