Определение Rapid высокую пропускную способность Амилоза в сублимированного образцов клубней картофеля

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Этот протокол описывает высокая через положить колориметрическим методом, который опирается на формирование комплекса между йодом и цепей молекул глюкозы в крахмал. Йод образует комплексы с обеих амилозы и длинных цепей внутри амилопектина. После добавления йода в образце крахмала, максимальное поглощение амилозы и амилопектина происходит при 620 и 550 нм, соответственно. Соотношение амилозы / амилопектина можно оценить из соотношения значений абсорбции нм 620 и 550 и их сравнения со стандартной кривой, при которых определенные известные концентрации показаны в зависимости от значений поглощения. Такая высокая пропускная способность, недорогой метод является надежным и воспроизводимым, позволяя оценку крупных популяций клонов картофеля.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fajardo, D., Jayanty, S. S., Jansky, S. H. Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples. J. Vis. Exp. (80), e50407, doi:10.3791/50407 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Этот протокол описывает высокая через положить колориметрическим методом, который опирается на формирование комплекса между йодом и цепей молекул глюкозы в крахмал. Йод образует комплексы с обеих амилозы и длинных цепей внутри амилопектина. После добавления йода в образце крахмала, максимальное поглощение амилозы и амилопектина происходит при 620 и 550 нм, соответственно. Соотношение амилозы / амилопектина можно оценить из соотношения значений абсорбции нм 620 и 550 и их сравнения со стандартной кривой, при которых определенные известные концентрации показаны в зависимости от значений поглощения. Такая высокая пропускная способность, недорогой метод является надежным и воспроизводимым, позволяя оценку крупных популяций клонов картофеля.

Introduction

Приблизительно 80% свежего веса клубней картофеля является вода, почти все из оставшегося сухого вещества составляет крахмал 1. Большинство из крахмала (70%) состоит из амилопектина, а остаток амилозы. Соотношение между амилозы и амилопектина является наиболее важным свойством влияния на физические свойства крахмала. Амилоза представляет собой линейный альфа 1-4 цепь глюкозы, а амилопектин представляет собой линейный альфа 1-4 цепь с альфа 1-6 ветвей 2. Методы, такие как йод связывания, дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC), размер высокая производительность эксклюзионной хроматографии (HPSEC) и взаимодействия конканавалином были разработаны для определения крахмала в различных видов культур 3,4. Каждый протокол требует специальных навыков и оборудования, что делает его трудно расширить количественно многочисленные образцы одновременно. Метод, который мы приводим здесь представляет собой модифицированный протокол от Hovenkamp-Hermelink др.. 5, которая является двойной йода волны связыванияМетод, основанный на окрашенных гранул крахмала. Преимущества этого метода по сравнению с другими включать определение амилозы от исходного крахмала без его очистки и использование системы двойной длины волны, чтобы увеличить точность метода 4,6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Амилоза Определение от клубня картофеля крахмала

  1. Очистить и нарезать свежие клубни мелкими кубиками.
  2. Поместите картофель кубиками в небольших коричневых сумок и хранить в течение ночи при -80 ° С
  3. Трансфер картофельные кубики на нейлоновые мешки и сублимационной сушки.
  4. После сублимационной сушке, растереть картофельную образец в порошок с помощью ступки и пестика или Wiley Mill.
  5. В 50 мл пробирку, добавляют 20-30 мг лиофилизированного, первый клубней образца.
  6. Готовят раствор 45% (вес / объем) хлорной кислоты (смесь 24,4 мл 60%-ной хлорной кислоты и 25,6 мл сверхчистой воды.
  7. Добавить 500 мкл 45% (вес / объем) хлорной кислоты и взбалтывать или его разгона крахмальных зерен.
  8. После четырех минут инкубационного периода при комнатной температуре, добавить 16 мл сверхчистой воды к раствору и перемешать с помощью встряхивания.
  9. После не-растворимый материал осела на дно пробирки (7-10 мин позже), передать 40 мкл раствора на планшет для микротитрования (избегая пипетирования любых частиц).
  10. Добавить 50 мкл раствора йода (2 г KI + 1 г I 2 в 900 мл сверхчистой воды) и перемешать образец с помощью пипетки.
  11. Считайте абсорбцию при 550 нм и 620 нм сразу.
  12. Определить процент амилозы после сравнения отношения амилоза / амилопектина каждого образца (620 нм абсорбции nm/550) с стандартной кривой, полученной из амилозы и амилопектина растворах при диапазоне концентраций. Эта процедура будет описана ниже. Читайте пустой (раствор йода и хлорной кислоты), а также испытываемых образцов. Использование отображаться данные для анализа.

2. Амилоза / амилопектина Кривая

  1. В отдельные пробирки весить 12,5 мг из амилозы и 12,5 мг амилопектина.
  2. Добавить в каждую пробирку 5 мл 45% (вес / объем) хлорной кислоты и полного растворения.
  3. Для каждого из растворов (амилозы и амилопектина), довести до конечного объема 50 мл сверхчистой воды.
  4. Смешайте 6,25мл амилозы складе с предыдущей стадии с 18,75 мл сверхчистой воды. Это сделает решение амилозы 6,25 мг / мл.
  5. Повторите процедуру для амилопектинового решения.
  6. Использование амилозы и амилопектина стандартных растворов с шагом 2,4 и 2,5, готовят процентов амилозы стандарты, которые 0-100% амилозы (100-0% амилопектина) до конечного объема 5 мл чтобы создать стандартную кривую в 10% интервалами.
    Например, приготовить:
    0% амилозы / 100% стандарт амилопектина, пипетки 5 мл амилопектина решение.
    10% амилозы / 90% стандартной амилопектина, объединить 0,5 мл амилозу и 4,5 мл амилопектина решения.
    20% амилозы / 80% стандартной амилопектина, объединить 1,0 мл амилозу и 4,0 мл амилопектина решения.
    30% амилозы / 70% стандартной амилопектина, объединить 1,5 мл амилозу и 3,5 мл амилопектина решения.
    40% амилозы / 60% стандарт амилопектин, комбинировать 2,0 мл амилозы и амилопектина 2,0 мл растворов.
    50% амилозы/ 50% стандартной амилопектина, объединить 2,5 мл амилозу и 2,5 мл амилопектина решения.
    60% амилозы / 40% стандарт амилопектин, комбинировать 3,0 мл амилозы и амилопектина 2,0 мл, и так далее).
  7. Передача 40 мкл каждого стандартного смеси планшета для микротитрования. Включите также с 40 мкл 45% (вес / объем) хлорной кислоты в качестве заготовки.
  8. Добавить 50 мкл раствора йода (2 г KI + 1 г I 2 в 900 мл сверхчистой воды) и перемешать каждый образец (включая заготовки) с помощью пипетки.
  9. Читайте абсорбцию при 550 нм и 620 нм сразу и рассчитать соотношение амилозы / амилопектина для каждой концентрации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Стандартная кривая построена с очищенных данных различных решений концентрационных амилозы / амилопектина показывает приблизительные коэффициенты абсорбции, начиная от 0,7 до 1,6 (табл. 1). Линейной регрессии тенденция по этим данным в дальнейшем используется для выведения содержание амилозы в лиофильно-высушенных образцов картофеля (рис. 1).

Среда завод имеет некоторое влияние на содержание амилозы в картофельного клубня 7. Реплицируемые определения содержания амилозы в двух разных местах поля показали низкий разброс между клубней картофеля (табл. 2). Пигменты в цветных плоти картофеля, похоже, не влияет на определение амилозы анализа.

% Амилоза решение 1 550 нм поглощение 620 нм поглощение Соотношение 2 620 nm/550 нм
0 0.223 0,156 0.700
10 0.225 0.181 0,804
20 0.221 0.203 0.919
30 0.220 0.219 0.995
40 0.223 0,246 1.103
60 0.216 0.280 1.296
70 0.231 0.319 1.381
90 0.225 0.347 1.542
100 0.219 0.357 1.630

Таблица 1. Отношения между концентрацией амилозы и отношение поглощения (620 nm/550 нм) Коэффициент поглощения. Против процентов амилозы изображен на рисунке 1 </ STRONG> для определения амилозы 1. Процент раствор амилозы был изготовлен из амилозы и амилопектина маточных растворов при различных концентрациях 2. Расчетное соотношение с очищенных данных поглощения при 620 нм и 550 нм.

Сорт Loc 550 нм 620 нм Соотношение Амилоза%
Адирондак Синий 1 1.86 1.78 0.955 25.5
2 2.28 2.15 0.946 24.4
Рано Роуз 1 2.17 2.12 0.977 27.8
2 2.22 2.14 0,967 26,7
FreЕдома коричневый 1 1.99 1.92 0.965 26.5
2 1.98 1.93 0.973 27.4
Золото инков 1 1.95 2.00 1.021 32.6
2 2.27 2.28 1.004 30.7
Рейнджер коричневый 1 1.88 1.84 0.975 27.6
2 2.15 2.08 0,967 26,7
Коричневый Norkotah 1 1.84 1.79 0.972 27.3
2 1.90 1.86 0.975 27.6
Сноуден 1 2.23 2.13 0.956 25.5
2 1.64 1.61 0.979 28.0
White Pearl 1 2.32 2.28 0.986 28.7
2 2.22 2.18 0.983 28.5

Таблица 2. Реплицированные оценка содержания амилозы в сортов картофеля из двух разных местах производственных поле (LOC).

Рисунок 1
Рисунок 1. Амилоза концентрация стандарта кривая используется для вывода процентное содержание амилозы в клубнях картофеля.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Содержание амилозы в клубней картофеля обычно составляет от 20-35% 7,8. Если большинство значения вне этого диапазона, рассмотреть эти возможные ошибки: 1) необработанные данные были использованы вместо отображаться данные для построения калибровочной кривой амилозы / амилопектина, 2) необработанные данные были использованы вместо отображаться данные для определения амилозы / амилопектин отношения из картофеля образцов; или 3) вода, используемая для анализа не был достаточно чистым. Мы заметили, что с помощью дистиллированной воды и не ультра-чистую воду в анализе, полученные значения не воспроизводились. Самый простой способ убедиться, что раствор йода готовится правильно, или если он по-прежнему слишком стар, чтобы использовать это, чтобы проверить, является ли исходное значение абсорбция бланка образца при 550 нм составляет около 0,1.

Точность в подготовке йода и амилопектина / амилозы решений имеет решающее значение для получения достоверных амилозы определения. Так мы определяем долю Эмитеряют содержание, а не точное количество амилозы в картофельного крахмала, нет стадия очистки для выделения чистого крахмала из картофеля порошок, как, представленную другими методами определения.

Для определения содержания амилозы в сортов картофеля, два независимых сублимированных клубни от каждого сорта были обработаны в каждой местности. Мы обнаружили, что вариация на содержание амилозы между клубней картофеля была небольшой (менее одного процента) и не имеет существенного значения.

Там не было разницы в определении содержания амилозы в результате первоначального количества картофельный крахмал, между 20-30 мг. За пределами этого диапазона, результаты стали ненадежны или не обнаруживается нашей ридере. Несмотря на то, Hovenkamp-Hermelink соавт. 5 показывают, добавляя объем воды, если образец слишком концентрированный, мы рекомендуем повторного взвешивания образца и повторив процедуру.

Это исследование изложеДанные НТС на основе белых конкретизированы картофеля. Кроме того, мы оценили этот метод с цветными плоти картофеля (желтого, красного и фиолетового). Нет вмешательство в йод / амилозы комплекса не было обнаружено. Однако, как и любой йода анализа связывания, содержание амилозы, вероятно, трудно переоценить несколько из-за связывания йода с прямыми цепями в молекулах амилопектина. Этот анализ предназначен для скрининга большого количества образцов. После того, как высокие лица амилозы определены, мы рекомендуем повторное тестирование с амилозы конкретных анализе, например, конканавалин A 9,10. Этот анализ является более дорогим и трудоемким, чем йода анализа связывания, но это более точно определяет уровней амилозы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgements

Финансирование для этого исследования была предоставлена ​​частично научный сотрудник программы USDA-ARS и Комитета Растениеводство зародышевой плазмы USDA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Amylose Sigma 859656
Amylopectin Sigma A8515
Perchloric Acid 60% Sigma 311413 Very hazardous to skin and eyes
Iodine Sigma 23214TD
Potassium iodide Sigma 08625JE
Equipment
Plate Reader Bio Tek ELx800

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Composition Hoover, R. molecular structure, and physicochemical properties of tuber and root starches: a review. Carbohydr. 45, (3), 253-267 (2001).
  2. Bertoft, E., Blennow, A. Structure of Potato Starch. Advances in Potato Chemistry and Technology. 1st ed, Elsevier Ltd. 83-98 (2009).
  3. Campbell, M. R., Yeager, H., Abdubek, N., Pollak, L., Glover, D. Comparison of methods for amylose screening in maize starches from exotic backgrounds. Cereal Chem. 79, 317-321 (2002).
  4. Zhu, T., Jackson, D. S., Wehling, R. L., Geera, B. Comparison of amylose determination methods and the development of a dual wavelength iodine binding technique. Cereal Chem. 85, 51-58 (2008).
  5. Hovenkamp-Hermelink, J., Devries, J., Adamse, P., Jacobsen, E., Witholt, B., Feenstra, W. Rapid estimation of the amylose amylopectin ratio in small amounts of tuber and leaf tissue of the potato. Potato Res. 31, 241-246 (1988).
  6. Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Genetics and Physiology of Starch Development. Starch. 3rd ed, Elsevier Inc. 23-82 (2009).
  7. Haase, N. U., Plate, J. Properties of potato starch in relation to varieties and environmental factors. Stärke. 48, (5), 167-171 (1996).
  8. Johnston, F. B., Urbas, B., Khanzada, G. Effect of storage on the size distribution and amylose/amylopectin ratio in potato starch granules. Am. Pot. J. 45, 315-321 (1968).
  9. Gibson, T. S., Solah, V. A., McCleary, B. V. A procedure to measure amylose in cereal starches and flours with concanavalin A. J. Cereal Sci. 25, (2), 111-119 (1997).
  10. Sun, S., Matheson, N., Yun, S. -H. Estimation of amylose content of starches after precipitation of amylopectin by concanavalin A. Starch. 42, 302-305 (1990).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics