쥐 중추 신경계에서 면역 조직 화학 분석 및 주변 림프절 조직 섹션

Neuroscience

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Adzemovic, M. Z., Zeitelhofer, M., Leisser, M., Köck, U., Kury, A., Olsson, T. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. J. Vis. Exp. (117), e50425, doi:10.3791/50425 (2016).

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Abstract

면역 조직 화학 (IHC)이 높은 특정 안정적이고 매력적인 단백질의 시각화를 제공합니다. IHC 기반의 빛깔 표지의 정확한 성능과 해석은 중추 신경계 (CNS) 등의 지방 함량이 높은 조직에서 목적 단백질 사이의 상호 관계를 평가하기 위해 사용될 때 특히 도전적이다.

우리의 프로토콜은 특히 쥐 CNS와 신경 염증에 의해 영향을받는 주변 림프절 (LN) 모두 구조 및 가용성 단백질의 검출을 위해 조정 된 표준 immunolabeling 기술의 정교화를 나타냅니다. 그럼에도 불구하고, 추가 수정하거나하지 않고, 우리의 프로토콜 가능성도 여기에 제시된 것보다 다른 기관과 종, 기타 관련 단백질 표적의 탐지를 위해 사용될 수있다.

Introduction

methylome, 사체 또는 프로테옴 수준에서 수행 분석 고급 높은 처리량의 사용에도 불구하고, 면역 염색은 조직 샘플, 세포 배양에 직접 단백질 검출 또는 세포 도말 검사의 황금 표준 남아있다. 지역화 / 배광 패턴을 계시하여 면역 조직 화학 (IHC)의 상대적인 비율과 목표 단백질의 지형적 상호 관계를 평가하고, 그들의 생물학적 활성을 나타낼 수있다. 따라서, IHC 널리 임상 연구 및 진단 목적, 예를 들면, 치료 평가 질병 메커니즘 동물 모델에서 기능적 표현형 변화 등의 연구에 활용

본질적 조직학, 병리학, 생화학 및 면역학을 포함 IHC 크게 형광 표지 된 항체는 감염된 조직 1 폐렴 구균 항원을 식별하기 위해 처음에 사용 된 1941 년 이후로 진행되었다. V휴대 제품과 IHC에 의해 구성 요소의 isualization은 특정 항원은 (Ag)에 대한 항체 (ABS)의 결합을 기반으로합니다. 형광 태그 된 항체를 사용하는 외에, 면역 반응은 2,3- 옥시다아제 또는 알칼리 포스 파타 아제와 같은 효소 (4)을 이용하여 가시화 될 수있다. 방사능 라벨자가 방사선 시각화하는 동안 또한, 콜로이드 금 항체 태그 (5)는 광학 및 전자 현미경 모두에 의해 특정 항원 항체 반응을 검출하기 위해 사용된다.

용 Ag-Ab의의 면역 직접 및 간접적 인 방법을 통해 검출 할 수있다. 직접적인 방법은 직접 차 애비 6 레이블 사용하기 때문에, 본질적으로 빠르고 간단합니다. 그러나, 감도 부족으로 심각한 간접 방법이 직접 사람에게 바람직하다. 두 단계 간접 검출 방법은 상기 제 7 층과 같은 기본 복근 향한 이차 복근 첫번째로, 표지되지 않은 기본 복근 및 표지 필요로한다.신호 증폭을 더 포함함으로써 달성 될 수 있으며, 효소 - 결합 급 순이 (세 단계 간접법) 보조 AB와 결합하는 것이다. 일반적으로 사용되는 간접 검출 방법은 아비딘 - 비오틴과 퍼 옥시 다제 - antiperoxidase (PAP)입니다. 대안 적으로, 알칼리성 포스파타제 antialkaline 포스파타제 (APAAP) 복합체 대신 PAP 방법을 사용할 수있다. 특히, 알칼리성 포스파타제 (AP) 방법은 immunoperoxidase 방법 4보다 더 민감한 것으로 나타납니다. 아비딘 - 비오틴 복합체 (ABC) 방법은 표지 아비딘 - 비오틴 복합체 (LAB) 중 하나와 함께 바이오틴 차 순이를 사용, 또는 스트렙 타비 딘 - 비오틴 복합체 (SLAB) 표지. 검출 감도는 상기 퍼 옥시다아제 또는 알칼리 포스 파타 아제 표지 아비딘 (8)를 포함함으로써 증가 될 수있다. 사용의 다른 검출 방법은 고분자 라벨, 타이 라민 증폭 및 면역 구름 원 9입니다. 특히, 다른 검출 방법은 동일한 조직에 다수의 Ag 검출을 위해 결합 될 수있다여기에 제시된 1978 4. 동시 이중 면역 염색에 처음보고 된 샘플은 각각, 퍼 옥시 다제 - 결합 및 AP 접합 이차 항체를 이용하여 포르말린 고정 된 파라핀 포매 쥐 CNS 및 LN 조직 절편에서 수행 하였다. 신호는 각각 (FB) APAAP 복잡한 3,3'- diaminobencidine (DAB) 색 원체 및 패스트 블루를 사용하여 시각화 하였다.

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Protocol

윤리 정책
본 연구는 실험 동물에 대한 스웨덴 국립 이사회와 유럽 공동체위원회 지침의 지침에 따라 수행되는 윤리적 허가에 따라 (6백9분의 86 / EEC)는 N338 / 09, N15 / 10 N65 / 10에 의해 승인 된 북한 스톡홀름 동물 윤리위원회.

1. 조직 준비

  1. 관류 및 고정
    1. 좌심실을 통하여 관류 transcardial 수행 이소 플루 란 동물을 마취. 0.1 M PBS (PFA)에 4 % 파라 포름 알데히드 다음 혈액 성분을 제거하기 위해 인산 완충 식염수 (PBS)와 혈관의 헹굼을 시작합니다.
    2. PFA에 침지하여 해부 뇌, 척수 및 말초 LN 조직을 흥분시키는. 4 ° C에서 24 시간 후, 추가 처리 할 때까지 4 ° C에서 PBS에 PFA에서 조직과 상점을 전송합니다. 또는 상업적 PBS에, 250 ml의의 S &에 9g의 NaCl을 용해# 246; rensen은 버퍼 750 ml의를 탈 이온수를 추가 (DH 2 O); 2.5 L의 DH 2 O.에서 HPO 2 PO 4 X 2H 2 O를 4 × 상반기 2 O 및 71.2 g 2 나 0.2 M 소렌슨 완충액 (pH 7.4) 용해 13.8 g의 NaH를 준비합니다
  2. 탈수 및 삽입
    1. 면도날을 사용하여 약 5 ㎜의 두께 부분으로 조직을 잘라.
    2. 크실렌 최종적 파라핀 (표 1) 다음에 조직 테크 VIP 진공 침투 프로세서 (에탄올의 농도 상승에 침수에 기초한 표준 절차를 사용하여 티슈 경화 처리 (탈수)을 시작합니다.
    3. 금형에 조직을 올려 놓고 "파라핀 블록"을 형성하기 위해 샘플 주위 유동 파라핀에 붓는다. 장기 보관은 실온 (RT)가 필요합니다. 그러나, 절편하기 전에, 하룻밤, 예를 들어, 4 ℃에서 (O / N) 블록을 냉각하기를 권장합니다.

2. 단면

  1. 칼에 걸쳐 앞뒤로 이동할 수 썰매 마이크로톰의 고정 홀더로 파라핀 블록을 배치합니다. 블록 및 마이크로톰 나이프 (즉, 칼의 형상에 따라, 또한 절단 속도 및 기법) 사이에 최적의 각도를 조정한다.
  2. 파라핀 블록에서 5 μm의 두께 단면 - 3 컷.
  3. 물 용기에 바로 절단 부분을 전송하고 유리 슬라이드에 물에서 연속적으로 마운트.
  4. 잔류 물과 잠재적 인 기포를 제거하기 위해 종이 타월에 대해 조심스럽게 장착 섹션을 누릅니다. 상업적으로 미리 접착 코팅 된 유리 슬라이드를 추천한다.
  5. 60 °의 C - 드라이 (50)에 난로에서 두 시간 동안 슬라이드를 장착.

3. 탈 파라핀 (재수 및 차단 내생 퍼 옥시 다제)

  1. 슬라이드는 자일 렌으로 2 배 빠져 (또는 자일 렌 대체XEM-200), 각 시간 15-20 '.
  2. 99 % 에탄올로 씻어.
  3. 내인성 퍼 옥시 다제 활성을 차단하기 위해, 0.25 %의 과산화수소를 함유하는 메탄올 용액 30 '에 대한 섹션을 배양한다.
  4. 수분 함량 (99 %, 70 % 증가하고, 증류수에서 끝나는 에탄올을 사용하여 재수 화를 계속한다.
  5. 커버 장착 될 때까지이 시점에서 섹션을 촉촉하게 유지해야 할 전표.

4. 항원 검색

  1. 작업을 준비하는 단계; 60 '(이 경우에는 EDTA의 pH 8.5 완충액) 항원 검색 용액 슬라이드 비등하는 찜통을 사용 (EDTA 완충액 원액 DH 2 O 50 ㎖에 용해시킨 1.21 g 트리스 및 0.37 g의 EDTA를 포함 47.5 ml의 DH 2 O) 용액의 희석 2.5ml를의 EDTA 원액.
  2. 약에 대한 RT에 슬라이드를 냉각. 1 시간 후, 3 린스 - 트리스와 배는 생리 식염수 (TBS, 사용 대안 PBS)를 0.05 M 트리스 0.15 M의 NaCl로 구성된 완충; pH를 7.5으로 조정 위스콘신일 염산. 또는 상업적 TBS를 사용합니다.

5. 비특이적 결합 부위를 차단

  1. , 비특이적 백그라운드 반응을 피하기 10 % 소 태아 혈청 (FCS) 및 90 % DAKO 완충액을 함유하는 차단 용액에 '30 RT에서 섹션을 배양.

6. 두 번 Immunolabeling : 기본 애비와 동시 배양

  1. 차단 솔루션 차 항체의 필요한 양을 희석 및 O / n를 4 ° C에서 품어. (1 ED1 : 1000) α-Cd68 또는 α-Iba1 (Aif1, 1 : 1000) 또는 α-Cd8α (황소 8; 1 : 200); 이중 면역 염색에 대한 α-에오 탁신 (300 일 Ccl11)를 ​​결합 .
  2. 슬라이드는 TBS 완충액으로 3 ~ 5 배 린스 (또는 10 배 희석 DAKO 버퍼를 사용한다).
  3. 차단 솔루션과 RT에 1 시간을 품어 : 이차 항체의 필요량 (200 바이오틴 안티 염소와 AP-복합 항 - 마우스, 모두 1) 희석.
  4. (우리를 TBS 버퍼와 5 배 - 슬라이드 3을 씻어대안 예 10 배) DAKO 버퍼를 희석시켰다.
  5. RT에서 1 시간 동안 블로킹 용액으로 희석하고 아비딘 - 고추 냉이 퍼 옥시 다제 착체 (HRP)와 함께 인큐베이션 슬라이드.
  6. 슬라이드 3 린스 - TBS 버퍼 (또는 10 배 희석 DAKO 버퍼를 사용)으로 5 배.

7. 시각화

  1. 바운드 AP 표지 이차 항체의 시각화
    1. 1 L의 DH 2 O 12.1 g의 트리스 용해시켜 0.1 M 트리스 HCl 완충액을 준비하고 염산을 이용하여 pH를 조절한다. 레바 미솔 1 M 용액을 제조하기 위해 동일한 트리스 -HCl 버퍼를 사용한다. DH 2 O.에서 갓 4 %에 NaNO 2 용액을 제조
    2. (37 (하나의 표준 유리 큐벳에 필요한 볼륨) 빠른 블루 (FB) 기판 유리 튜브 312.5 μL의 DMF에 6.25 mg의 나프톨-AS-MX-인산을 용해 및 사전 예열 50 ㎖로 저어 50 ㎖를 얻으려면 ° C) 트리스 - 염산 완충액. 312.5 ㎕의 2 N 염산 12.5 mg의 FB RR 소금을 용해하는 것은 처리장 이전의 312.5 μl를 추가4 %에 NaNO 2 용액은 적색 및 예열 트리스 - 염산 완충액 동일한 50 ㎖로 혼합 교반한다. 노란 액체가 분명해질 때까지 가볍게 흔들어 마지막으로 이전에 제조 된 1 M의 levamisole 용액 77 μl를 추가합니다. 여액의 혼합물을 수득하고, 유리 큐벳에 넣고 슬라이드 위에 붓는다.
    3. 37 ° C에서 배양을 시작하고 약 광학 현미경 하에서 공정을 개발하고 제어 할 수 있습니다. 매 15-30 분. 퍼지 온 경우, 새로운 혼합물로 FB 솔루션을 교체합니다.
    4. PBS 버퍼에이어서 TBS 버퍼 및 전송에 5 배 - 슬라이드 3을 씻어.
  2. 결합 된 바이오틴 이차 항체의 시각화
    1. DAB는 / H 2 O 2 49 ml의 PBS 1 ml의 DAB 원액 (1 ml의 PBS 당 25 mg을 DAB)을 희석하여 솔루션을 개발 준비합니다. 쏟아져 이전 섹션에 16.5 μL의 H 2 O 2 및 여과 액을 추가합니다.
    2. 침전 이마에 발색의 DAB의 전환n 개의 안료는 즉시 할 수 있습니다. (높은 배경을 높이고 특정 신호를 마스크 수 초 이상 배양에도 몇) 광 현미경 개발 프로세스를 제어 할 수 있습니다.
    3. 갈색 안료 석출물의 강도는 대안 적으로 '5 2 % 황산구리 및 0.9 % 염화나트륨 용액으로 이루어진 배양을 향상시킬 수있다.
    4. 슬라이드 3 린스 - PBS로 5 배 그리고 마지막으로 DH 2 O와 함께, 또는 수돗물을 사용합니다.
    5. 커버 수성 GelTol 설치 매체를 사용하여 물에서 직접 전표와 슬라이드를 탑재합니다. 공기 방울을 생성하지 마십시오.
    6. 설치 매체의 완전한 건조, 예를 들어, O / N에서 4 ℃로 할 수 있습니다. 스토어 RT에 슬라이드를 건조.
1. % 에탄올 20 ' 40 ° C
2. % 에탄올 60# 39; 40 ° C
삼. % 에탄올 90 ' 40 ° C
4. % 에탄올 60 ' 40 ° C
5. % 에탄올 90 ' 40 ° C
6. % 에탄올 60 ' 40 ° C
7. % 에탄올 90 ' 40 ° C
8. % 에탄올 120 ' 40 ° C
9. 크 실롤 30 ' 40 ° C
10. 크 실롤 60 ' 40 ° C
11. 파라핀 60 ' 60 ° C
12. 파라핀 60 ' 60 ° C
1삼. 파라핀 60 ' 60 ° C
14. 파라핀 120 ' 60 ° C

조직 테크 VIP 진공 침투 프로세서에 의해 표 1. 조직 처리.

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Representative Results

더블 immunostainings (공동의 염색)는 포르말린 고정 파라핀 포함 된 쥐 CNS 및 LN 절에서 수행되었다. 3-5 μm의 두께 조직 슬라이스 사전 코팅 접착 유리 슬라이드에 연속적으로 설치 이전에 10,11,12 설명으로 처리, 썰매 마이크로톰을 사용하여 절단 하였다. 간단히 deparaffinizing, 조직 재수 내생 퍼 옥시 다제 불 활성화 한 후, 절편을 비특이적 결합 부위를 제거하는 단계를 차단 한 다음, 항원 검색 과정을 실시한다. 공동의 염색은 다음의 조합으로 수행되었다 : ⅰ) Ccl11 / 년 Iba-1, II) Ccl11 / ED1 및 ⅲ) Ccl11 / CD8. 각 공동 염색에 사용되는 주요 애비는 자신의 동시 배양을 사용할 수 두 개의 서로 다른 종 (각각 염소 및 마우스)에 제기되었다. 이바-1 ED1과 CD8은 청색 AP 신호 시각화 동안 Ccl11는 갈색 퍼 옥시 다제 반응 생성물에 의해 가시화 하였다.

10 -like 다발성 경화증 (MS)의 Ccl11 케모카인의 역할에 대한 우리의 최근의 연구에 큰 맥락에서 기술되었다. IHC는 쥐 CNS에서 수행 분석에 따르면, Ccl11는 pericarya, 수상 돌기 및 척수 회백질 (그림 1A 및 B)의 복부 뿔에있는 신경 세포의 축삭에 존재했다. 또한, 단일 Ccl11 + 혈장 세포는 동일한 조직 섹션 (도 1a)의 검출뿐만 아니라 있었다 단일 Ccl11 + / ED1 + 염증 부위에서 관찰 식세포 뇌 상주 미세 아교 세포는 (데이터는 도시하지 않음] ED1이 리소좀 단백질 마커 활성화 된 대 식세포와 미세 아교 세포 13)이다. 특히, Ccl11의 케모카인은 이바-1 + 대식 세포와 뇌 상주 미세 아교 세포 (1A와 공동 현지화를 찾을 수 없습니다, 이바-1 칼슘을 2 + -bindi를 이온화 검출하기위한 마커 NG 단백질 (14)).

IHC 기반의 단백질은 ED1 (그림 2B)로 Ccl11 단백질의 공동 현지화 전시 된 주변 쥐 LN에서 수행 타겟팅. 그러나, Ccl11 분비 CD8 + T 림프구 (그림 2A, CD8 + 세포를 방지 Cd8α, MHC 클래스에 바인딩 주로 세포 독성 T 세포 마커 I 15 분자를 사용하여 검출되었다) 같은 조직 섹션에서 검출되지 않았다. 프로토콜에 기술 된 바와 같이 블로킹 용액에서 O / N 항온 처리 동안 기본 복근을 생략 제외하고, 제어부는 처리 하였다. 표적 단백질의 어떤 검출 신호 (도면의 1A, 2AB에 제시된 바와 같이, B)은 CNS 및 LN 제어부 (각각도 1c 및도 2c)에서 관찰되지 않았다.

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그림 1. A, B : 더블 면역 염색 쥐 LN있다. 중 α-CD8 (A) 또는 ED1 (B)와 조합 Ccl11 케모카인 대항 일차 항체. . Ccl11 검출 신호 (브라운) 대 식세포의 리소좀 단백질 마커 (ED1, 파랑)와 공동 지역화 : 동일한 셀 내에 공동 지역화 Ccl11 + (갈색) 및 CD8 + 세포 (파란색) B에 대해 관찰되지 않았다. C : 음성 제어; 주변 LN에 레이블이없는 상주 세포를 보여주는 세부 사항. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. A, B : 더블 면역 염색 쥐 S에서PINAL 코드. 신경 pericarya, 수상 돌기 및 축삭에 Ccl11을 나타내는 회색 물질의 복부 경적 (갈색)와 공동 염색 중 이바-1 + (A, 파란색) 또는 ED1 + (B, 파랑) 대 식세포 / 미세 아교 세포 C :. 음성 대조군; 척수 회백질의 복부 혼에 레이블이없는 상주 세포를 보여주는 세부 사항. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

표준 IHC 절차는 종종 일반적으로 폭 넓은 경험뿐만 아니라 "시행 착오"접근 방식을 의미 최적의 결과를 얻기 위해 특정 조정을 필요로한다. 티슈 제조에서 대상 가시화 될 때까지 상기 프로토콜 거의 각 단계는 개별적으로 최종 결과를 개선하기 위해 수정 설계를 실시 할 수있다. 여기에 제시된 이중 염색 프로토콜은 특히 신경 염증에 영향을 포르말린 고정 파라핀 포매 쥐 CNS 및 LN 조직 섹션에서 우리 관심 대상 단백질 사이의 상호 관계를 평가하기위한 조정 대상 IHC 계 단백질을 예시한다. 이와 같이,이뿐만 아니라 고급 시험 영감의 근원으로, IHC의 방법을 배우기위한 가이드로서 사용될 수있다. 그러나, 유념해야 / 또는 여기에서 최적의 결과를 생성 할 수있다 표시 이외의 조직 및 다른 단백질을 대상으로 본 프로토콜의 단순한 재생.

Ccl11이 congenic 쥐 스트레인 (10)의 CNS에서 각각의 mRNA 수준의 상향 조절을 나타냈다에 대하여> 현장 하이브리드에 잠겨 핵산 (LNA) 리보 프로브 (riboprobe)를 사용. qPCR에 의해 확인 하였다이 결과 분석. 또한, qPCR에 야생 유형 (중량) 균주에 비해 congenic 주변 LN에도 Ccl11의 상향 조절 한 것으로 밝혀졌습니다. 최종적으로, 웨스턴 블랏 (WB)는 질병 보호 congenic 쥐 계통 (10)의 양쪽 표적 조직에 Ccl11 단백질의 유의 한 상향 조절을 보였다. 따라서, 대상 조직에 직접 케모카인의 출처를 조사 할 목적으로, 그 목적을 위해, 우리는 여기에 설명 된 이중 염색 프로토콜을 개발했다.

사후 해부 및 사후 고정 탈회시 조직의 기계적 손상을 방지 외에도, 조직 절편은 매우 도전 나타날 수 있습니다. 절편은 일반적으로 기술과 연습이 필요합니다. 슬라이스의 품질은 여러 측면의의에 따라 달라집니다UCH 절단 동안 샘플에 가해지는 압력을 감소시키기 위해 조직 블록과 칼과 직각을 조정하는 등, 슬레지 마이크로톰에 의해 생성 된 파라핀 포매 조직 조각 절단 속도 등의 두께는 2 내지 50 ㎛, 변할 수있다. 파라핀 조직 조각이 요구 염색 과정 동안 더 유지를 위해 바람직하게는 상업적으로 폴리 -L- 리신 또는 아미노 프로필 트리에 톡시 실란 (APTS) 등의 접착제로 코팅 된 유리 슬라이드 상에 온수욕에서 장착 잘라. 앞서 염색 cryomicrotome를 사용하여 -20 ℃에서 약 잘라 RT에서 건조 조직 절편을 냉동하는 반면, 파라핀 블록을 실온에서 분리하고,이어서 탈 파라핀 전에 50 ~ 60 ° C에서 건조 냉각시켰다.

고도로 보존 된 조직 구조, 세포 형태와 표적 에피토프는 표적 단백질의 위치 파악과 연계 평가를 위해 필수적이다. 최적의 조직 preser을 달성하기 위해서vation는 샘플 적절히 부응 또는 가교 고정 제를 사용하여 고정 될 수있다. 에탄올과 같은 응고 고정 제는 더 자주 냉동 보존에 사용된다. 에탄올을 사용하여 단백질 변성 조직의 탈수 (9)을 통해 달성된다 불충분 한 세포 보존 (16)이 발생할 수있다. 응고 고정 제와 달리 포름 알데히드 자주 루틴 조직학 IHC 9에서 사용되는 가교 성 정착액은 모두 cryo- 파라핀 조직 보존을위한. 우리는 이전에 탈회 이후 파라핀 삽입 4 ° C에서 24 시간 동안 포름 알데히드 용액에 침지하여 쥐 CNS와 LN위한 최적의 고정을 달성했다. 거대 분자의 형태에 큰 변화를 일으키는에도 불구하고,이 반 가역, 공유 시약 QUAL 높은 제공 (포름 알데히드, 즉 단백질을 가교하여 항체의 특이 적 결합을 방지 할 수있다 항원을, 마스크 메틸렌 다리를 형성한다)성만 조직 보존. 특히, 가교 시약과 온도 및 고정 기간은, 절편 항원 검출과도 교차 반응으로 IHC의 여러 측면에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 모두 각각 주로 인해자가 분해 또는 과도한 크로스 링크 (17)에있는 유물이 발생할 수 있습니다 포름 알데히드와 같은 알데히드 기반의 시약을 사용하여 고정 언더와 오버 고정. 그럼에도 불구하고, 소수성 단백질 overfixation 관찰 바인딩 의한 비특이적 백그라운드 염색 또는 클론 애비 (18)를 사용할 때의 희석 완충액의 pH를 상승시켜 비이 온성 계면 활성제를 함유하는 저 소금 버퍼를 사용하여 감소 될 수있다. 그러나, 이온 성 및 정전 단백질 상호 작용에 의해 발생하는 비특이적 백그라운드 염색 (노이즈)가 동시에 소수성 단백질 (18) 결합에 의해 야기되는 소음을 악화시킬 수있다 고 이온 강도로 희석 완충액을 이용하여 감소 될 수있다. 이 타겟 항원의 검출에 관해서, 알데히드 I완전히, 항원 검색 (19)에 의해 반전되지는 않았지만 단백질의 삼차 구조의 nduced 변경이 될 수 있습니다 : 다양한 pH 값 (열 유발 에피토프 검색 (HIER)와 버퍼에서 가열하여 ⅰ), ⅱ) 효소 분해에 의해 (단백질 분해 효소가 유도 에피토프 검색 (PIER 20)), ⅲ) 강 알칼리성 또는 산성 용액 또는 자당 (21)의 배양, (22) 또는 IIII) 농축 포름산 (23)으로 처리하여. 대상의 대부분이 19 에피토프 HIER 편리 나타납니다. 가열 기간 외에, 예컨대 EDTA (pH를 5.5, 8.5 또는 9.0) 또는 구연산 나트륨 완충액 (pH 6.0- 6.2)로 용액의 pH 값은 HIER의 결과에 필수적 일 수있다. 특히, 본 연구에서 가장 만족스러운 결과는 pH 값을 8.5로 EDTA 용액에 1 시간에 대한 샘플을 스팀에 의해 달성 하였다.

항체가 우선적으로 특정 항원 결정기, 비특이적에 매력에 결합하지만, 동족의 Ag 유사한 바인딩사이트가 완전히 배제 할 수 없다. 특히, 백그라운드 염색을 감소 아마도 가장 효율적인 방법은 종래 기본 애비 (9)의 응용 프로그램 (본 연구에 사용 된 예로서 FCS) 단백질을 차단 인큐베이션한다. 단일 클론 차 애비는 어쨌든 인해 높은 특이성하여 감소 불특정 배경 신호에 폴리 클로 날 애비보다 선호된다. 모노클 복근 흔히 다른 (비특이적) 단백질 (24)의 일부일 수있다 아미노산의 소수로 이루어진 에피토프에 대해 지시 된 바와 그럼에도 불구하고, 교차 - 반응성은 여전히 나타날 수있다. 모노클 달리 클론 복근 표적 단백질의 여러 이성체 인식 높은 기회가있다. ⅰ) 폴리 클로 날은 염소에서 제기 및 ⅱ) 단일 클론 마우스에서 제기 : 우리는 처음에 Ccl11를 감지하는 두 가지 주요 복근을 사용했다. 우리 손에 두 제품 대상 케모카인에 동일한 염색 패턴을 나타내었다. 동시 공동 염색을 수행하기 위해, 우리는 염소 안티 쥐는 Ccl1를 사용모든 마우스에서 생성 된 각각 년 Iba-1 ED1 및 CD8,에 대한 항체와 조합 한 순이. 동일한 종에서 생성 된 기본 복근 공동 라벨에 필요한 그러나 또한 동시에 이중 면역 염색도 25에 순차적 수행 될 수있다.

본 연구에 사용 된 복근의 최적 작동 농도는 특정 신호의 강도와 배경 잡음 사이의 최적 비율로 시험 희석 시리즈를 통해 평가 하였다. 그러나,이 같은 항체의 최적의 작업 농도가 때때로 기관, 종, 배경 병리 특히, permeabilization가 포함 된 파라핀 수행 우리의 염색 과정에서 필요하지 않은 사이에 다를 수 있다는 것을 명심해야한다, 3-5 μm의 두께의 조직 절편 그러나, 트리톤 X-100과 같은 세제는 아직 표면 장력을 감소시키기 위해 사용되었을 수 있으므로, 항원과 항체 간의 바인딩을 촉진하는. 에Ab의 침투의 반대로, 매개 permeabilization- 개선은 일반적으로 (면역 세포 (ICC)) 세포 또는 세포 현탁액 배양에서 단백질 검출을 위해 필요, 면역의 냉동 섹션과의 (IF) IHC / IF 신선한 (두께, vibratome 컷)에서 자유 조직 조각을 떠.

여러 컨트롤은 특정 / 신뢰할 수있는 면역 표적을 생성하는 본질적으로 중요하다. 양성 대조군으로, 우리는 우리가 Ccl11 + 호산구를 감지 할 수 천식의 쥐 모델에서 폐을 사용했다. 부정적인 컨트롤은 기본 애비의 부재 만 차단 솔루션 O를 배양 / n를 4 ° C에서 있었다.

우리는 이미 배경 신호의 감소에 대한 몇 가지 원인과 잠재적 치료를 언급했다. 비특이적 면역 제품은 또한 골수 세포 (26)의 사이 DAB 반응 pseudoperoxidase 적혈구 및 퍼 옥시다아제로 발생할 수있다. 이 효소의 활동, 단지 소음 CAUS로내생 비오틴에 의해 에드 또는 AP는 이미 포르말린 고정 동안 감소되었습니다. 그러나, 메탄올 / H 2 O 2 전처리는 추가 또는 완전 불 활성화 27, 28. 포유 동물 조직에서 AP 활동에 의해 발생 배경 염색 더의 levamisole (29)에 의해 억제, 또는 아세트산 (29)에 의해 할 수있다 필요합니다. 아비딘과 반대로 대전 셀룰러 분자 (30) 사이에 이온 성 인력의 결과는 비특이적 결합 스트렙토 31 avidinii에서 스트렙 타비 딘과 난백으로부터 아비딘 치환함으로써 회피 할 수있다.

DAB 아마도 IHC에서 가장 자주 사용 원체이다. DAB (갈색 반응 생성물) 외에 사용중인 다른 퍼 옥시다아제 원체 3- 아미노 -9- 에틸 카바 졸 (AEC; 적색)이고, 4 클로르 -1- 나프톨 (CN, 블루) 및 테트라 메틸 벤지딘 (TMB, 청색). 흔히 선택된 AP의 발색제가 FB, 패스트 레드 (FR), 및 새로운 푹신이다 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- indolylphosphate / 니트로 BL단말 테트라 졸륨 클로라이드 (BCIP / NBT). 효소와 발색제의 선택은 그러한 지역화 발현 패턴 목표 기능에 의해 조향뿐만 아니라 내인성 안료 (멜라닌 헤 모시 데린) (32)의 존재에 의해 할 수 있지만, 기본적으로 개인의 선호 문제이다. Counterstain과는 IHC 절차의 마지막, 통성 단계는 일반적으로 헤 마톡 실린, 핵 고속 적색 또는 메틸 (18) 녹색을 사용하여 수행됩니다. 일반적으로 더 적합한 단일 라벨링, Counterstain과 조직 형태의 해석을 용이하게하고이 미묘 원체 석출물과 간섭을 방지하기 위해 개발되어야한다.

염색 과정의 조직 절편의 완료시 신중 장착 매체를 이용하여 커버 슬립으로 장착되어야한다. 기포의 형성을 피해야한다. 물리적 보호 옆에, 매체를 장착하면 시각화 및 이미지 품질을 향상시킵니다. 어느 / 유기 소수성 또는 수성 / 친수성의 채널장착 매체 OICE 유기 용매 중에서, 최종 생성물의 용해도에 의존한다. 톨루엔 - 기반 장착 매체 DAB를 들면, 예를 들면 적합한 것 있지만, 수성 매체 장착 형광 표지를 비롯한 모든 효소 원체에 적용될 수있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) Baxter 1001936060 Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment.
Sodiumchloride (NaCl) Merck 1.0604
Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet Sigma-Aldrich P4417
Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% in 1x PBS Apl pharma 34 24 28 Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity.
Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) Sigma-Aldrich 459844-1L Flamable.
Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 Sigma-Aldrich 534056 Flamable. Acute toxicity.
Histo-Comp Paraffin Wax Tissue-Tek V0-5-1001
Adhesive Microscope Slides Starfrost MIC-1040-W
Xylol substitute XEM-200 Vogel GmbH ND-HS-200 Respiratory sensitization. Carcinogenicity.
α-CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody AbD Serotec MCA48G
α-Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody Millipore MABN92
α-CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody AbD Serotec MCA341R
α-eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody Santa Cruz BT SC-6181
Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody Dakopatts, Denmark D0314
Biotinylated secondary antibody Amersham Biotech RPN1025
Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) Sigma-Aldrich A3151
Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) Sigma-Aldrich N4875-1G Acute toxicity.
Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) Sigma-Aldrich FBS25
Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) Sigma-Aldrich 31742 Acute toxicity.
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) DAKO S3000 Highly flammable. Toxic.
Copper sulphate (CuSO4) Merck 1.02791 Acute toxicity. Environmental hazzard.
GelTol Aqueous Mounting Medium Thermo Electron Corporation 230100
Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) Merck 107210 Acute toxicity.
Methanol (CH3OH) Fluka 65543 Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable.
Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) AppliChem A1379 Skin and eye irritation.
Tris Buffered Saline (TBS), tablet Sigma-Aldrich T5030
Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) Merck 1.0658
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) Merck 1.06346
Fetal calf serum (FCS) Cambrex BioScience DE-14-802F
DAKO cytomation wash buffer 10x DAKO S3006 Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming.
N,N-Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) Fluka 40250 Flammable. Acute toxicity.
Glas coverslips 24 x 36 mm Menzel-Gläser BB024036A1
Hydrochloric acid, conc. (HCl) Sigma-Aldrich 30721 Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.
Hydrochloric acid solution volumetric, 2 M HCl (2 N) Fluka 71826 Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.
Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) Sigma-Aldrich S2252 Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment.
Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) Merck 1.08454 Oral exposures may cause reproductive and developmental effects.
Equipment
Tissue-TekV.I.P Vacuum Infiltration Processor Sakura 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz
Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome Hacker instruments
Household food steamer Braun MultiGourmet FS 20
Light microscope Leica Polyvar 2

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