Rapid høy gjennomstrømning Amylose Bestemmelse i Freeze Tørket potet Tuber Samples

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Denne protokollen beskriver en høy gjennom satt kolorimetrisk metode som baserer seg på dannelsen av et kompleks mellom jod og kjeder av glukose-molekyler i stivelse. Jod danner komplekser med både amylose og lange kjeder innen amylopektin. Etter tilsetning av jod til en stivelsesprøve, oppstår den maksimale absorpsjon av amylose og amylopektin ved 620 og 550 nm, hhv. Den amylose / amylopectin forholdet kan beregnes ut fra forholdet mellom 620 og 550 nm absorbans-verdier og sammenligner dem med en standardkurve hvor bestemte kjente konsentrasjoner er plottet mot absorpsjons-verdier. Denne høy gjennomstrømning, er billig metode pålitelig og reproduserbar, slik at evaluering av store populasjoner av potet kloner.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fajardo, D., Jayanty, S. S., Jansky, S. H. Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples. J. Vis. Exp. (80), e50407, doi:10.3791/50407 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Denne protokollen beskriver en høy gjennom satt kolorimetrisk metode som baserer seg på dannelsen av et kompleks mellom jod og kjeder av glukose-molekyler i stivelse. Jod danner komplekser med både amylose og lange kjeder innen amylopektin. Etter tilsetning av jod til en stivelsesprøve, oppstår den maksimale absorpsjon av amylose og amylopektin ved 620 og 550 nm, hhv. Den amylose / amylopectin forholdet kan beregnes ut fra forholdet mellom 620 og 550 nm absorbans-verdier og sammenligner dem med en standardkurve hvor bestemte kjente konsentrasjoner er plottet mot absorpsjons-verdier. Denne høy gjennomstrømning, er billig metode pålitelig og reproduserbar, slik at evaluering av store populasjoner av potet kloner.

Introduction

Omtrent 80% av den ferske vekt av en potet tuber er vann; nesten hele det resterende tørrstoffet er en stivelse. Mesteparten av stivelse (70%) består av amylopektin, mens resten er amylose. Forholdet mellom amylose og amylopektin er den viktigste egenskapen å påvirke de fysiske egenskaper av stivelse. Amylose er en lineær alfa 1-4 glukose-kjeden, mens amylopektin er en lineær alfa-kjede med 1-4 alfa 1-6 greiner 2. Metoder slik som jod binding, differensial scanning kalorimetri (DSC), høy ytelse gelfiltrerings-kromatografi (HPSEC), og Con A-vekselvirkninger er blitt utviklet for bestemmelse stivelse i forskjellige kornarter 3,4. Hver protokollen krever spesielle ferdigheter og utstyr, noe som gjør det vanskelig å skalere opp for å kvantifisere mange prøver på en gang. Fremgangsmåten presenterer vi her er en modifisert protokoll fra Hovenkamp-Hermelink et al. Fem, som er en dobbelt bølgelengde jod bindendemetode basert på farget stivelsesgranuler. Fordelene med denne fremgangsmåte versus andre inkluderer amylose bestemmelse av rå stivelse uten å rense det, og anvendelse av den dobbelt bølgelengde-systemet for å øke nøyaktigheten av fremgangsmåten 4,6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Amylose Fastsettelse fra Potato Tuber Stivelse

  1. Skrell og skjær ferske knollene i små terninger.
  2. Plasser potetterninger i små brune poser og lagre over natten ved -80 ° C.
  3. Overfør potetterninger til nylonposer og for frysetørring.
  4. Etter fryse tørket, slipe potet prøven til pulver ved hjelp av morter eller en Wiley Mill.
  5. I et 50 ml rør, tilsett 20 til 30 mg av den frysetørkede, første tuber prøven.
  6. Tilbered en løsning av 45% (vekt / volum) perklor-syre (blanding av 24,4 ml 60% perklorsyre og 25,6 ml av ultrarent vann.
  7. Til 500 ul av 45% (vekt / volum) perklor-syre og rist eller virvle det å dispergere stivelsesgranuler.
  8. Etter en fire-minutters inkubasjonstid ved romtemperatur, tilsett 16 ml ultrarent vann til løsningen, og bland ved virvling.
  9. Etter at ikke-løselige materiale har lagt seg på bunnen av røret (7-10 min senere), overfør 40 pl av løsningen på en mikrotiterplate (unngå pipettering av eventuelle partikler).
  10. Tilsett 50 ul jod-løsning (2 g KI + 1 g I 2 i 900 ml ultrarent vann) og blandes prøven ved pipettering.
  11. Les absorbansen ved 550 nm og 620 nm med en gang.
  12. Bestem amylose prosentdel etter sammen amylose / amylopectin forholdet av hver prøve (620 nm/550 nm) med en standardkurve dannet fra amylose-og amylopektin-løsninger ved en rekke konsentrasjoner. Denne fremgangsmåten vil bli beskrevet videre. Les emnet (jod-løsning og perklorsyre) sammen med testprøvene. Bruk blanket data for analysene.

2. Amylose / amylopektin Curve

  1. I separate rør veie 12,5 mg av amylose og 12,5 mg av amylopektin.
  2. Legg til hvert rør 5 ml av 45% (vekt / volum) perklor-syre og oppløses fullstendig.
  3. For hver av de løsninger (amylose og amylopektin), bringe til et sluttvolum på 50 ml med ultrarent vann.
  4. Bland 6,25ml av amylose lager fra forrige steg med 18,75 ml ultrarent vann. Dette vil gjøre en 6,25 mg / ml amylose-løsning.
  5. Gjenta fremgangsmåten for amylopektin løsning.
  6. Ved hjelp av amylose og amylopektin standardløsninger fra trinn 2,4 og 2,5, fremstille de prosent amylose-standarder som er 0-100% amylose (100-0% amylopektin) til et sluttvolum på 5 ml for å opprette standardkurven i 10%-intervaller.
    For eksempel, for å forberede:
    Den 0% amylose / 100% amylopektin standard, pipette 5 ml amylopektin løsning.
    Den 10% amylose / 90% amylopektin-standarden, kombinere 0,5 ml amylose og 4,5 ml amylopektin løsninger.
    Den 20% amylose / 80% amylopektin-standarden, kombinere 1,0 ml amylose og 4,0 ml amylopektin løsninger.
    Den 30% amylose / 70% amylopektin standard, kombinerer 1,5 ml amylose og 3,5 ml amylopektin løsninger.
    Den 40% amylose / 60% amylopektin-standarden, kombinere 2,0 ml amylose og 2,0 ml amylopektin løsninger.
    Den 50% amylose/ 50% amylopektin-standarden, kombinere 2,5 ml amylose og 2,5 ml amylopektin løsninger.
    Den 60% amylose / 40% amylopektin-standarden, kombinere 3,0 ml amylose og 2,0 ml amylopektin, og så videre).
  7. Overfør 40 pl av hver standard blandingen til en mikrotiterplate. Inkludere en brønn med 40 ul 45% (vekt / volum) perklor-syre som blindprøven.
  8. Tilsett 50 ul jod-løsning (2 g KI + 1 g I 2 i 900 ml ultrarent vann) og blande hver prøve (inkludert blanke) ved pipettering.
  9. Les absorbances på 550 nm og 620 nm umiddelbart og beregne amylose / amylopektin ratio for hver konsentrasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den standardkurve konstruert fra blanked data av forskjellig amylose / amylopectin konsentrasjons løsninger viser nøyaktig absorbans forhold varierende 0,7 til 1,6 (tabell 1). En lineær regresjon trendlinjen fra disse data blir senere brukt til å utlede amylose-innhold i frysetørket potetprøver (figur 1).

Anlegget produksjonsmiljø har noen effekt på amylose-innholdet i potet tuber 7. Replikeres amylose innhold bestemmelser i to separate felt steder viste lav variasjon blant potetknoller (tabell 2). Pigmenter i farget kjøtt poteter synes ikke å påvirke amylose besluttsomhet analysen.

% Amylose løsning 1 550 nm 620 nm Ratio 2 620 nm/550 nm
0 0.223 0.156 0.700
10 0.225 0.181 0.804
20 0.221 0.203 0.919
30 0.220 0.219 0.995
40 0.223 0.246 1.103
60 0.216 0.280 1.296
70 0.231 0.319 1,381
90 0.225 0.347 1,542
100 0.219 0.357 1.630

Tabell 1.. Forholdet mellom amylose konsentrasjon og absorbans-forhold (620 nm/550 nm). Absorbans ratio g. prosent amylose, er plottet i figur 1 </ Strong> for amylose besluttsomhet en. Prosentvis amylose-oppløsningen ble fremstilt av amylose-og amylopektin-stamløsninger ved forskjellige konsentrasjoner 2. Beregnet ratio fra blanket data absorbansene på 620 nm og 550 nm.

Sorten Loc 550 nm 620 nm Ratio Amylose%
Adirondack Blå 1 1,86 1,78 0.955 25.5
2 2,28 2,15 0,946 24,4
Tidlig Rose 1 2,17 2,12 0.977 27.8
2 2.22 2,14 0,967 26,7
FreEdom Russet 1 1,99 1,92 0.965 26.5
2 1,98 1,93 0,973 27.4
Inca Gold 1 1,95 2,00 1.021 32,6
2 2,27 2,28 1.004 30,7
Ranger Russet 1 1,88 1,84 0.975 27.6
2 2,15 2,08 0,967 26,7
Russet Norkotah 1 1,84 1,79 0,972 27.3
2 1,90 1,86 0.975 27.6
Snowden 1 2.23 2,13 0,956 25.5
2 1,64 1,61 0,979 28,0
White Pearl 1 2,32 2,28 0.986 28.7
2 2.22 2,18 0,983 28.5

Tabell 2. Replikert evaluering av amylose innhold i potetsorter fra to forskjellige felt produksjonssteder (LOC).

Figur 1
Figur 1. Amylose konsentrasjon standardkurve som brukes til å antyde amylose prosent innholdet i potetknoller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Amylose innhold i potetknoller typisk varierer fra 20-35% 7,8. Ved de fleste verdiene er utenfor dette området, bør disse mulige feil: 1) rådata ble brukt i stedet for glycerol data for bygging av amylose / amylopectin standardkurve, 2) rådata ble anvendt i stedet for glycerol data for bestemmelse av amylose / amylopektin forholdstall fra potetprøver, eller 3) vannet som brukes for analysen var ikke rent nok. Vi la merke til at ved å bruke destillert vann og ikke ultrarent vann i analysen, er verdiene som oppnås ikke var reproduserbare. En enkel måte å kontrollere at jod løsningen er forberedt på riktig måte, eller om det fortsatt er for gammel til å bli brukt er å sjekke om den rå absorbans verdien til blank prøven ved 550 nm er rundt 0,1.

Nøyaktighet ved fremstilling av jod og amylopektin / amylose-løsninger er avgjørende for å få pålitelige amylose bestemmelser. Siden vi skal avgjøre hvor stor andel av amymister innhold i stedet for den nøyaktige mengden av amylose i potetstivelse, er det ingen rensetrinn for isolering av ren stivelse fra potetpulver som fremstilt av andre bestemmelsesmetoder.

For fastsettelsen av amylose innholdet i potetsorter ble to uavhengige fryse tørket knoller fra hver sorten behandlet på hver lokalitet. Vi fant at variasjonen for amylose innhold mellom potetknoller var liten (mindre enn ett prosentpoeng) og ikke signifikant.

Det var ingen forskjell i amylose-innhold fastsetting på grunn av den begynnende mengde potetstivelse, mellom 20 til 30 mg. Utenfor dette området, ble resultatene upålitelig eller umulig å oppdage ved vår plateleser. Selv om Hovenkamp-Hermelink et al. Fem foreslå å legge til et volum av vann hvis prøven er for konsentrert, anbefaler vi reweighing prøven og gjenta prosedyren.

Denne studien presents data basert på hvite fleshed poteter. I tillegg har vi vurdert denne metoden med fargede kjøtt poteter (gul, rød og lilla). Ingen interferens med jod / amylose komplekset ble oppdaget. Imidlertid, som med en hvilken som helst jod-bindingsanalyse, er andelen av amylose sannsynlighet for å bli overestimert noe som følge av bindingen av jod for å rette kjeder i amylopektin molekyler. Denne analysen er beregnet for screening av store antall prøver. Når høy-amylose-personer er identifisert, anbefales det re-testing med et amylose-spesifikke assay, slik som concanavalin A 9,10. Denne analysen er mer kostbart og arbeidskrevende enn jod bindingsanalysen, men mer presist bestemmer amylose-nivåer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgements

Finansiering for denne forskningen ble gitt i del av USDA-ARS Forskning Associate Program og USDA Crop genmateriale komiteen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Amylose Sigma 859656
Amylopectin Sigma A8515
Perchloric Acid 60% Sigma 311413 Very hazardous to skin and eyes
Iodine Sigma 23214TD
Potassium iodide Sigma 08625JE
Equipment
Plate Reader Bio Tek ELx800

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Composition Hoover, R. molecular structure, and physicochemical properties of tuber and root starches: a review. Carbohydr. 45, (3), 253-267 (2001).
  2. Bertoft, E., Blennow, A. Structure of Potato Starch. Advances in Potato Chemistry and Technology. 1st ed, Elsevier Ltd. 83-98 (2009).
  3. Campbell, M. R., Yeager, H., Abdubek, N., Pollak, L., Glover, D. Comparison of methods for amylose screening in maize starches from exotic backgrounds. Cereal Chem. 79, 317-321 (2002).
  4. Zhu, T., Jackson, D. S., Wehling, R. L., Geera, B. Comparison of amylose determination methods and the development of a dual wavelength iodine binding technique. Cereal Chem. 85, 51-58 (2008).
  5. Hovenkamp-Hermelink, J., Devries, J., Adamse, P., Jacobsen, E., Witholt, B., Feenstra, W. Rapid estimation of the amylose amylopectin ratio in small amounts of tuber and leaf tissue of the potato. Potato Res. 31, 241-246 (1988).
  6. Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Genetics and Physiology of Starch Development. Starch. 3rd ed, Elsevier Inc. 23-82 (2009).
  7. Haase, N. U., Plate, J. Properties of potato starch in relation to varieties and environmental factors. Stärke. 48, (5), 167-171 (1996).
  8. Johnston, F. B., Urbas, B., Khanzada, G. Effect of storage on the size distribution and amylose/amylopectin ratio in potato starch granules. Am. Pot. J. 45, 315-321 (1968).
  9. Gibson, T. S., Solah, V. A., McCleary, B. V. A procedure to measure amylose in cereal starches and flours with concanavalin A. J. Cereal Sci. 25, (2), 111-119 (1997).
  10. Sun, S., Matheson, N., Yun, S. -H. Estimation of amylose content of starches after precipitation of amylopectin by concanavalin A. Starch. 42, 302-305 (1990).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics