快速高通量直链淀粉测定冻干马铃薯块茎样品

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

这个协议描述了通过一个依赖于碘和葡萄糖分子中淀粉的链之间的复合物的形成放比色法高。碘形成络合物与两个直链淀粉和支链淀粉中长链。加入碘的淀粉样品后,直链淀粉和支链淀粉的最大吸收出现在620和550nm处分别。直链淀粉/支链淀粉比例可以从620和550 nm处的吸光度值之比来估计并比较它们的标准曲线,其中特定的已知浓度作图的吸收值。这种高通量,廉价的方法可靠,重复性好,让土豆克隆的大量人口的评价。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fajardo, D., Jayanty, S. S., Jansky, S. H. Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples. J. Vis. Exp. (80), e50407, doi:10.3791/50407 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

这个协议描述了通过一个依赖于碘和葡萄糖分子中淀粉的链之间的复合物的形成放比色法高。碘形成络合物与两个直链淀粉和支链淀粉中长链。加入碘的淀粉样品后,直链淀粉和支链淀粉的最大吸收出现在620和550nm处分别。直链淀粉/支链淀粉比例可以从620和550 nm处的吸光度值之比来估计并比较它们的标准曲线,其中特定的已知浓度作图的吸收值。这种高通量,廉价的方法可靠,重复性好,让土豆克隆的大量人口的评价。

Introduction

约80%的马铃薯块茎鲜重的是水,几乎所有的剩余的干物质是淀粉1。大多数淀粉(70%)的组成的支链淀粉,而其余部分是直链淀粉。直链淀粉和支链淀粉的比例是影响淀粉的物理性能的最重要的属性。直链淀粉是直链α1-4葡萄糖链,而支链淀粉是直链α1-4链与α1-6分支2。方法如碘结合,差示扫描量热法(DSC),高效体积排阻色谱法(HPSEC)和刀豆蛋白A相互作用已经制定了在不同的作物种类3,4淀粉的决心。每个协议需要特殊的技能和装备,使其难以扩大量化各种样品的时间。我们在这里介绍的方法是从Hovenkamp-Hermelink 等人的 5修饰的协议,它是一种双波长碘结合方法基于染色淀粉粒。该方法的相对其他的优点,包括从生淀粉的直链淀粉测定无需纯化和使用的双波长系统中,以增加该方法4,6的精度。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1。从马铃薯块茎淀粉的直链淀粉测定

  1. 皮切新鲜块茎切成小方块。
  2. 将马铃薯立方体小的棕色袋子,并在-80过夜存放°C。
  3. 转移土豆立方体尼龙袋和冷冻干燥。
  4. 冷冻干燥后,用研钵和杵或Wiley磨磨土豆样品成粉末。
  5. 在50ml管中,加入20〜30毫克的冻干,地面块茎的样品。
  6. 制备45%的水溶液(重量/体积)高氯酸(混合24.4毫升的60%高氯酸和25.6毫升的超纯水。
  7. 加入500μl的45%(W / V)高氯酸和摇晃或转动它来驱散淀粉颗粒。
  8. 后在室温下4分钟的温育期间,将16毫升的超纯水到溶液中,并通过涡旋混合。
  9. 后非水溶性物质已结算到管的底部(7-10分钟后),转移40微升的溶液到微量滴定板的(避免任何颗粒的移液)。
  10. 加入50微升的碘溶液(2克碘化钾+1 g口2 900毫升的超纯水)和移液混合样本。
  11. 读取吸光度在550nm处,并立即620纳米。
  12. 每个样本的直链淀粉/支链淀粉比例(620 nm/550 nm的吸光度)与从直链淀粉和支链淀粉的溶液在一定浓度范围内的产生的标准曲线进行比较后确定的直链淀粉百分比。此过程将在下面说明。读出的空白(碘溶液和高氯酸)以及测试样品。使用空白数据的分析。

2。直链淀粉/支链淀粉曲线

  1. 在单独的管权衡直链淀粉12.5毫克和12.5毫克支链淀粉。
  2. 加至各管中加入5ml 45%(重量/体积)的高氯酸和完全溶解。
  3. 对每一种溶液(直链淀粉和支链淀粉)的,带至50ml用超纯水的最终体积。
  4. 混合6.25毫升直链淀粉的股票从上一步18.75毫升超纯水。这将使6.25毫克/毫升的直链淀粉的解决方案。
  5. 重复上述步骤,支链淀粉的解决方案。
  6. 使用从步骤2.4和2.5中直链淀粉和支链淀粉标准溶液,制备直链淀粉百分比标准,是0-100%直链淀粉(100-0%的支链淀粉),以5毫升,以创建在10%的时间间隔的标准曲线的最终体积。
    例如,为了准备:
    0%直链淀粉/ 100%支链淀粉标准,吸管5毫升支链淀粉的解决方案。
    10%的直链淀粉/ 90%支链淀粉标准,结合0.5毫升直链淀粉和4.5毫升支链淀粉的解决方案。
    20%的直链淀粉/ 80%支链淀粉标准,结合1.0毫升直链淀粉和4.0毫升支链淀粉的解决方案。
    30%的直链淀粉/ 70%支链淀粉标准,结合1.5毫升直链淀粉和3.5ml支链淀粉的解决方案。
    40%的直链淀粉/ 60%支链淀粉标准,结合2.0毫升直链淀粉和2.0ml的支链淀粉的解决方案。
    50%的直链淀粉/ 50%支链淀粉标准,结合2.5毫升直链淀粉和2.5ml支链淀粉的解决方案。
    60%的直链淀粉/ 40%的支链淀粉标准,结合3.0毫升直链淀粉和2.0ml的支链淀粉,等等)。
  7. 转移40微升每标准混合物中,在微量滴定板。包括一个井用40微升45%(重量/体积),高氯酸作为空白。
  8. 加50微升碘溶液(2克KI +1 g口2在900ml的超纯水)和通过移液混合各样品(包括空白)。
  9. 读取吸光度在550nm处,并立即为620nm,并计算出直链淀粉/支链淀粉比例对于每个浓度。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

从不同的直链淀粉/支链淀粉浓度溶液的空白数据构建的标准曲线显示了近似的吸光度比值介于0.7〜1.6( 表1)。从这些数据的线性回归趋势线以后用于推断冷冻干燥马铃薯样品中直链淀粉含量( 图1)。

该厂生产环境对在马铃薯块茎7的直链淀粉含量有一定的影响。在两个独立的外勤地点复制直链淀粉含量测定表明马铃薯块茎中低变化( 表2)。有色肉土豆颜料似乎并不影响直链淀粉测定法。

直链淀粉溶液1% 550 nm处的吸光度 620 nm处的吸光度 2 620 nm/550 nm处
0 0.223 0.156 0.700
10 0.225 0.181 0.804
20 0.221 0.203 0.919
30 0.220 0.219 0.995
40 0.223 0.246 1.103
60 0.216 0.280 1.296
70 0.231 0.319 1.381
90 0.225 0.347 1.542
100 0.219 0.357 1.630

表1。直链淀粉含量和吸收率(620 nm/550 nm)的关系。吸光度比值与直链淀粉百分比绘制在图1 </ STRONG>为直链淀粉测定1。百分比的直链淀粉溶液是由直链淀粉和支链淀粉的储备溶液在不同浓度2。从消隐数据计算比吸光度在620nm和550nm处。

品种 550 nm处 620纳米 直链淀粉%
阿迪朗达克蓝 1 1.86 1.78 0.955 25.5
2 2.28 2.15 0.946 24.4
早期的玫瑰 1 2.17 2.12 0.977 27.8
2 2.22 2.14 0.967 26.7
FRE以东黄褐色 1 1.99 1.92 0.965 26.5
2 1.98 1.93 0.973 27.4
印加黄金 1 1.95 2.00 1.021 32.6
2 2.27 2.28 1.004 30.7
游侠黄褐色 1 1.88 1.84 0.975 27.6
2 2.15 2.08 0.967 26.7
赤褐色Norkotah 1 1.84 1.79 0.972 27.3
2 1.90 1.86 0.975 27.6
斯诺登 1 2.23 2.13 0.956 25.5
2 1.64 1.61 0.979 28.0
白珍珠 1 2.32 2.28 0.986 28.7
2 2.22 2.18 0.983 28.5

表2。在两个不同领域的生产地点(LOC)的马铃薯品种直链淀粉含量复制的评价。

图1
图1的直链淀粉含量的标准曲线用于推断在马铃薯块茎中的直链淀粉百分含量。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

马铃薯块茎中直链淀粉含量一般为20-35%7,8。如果大部分值超出了这个范围,考虑这些可能的错误:1)原始数据被用来代替空白数据的直链淀粉/支链淀粉标准曲线的建设; 2)原始数据被用来代替空白数据的直链淀粉的测定/支链淀粉比例从马铃薯样品,或3)用于分析水不够纯净。我们注意到,通过使用蒸馏水和不超纯水在分析中,所获得的值分别为不可再现的。一个简单的方法来验证碘液正确处理,或者如果它仍然太旧,无法使用是检查空白样品在550nm处的吸光度原始值是否为0.1左右。

精度在碘和支链淀粉/直链淀粉溶液的制备是非常重要的获得可靠的直链淀粉测定。既然我们确定艾米的比例输的内容,而不是直链淀粉的马铃薯淀粉的确切的量,存在于从马铃薯粉纯淀粉作为提交的其他测定方法的分离没有纯化步骤。

对于马铃薯品种的直链淀粉含量的测定,两个独立的冷冻干燥从每个品种块茎在每个地方进行了处理。我们发现,该变化对马铃薯块茎之间的直链淀粉含量是小的(小于1个点),而不是显著。

有没有在直链淀粉含量测定无差异,由于马铃薯淀粉的初始确认金额之间20-30毫克。在此范围之外,结果变成不可靠或不可检测由我们的平板阅读器。即使Hovenkamp-Hermelink 等人的 5表明添加的水的体积,如果样品过于集中,我们建议重新称重样品,并重复该过程。

本研究预先选择的窗口基于白肉马铃薯NTS数据。此外,我们已经评估与彩色肉土豆(黄色,红色和紫色)​​这个方法。检测与碘/直链淀粉复杂的无干扰。然而,与任何碘结合测定,直链淀粉的比例可能有所由于碘的直链的支链淀粉分子的结合高估。该测定法用于筛选大量样品。一旦高直链淀粉个人确定,我们建议与直链淀粉的具体分析,如刀豆蛋白A 9,10重新测试。该测定是更昂贵的和劳动密集的比碘结合测定,但它更精确地确定的直链淀粉的水平。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

我们什么都没有透露。

Acknowledgements

由美国农业部研究员计划和美国农业部作物种质资源委员会部分提供了资助这项研究。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Amylose Sigma 859656
Amylopectin Sigma A8515
Perchloric Acid 60% Sigma 311413 Very hazardous to skin and eyes
Iodine Sigma 23214TD
Potassium iodide Sigma 08625JE
Equipment
Plate Reader Bio Tek ELx800

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Composition Hoover, R. molecular structure, and physicochemical properties of tuber and root starches: a review. Carbohydr. 45, (3), 253-267 (2001).
  2. Bertoft, E., Blennow, A. Structure of Potato Starch. Advances in Potato Chemistry and Technology. 1st ed, Elsevier Ltd. 83-98 (2009).
  3. Campbell, M. R., Yeager, H., Abdubek, N., Pollak, L., Glover, D. Comparison of methods for amylose screening in maize starches from exotic backgrounds. Cereal Chem. 79, 317-321 (2002).
  4. Zhu, T., Jackson, D. S., Wehling, R. L., Geera, B. Comparison of amylose determination methods and the development of a dual wavelength iodine binding technique. Cereal Chem. 85, 51-58 (2008).
  5. Hovenkamp-Hermelink, J., Devries, J., Adamse, P., Jacobsen, E., Witholt, B., Feenstra, W. Rapid estimation of the amylose amylopectin ratio in small amounts of tuber and leaf tissue of the potato. Potato Res. 31, 241-246 (1988).
  6. Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Genetics and Physiology of Starch Development. Starch. 3rd ed, Elsevier Inc. 23-82 (2009).
  7. Haase, N. U., Plate, J. Properties of potato starch in relation to varieties and environmental factors. Stärke. 48, (5), 167-171 (1996).
  8. Johnston, F. B., Urbas, B., Khanzada, G. Effect of storage on the size distribution and amylose/amylopectin ratio in potato starch granules. Am. Pot. J. 45, 315-321 (1968).
  9. Gibson, T. S., Solah, V. A., McCleary, B. V. A procedure to measure amylose in cereal starches and flours with concanavalin A. J. Cereal Sci. 25, (2), 111-119 (1997).
  10. Sun, S., Matheson, N., Yun, S. -H. Estimation of amylose content of starches after precipitation of amylopectin by concanavalin A. Starch. 42, 302-305 (1990).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics