Analisi immunoistochimica nel Sistema Nervoso Centrale e Periferico Rat linfa nodo del tessuto Sezioni

Neuroscience

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Adzemovic, M. Z., Zeitelhofer, M., Leisser, M., Köck, U., Kury, A., Olsson, T. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. J. Vis. Exp. (117), e50425, doi:10.3791/50425 (2016).

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Abstract

Immunoistochimica (IHC) prevede la visualizzazione di proteine ​​altamente specifiche, affidabile e attraente. corretta esecuzione e interpretazione di un etichette multicolori IHC-based è impegnativo, soprattutto se utilizzata per valutare interrelazioni tra proteine ​​bersaglio nel tessuto con un alto contenuto di grassi come il sistema nervoso centrale (CNS).

Il nostro protocollo rappresenta un perfezionamento della tecnica immunomarcatura serie particolarmente adeguato per il rilevamento di entrambe le proteine ​​strutturali e solubili nel ratto SNC e linfonodi periferici (LN) affetti da neuroinflammation. Tuttavia, con o senza ulteriori modifiche, il nostro protocollo potrebbe probabilmente essere utilizzato per il rilevamento di altri bersagli proteici correlati, anche in altri organi e specie che qui presentato.

Introduction

Nonostante l'utilizzo di tecnologie avanzate high-throughput analisi effettuate sul methylome, trascrittoma o addirittura a livello del proteoma, immunostaining rimane il golden standard per la rilevazione delle proteine ​​direttamente nel campione di tessuto, coltura cellulare o uno striscio di cellule. Rivelando il modello di localizzazione / distribuzione, immunoistochimica (IHC) può valutare i rapporti relativi e interrelazioni topografiche delle proteine ​​bersaglio, e anche indicare le loro attività biologiche. Pertanto, IHC è ampiamente utilizzata per scopi clinici e di ricerca, per esempio, per la diagnosi, valutazioni di trattamento, lo studio dei meccanismi della malattia, alterazioni funzionali e fenotipiche in modelli animali, ecc

In sostanza comprende l'istologia, patologia, biochimica e immunologia, IHC è notevolmente avanzato dal 1941, quando gli anticorpi fluorescente sono stati utilizzati per la prima volta ad identificare gli antigeni pneumococco nel tessuto infetto 1. Visualization di prodotti cellulari e componenti per IHC si basa sul legame degli anticorpi (ABS) per la loro specifica antigene (Ag). Oltre a utilizzare fluorofori contrassegnati anticorpi, le reazioni immunitarie possono anche essere visualizzati utilizzando enzimi come la perossidasi 2,3 o fosfatasi alcalina 4. Inoltre, anticorpi oro-tag colloidali 5 sono utilizzati per rilevare specifica interazione antigene-anticorpo sia microscopia ottica ed elettronica, mentre le etichette radioattivi vengono visualizzati mediante autoradiografia.

La reazione immunologica Ag-Ab può essere rilevato tramite metodi diretti e indiretti. Il metodo diretto è sostanzialmente più veloce e più semplice, in quanto utilizza direttamente etichettato Abs primaria 6. Tuttavia, a causa della notevole mancanza di sensibilità, metodi indiretti sono preferiti a quelli diretti. Procedure di rilevamento indiretto due fasi richiedono non marcato Abs primaria, come il primo, ed etichettati Abs secondari diretti contro il Abs primario, come secondo strato 7.amplificazione del segnale può essere ottenuto coinvolgendo ulteriormente, terziaria Ab enzima accoppiato (tre fasi metodo indiretto) che si lega al Ab secondario. metodi di rilevamento indiretto comunemente usati sono avidina-biotina e perossidasi antiperossidasi (PAP). In alternativa, fosfatasi alcalina-antialcalina fosfatasi (APAAP) complesso può essere usato al posto del metodo PAP. In particolare, fosfatasi alcalina (AP) i metodi sembrano essere ancora più sensibile rispetto ai metodi di immunoperossidasi 4. metodo avidina-biotina complesso (ABC) utilizza biotinilato Ab secondario in combinazione con l'etichetta avidina-biotina complesso (LAB), o etichettato streptavidina-biotina complesso (LASTRA). Sensibilità di rilevazione può essere ulteriormente aumentata coinvolgendo avidina marcata con perossidasi o fosfatasi alcalina 8. Altri metodi di rilevamento in uso sono etichettatura polimerico, amplificazione tiramina e immuno-rolling cerchio 9. In particolare, diversi metodi di rilevamento possono essere combinati per la rilevazione multipla Ag nella stessa tessuticampione, che è stato segnalato per la prima volta nel 1978 4. simultanea doppia immunostaining qui presentata è stata eseguita in fissati in formalina, inclusi in paraffina ratto del sistema nervoso centrale e LN sezioni di tessuto con perossidasi-bound e AP-coniugati anticorpi secondari, rispettivamente. I segnali sono stati visualizzati con 3,3'-diaminobencidine (DAB) cromogeno e il Fast Blue (FB) APAAP complesso, rispettivamente.

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Protocol

Dichiarazione etica
presente studio è effettuata in conformità con le linee guida del Consiglio nazionale svedese per gli animali da laboratorio e la direttiva della Comunità europea (86/609 / CEE) sotto i permessi etici N338 / 09, N15 / 10 e N65 / 10, che sono stati approvati dal Comitato del Nord Stoccolma Animal Ethics.

1. Preparazione del tessuto

  1. Perfusion & fissazione
    1. Anestetizzare l'animale con isoflurano per eseguire perfusione transcardial via ventricolo sinistro. Avviare il risciacquo della vascolarizzazione con tampone fosfato (PBS) per rimuovere i componenti del sangue, seguito da 4% paraformaldeide in PBS 0,1 M (PFA).
    2. Fissare cervello sezionato, il midollo spinale e dei tessuti periferici LN immergendolo in PFA. Dopo 24 ore a 4 ° C, trasferire il tessuto da PFA in PBS e conservare a 4 ° C fino ad ulteriore lavorazione. In alternativa alla PBS commerciale, dissolvere 9 g di NaCl in 250 ml S &# 246; Rensen tampone e aggiungere 750 ml di acqua deionizzata (DH 2 O); preparare 0,2 M Sörensen tampone (pH 7,4) sciogliere 13,8 g di NaH 2 PO 4 x 1H 2 O e 71,2 g di Na 2 HPO 4 x 2H 2 O in 2,5 L dH 2 O.
  2. Disidratazione e embedding
    1. Tagliare il tessuto in porzioni spesse circa 5 mm usando una lama di rasoio.
    2. Avviare il processo di indurimento tissutale (disidratazione) utilizzando il VIP Vacuum infiltrazione Processor Tissue-Tek (procedura standard basato su sommersione in concentrazioni crescenti di etanolo, seguito da xilene ed infine di paraffina (Tabella 1).
    3. Posizionare il tessuto in uno stampo e versare il paraffina liquida attorno al campione per formare un "blocco di paraffina". lo stoccaggio a lungo termine richiede temperatura ambiente (RT). Tuttavia, prima di sezionamento, è consigliabile raffreddare i blocchi, ad esempio, durante la notte (o / n) a 4 ° C.

2. Sezioni

  1. Posizionare il blocco di paraffina in un supporto fisso del microtomo slitta, che può muoversi avanti e indietro attraverso il coltello. Regolare l'angolo ottimale fra la massa e il coltello microtomo (che dipende dalla geometria del coltello, ma anche dalla velocità di taglio e la tecnica).
  2. Cut 3 - 5 micron di spessore sezioni dal blocco di paraffina.
  3. Trasferire sezione appena tagliato in un contenitore d'acqua e montate successivamente dall'acqua sul vetrino.
  4. Premere la sezione montata con cura nei confronti di un tovagliolo di carta per rimuovere l'acqua residua e potenziali bolle d'aria. vetrini adesivi in ​​commercio pre-rivestiti sono raccomandabili.
  5. Secco diapositive montate per un paio d'ore in una stufa a 50 - 60 ° C.

3. Sparaffinatura (reidratazione e blocco del endogena perossidasi)

  1. Immergere i vetrini 2x in xilene (sostituto in alternativa xileneXEM-200), ogni volta 15 - 20 '.
  2. Risciacquare in 99% di etanolo.
  3. Per bloccare l'attività perossidasica endogena, incubare le sezioni per 30 'in soluzione metanolica contenente perossido di idrogeno 0,25%.
  4. Continuare reidratazione utilizzando etanolo con l'aumento del contenuto di acqua (99%, 70%, finendo in acqua distillata.
  5. Da questo punto fino fissaggio del coperchio scivola sezioni devono essere mantenuto umido.

4. Antigen Retrieval

  1. Utilizzare una vaporiera per bollire i vetrini in una soluzione di antigene recupero (in questo caso EDTA pH 8,5 tampone) per 60 '(EDTA scorta soluzione contiene 1,21 g di Tris e 0,37 g di EDTA sciolti in 50 ml dH 2 O, per preparare il lavoro soluzione diluita 2,5 ml di EDTA soluzione madre in 47,5 ml di dH 2 O).
  2. Raffreddare i vetrini su RT per ca. 1 ora e poi risciacquare 3 - 5x con Tris Buffered Saline (TBS, utilizzare in alternativa PBS), composto di 0,05 M Tris e 0,15 M NaCl; pH 7,5 regolato with HCl. In alternativa usare TBS commerciale.

5. blocco dei siti legame aspecifico

  1. Per evitare reazioni aspecifiche sfondo, incubare sezioni di RT per 30 'nella soluzione bloccante contenente 10% di siero fetale bovino (FCS) e 90% di buffer DAKO.

6. Fare doppio immunomarcatura: Incubazione simultanea con gli Abs primari

  1. Diluire quantità di anticorpi primari nella soluzione di saturazione e incubare o / n a 4 ° C. Per la doppia immunocolorazione combinare α-eotassina (CCL11; 1: 300) con α-CD68 (Ed1; 1: 1.000) o α-Iba1 (Aif1, 1: 1000) o α-Cd8α (Ox-8; 1: 200) .
  2. Sciacquare i vetrini 3-5x con tampone TBS (utilizzare in alternativa 10x diluito tampone DAKO).
  3. Diluire quantità di anticorpi secondari (biotinilato anti-capra e AP-coniugato anti-topo, sia 1: 200) in soluzione di saturazione e incubare 1 ora a RT.
  4. Sciacquare i vetrini 3 - 5x con tampone TBS (usE In alternativa 10x diluito tampone DAKO).
  5. Incubare i vetrini con complesso avidina-perossidasi di rafano (HRP) diluita nella soluzione di blocco per 1 ora su RT.
  6. Sciacquare i vetrini 3 - 5 volte con TBS tampone (utilizzare in alternativa 10x diluito tampone DAKO).

7. Visualizzazione

  1. Visualizzazione del anticorpo secondario legato AP-marcato
    1. Preparare 0,1 M Tris-HCl sciogliendo 12,1 g Tris in 1 L dH 2 O e regolare il pH a utilizzando HCl. Utilizzare lo stesso tampone Tris-HCl per preparare soluzione 1 M levamisolo. Preparare freschi 4% soluzione NaNO 2 in DH 2 O.
    2. Per ottenere 50 ml del substrato Fast Blue (FB) (volume richiesto per una cuvetta di vetro standard) sciogliere 6,25 mg naftolo-AS-MX-fosfato in 312,5 ml DMF nel tubo di vetro e mescolate in 50 ml di pre-riscaldato (37 ° C) tampone Tris-HCl. Per sciogliere 12,5 mg FB RR sale a 312,5 ml 2 N HCl aggiungere 312,5 ml di precedenza Preparosso 4% soluzione di NaNO 2 e agitare la miscela negli stessi 50 ml di pre-riscaldato tampone Tris-HCl. Agitare delicatamente fino a quando il liquido giallo chiaro e, infine, aggiungere 77 ml di soluzione precedentemente preparata 1 M Levamisolo. Filtrato ottenuto miscela e versare su vetrini posti nella provetta di vetro.
    3. Avviare l'incubazione a 37 ° C e il controllo dei processi di sviluppo sotto il microscopio luce circa. frequenza di 15 - 30 min. Se girando fuzzy, sostituire la soluzione FB con la miscela fresca.
    4. Sciacquare i vetrini 3 - 5x con tampone TBS e il trasferimento in seguito in tampone PBS.
  2. Visualizzazione del anticorpo secondario biotinilato legato
    1. Preparare DAB / H 2 O 2 soluzione di sviluppo diluendo 1 ml di soluzione madre DAB (25 mg DAB per 1 ml di PBS) in 49 ml di PBS. Aggiungere 16,5 ml H 2 O 2 e filtrato prima versando sul sezioni.
    2. La conversione del cromogeno DAB in fronte precipitaren pigmento può essere immediata. Controllare il processo di sviluppo sotto il microscopio ottico (anche paio di secondi di incubazione più lungo può sollevare uno sfondo alto e mascherare il segnale specifico).
    3. L'intensità del precipitato pigmento marrone può essere alternativamente migliorata mediante incubazione in soluzione costituita da 2% di solfato di rame e 0,9% NaCl per 5 '.
    4. Sciacquare i vetrini 3 - 5 volte con PBS e infine con dH 2 O, in alternativa, utilizzare l'acqua del rubinetto.
    5. Montare le diapositive con copertura scivola direttamente dall'acqua utilizzando acquosa mezzo di montaggio GelTol. Evitare la formazione di bolle d'aria.
    6. Consentire completa asciugatura del mezzo di montaggio, ad esempio, o / n a 4 ° C. Conservare asciugato diapositive su RT.
1. % di etanolo 20 ' 40 ° C
2. % di etanolo 60 &# 39; 40 ° C
3. % di etanolo 90 ' 40 ° C
4. % di etanolo 60 ' 40 ° C
5. % di etanolo 90 ' 40 ° C
6. % di etanolo 60 ' 40 ° C
7. % di etanolo 90 ' 40 ° C
8. % di etanolo 120 ' 40 ° C
9. xylol 30 ' 40 ° C
10. xylol 60 ' 40 ° C
11. Paraffina 60 ' 60 ° C
12. Paraffina 60 ' 60 ° C
13. Paraffina 60 ' 60 ° C
14. Paraffina 120 ' 60 ° C

Tabella 1. Il trattamento dei tessuti da tessuto-Tek VIP vuoto infiltrazione del processore.

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Representative Results

immunostainings doppie (co-colorazioni) sono stati eseguiti in fissati in formalina, inclusi in paraffina ratto sezioni del sistema nervoso centrale e LN. 3-5 micron di spessore fette di tessuto sono stati tagliati con un microtomo slitta, montato successivamente su vetrini adesivo pre-verniciato e trattato come descritto in precedenza 10,11,12. Brevemente, dopo deparaffinizing, reidratazione tessuti e endogena inattivazione perossidasi, sezioni sono stati sottoposti al processo di recupero dell'antigene, seguita da una fase di blocco per eliminare siti di legame non specifici. I co-colorazioni sono state effettuate nelle seguenti combinazioni: i) CCL11 / Iba-1, ii) CCL11 / Ed1 e iii) CCL11 / CD8. L'Abs primaria utilizzata per ogni co-colorazione sono state sollevate in due specie differenti (rispettivamente capra e mouse,), che ha consentito loro di incubazione simultanea. CCL11 è stato visualizzato dal prodotto di reazione della perossidasi marrone, mentre Iba-1, Ed1 e CD8, sono stati visualizzati dal segnale blu AP.

10. Secondo l'analisi IHC eseguito nel ratto CNS, CCL11 era presente in pericarya, dendriti e assoni dei neuroni situati nelle corna ventrali della materia grigia del midollo spinale (Figura 1A e B). Inoltre, singole cellule CCL11 + plasmatiche erano rilevabili nelle stesse sezioni di tessuto (Figura 1A), così come singola CCL11 + / Ed1 + macrofagi e microglia residenti cerebrali osservati nel sito dell'infiammazione (dati non mostrati; Ed1 è un marker di proteine lisosomiale in macrofagi attivati e microglia 13). In particolare, CCL11 chemochina non è stato trovato co-localizzazione con Iba-1 + macrofagi e microglia residenti cervello (1A; Iba-1 è un marker per la rilevazione ionizzato Ca 2+ -bindi ng proteine 14).

Proteine IHC targeting basato eseguito nel ratto LN periferico esposto proteina CCL11 co-localizzazione con Ed1 (Figura 2B). Tuttavia, non i linfociti T CD8 + CCL11-secernenti erano rilevabili nelle stesse sezioni di tessuto (Figura 2A; cellule CD8 + sono stati rilevati utilizzando anti-Cd8α, marker per le cellule T citotossiche prevalentemente che si legano alle molecole MHC di classe I 15). Tranne per l'omissione Abs primari durante o / n incubazione nella soluzione bloccante, sezioni di controllo sono stati trattati come descritto nel protocollo. Non ci sono segnali di rilevamento delle proteine bersaglio (come presentato nelle figure 1A, B e 2A, B) sono stati osservati in sezioni SNC e LN controllo (Figura 1C e 2C, rispettivamente).

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Figura 1. A, B: Doppio Immunocolorazione nel ratto LN. Gli anticorpi primari diretti contro la chemochina CCL11 in combinazione con α-CD8 (A) o Ed1 (B). No co-localizzazione all'interno della stessa cella è stato osservato per CCL11 + (marrone) e le cellule CD8 + (blu). B: segnale di rilevamento CCL11 (marrone) co-localizzazione con il marcatore per una proteina lisosomiale nei macrofagi (Ed1, blu). C: controllo negativo; un dettaglio che mostra cellule residenti senza etichetta in LN periferico. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. A, B: Doppio Immunocolorazione nel ratto SCord Pinal. Corno ventrale della sostanza grigia esibendo CCL11 in neuronali pericarya, dendriti e degli assoni (marrone) co-macchiato sia con Iba-1 + (A, blu) o ED1 + (B, blu) macrofagi / cellule microglia C:. Controllo negativo; un dettaglio che mostra cellule residenti senza etichetta nel corno ventrale della materia grigia del midollo spinale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

procedure IHC standard spesso richiedono adattamenti specifici per ottenere un risultato ottimale, che implica comunemente una grande esperienza, ma anche l'approccio "trial and error". Dalla preparazione del tessuto fino visualizzazione di destinazione, quasi ogni fase del protocollo può essere soggetto a modifiche progettate in modo da migliorare il risultato finale. protocollo di doppia colorazione qui presentata esemplifica proteina IHC targeting basato particolarmente adeguato per valutare le interrelazioni tra le proteine ​​target di nostro interesse fissati in formalina, inclusi in paraffina ratto sezioni del sistema nervoso centrale e LN dei tessuti colpiti da neuroinfiammazione. Come tale, può essere utilizzato come un tutorial per imparare la tecnica della IHC, ma anche come fonte di ispirazione per studi più avanzati. Tuttavia, va tenuto presente che un semplice riproduzione di questo protocollo per il targeting altre proteine ​​e / o in altri tessuti che qui presentata può generare risultati non ottimali.

L'ibridazione in situ utilizzando bloccato acidi nucleici (LNA) riboprobe contro CCL11 esposto upregulation dei rispettivi livelli di mRNA nel sistema nervoso centrale del ceppo di ratto congenic 10. Questo risultato è stato confermato da qPCR analisi. Inoltre, qPCR rivelato CCL11 upregulation anche nella LN periferico congenic rispetto al ceppo wild type (WT). Infine, Western Blot (WB) ha mostrato una significativa upregulation della proteina CCL11 in entrambi i tessuti bersaglio della malattia protetto ceppo di ratti congenic 10. Pertanto, abbiamo voluto indagare l'origine di questa chemochina direttamente nei tessuti bersaglio, e per questo scopo abbiamo sviluppato il doppio protocollo di colorazione qui descritto.

Oltre ad evitare dannose meccanica del tessuto durante la post-mortem e post-dissezione fissazione di decalcificazione, il sezionamento dei tessuti potrebbe sembrare molto impegnativo. Il sezionamento di solito richiede abilità e pratica. Qualità della fetta dipende da molti aspetti such come regolare un angolo retto tra il blocco di tessuto e il coltello in modo da ridurre la pressione applicata sul campione durante il taglio, velocità di taglio, ecc Spessore delle fette di tessuto incluse in paraffina prodotti dalla slitta microtomo può variare da 2 a 50 micron. Tagliare le fette di tessuto paraffina sono montati da un bagno di acqua calda su vetrini preferibilmente commercialmente rivestiti con un adesivo, come poli-L-lisina o Aminopropyltriethoxysilane (APTS) al fine di garantire una migliore presa durante la procedura di colorazione esigenti. In contrasto crio sezioni di tessuto che vengono tagliati a circa -20 ° C usando criomicrotomo ed essiccato a RT prima della colorazione, raffreddati blocchi di paraffina sono tagliati a RT, e successivamente essiccato a 50- 60 ° C prima della deparaffinazione.

Altamente conservato l'architettura dei tessuti, morfologia cellulare e di destinazione epitopi sono essenziali per valutare la localizzazione e l'interrelazione delle proteine ​​bersaglio. Al fine di raggiungere preser tessuto ottimalevazione, i campioni devono essere adeguatamente fissato, utilizzando coagulazione o fissativi cross-linking. fissativi coagulanti, come l'etanolo, sono più spesso utilizzati per la crioconservazione. Protein denaturazione usando etanolo è ottenuto attraverso il tessuto disidratazione 9; che può provocare inadeguata conservazione cellulare 16. In contrasto fissativi coagulazione, la formaldeide è una reticolazione fissativo che è più frequentemente usato in istologia di routine e IHC 9 sia per la conservazione dei tessuti cryo- e paraffina. Abbiamo ottenuto un fissaggio ottimale per il ratto SNC e LN immergendolo in una soluzione di formaldeide per 24 ore a 4 ° C prima di decalcificazione e successiva incorporazione paraffina. Nonostante provocando profondi cambiamenti nella conformazione delle macromolecole (formaldeide e cioè forma ponti di metilene che reticolano proteine ​​e, quindi, mascherano gli antigeni, che possono impedire legame specifico di anticorpi), questo semi-reversibili, reagente covalente fornisce alta qualla conservazione dei tessuti lità. In particolare, la temperatura e la durata di fissazione con reagenti reticolazione possono influire diversi aspetti IHC come sezionamento, rilevamento epitopo e anche reattività crociata. Così sia sotto fissazione e over-fissazione utilizzando reagenti aldeide-based come la formaldeide può causare artefatti che sono dovuti principalmente a autolisi o eccessivi legami incrociati 17, rispettivamente. Tuttavia, una colorazione di fondo non specifico dovuto proteina idrofobica legame osservato da overfixation può essere ridotto utilizzando basse tamponi salate contenenti detergenti non ionici, o aumentando il pH del tampone di diluizione quando si utilizza policlonali Abs 18. Tuttavia, una colorazione di fondo aspecifica (rumore) causata da interazioni proteina ioniche ed elettrostatiche potrebbe essere ridotto utilizzando buffer diluente ad elevata forza ionica, che allo stesso tempo può aggravare il rumore causato dal legame proteina idrofobica 18. Quando si tratta di rilevamento degli epitopi bersaglio, formaldeide-ialterazione nduced della struttura terziaria delle proteine può essere, anche se non del tutto, invertito dall'antigene recupero 19: i) mediante riscaldamento in buffer con diversi valori di pH (indotta dal calore epitopo recupero (HIER), ii) per degradazione enzimatica (proteasi indotta smascheramento (PIER; 20)), iii) mediante incubazione in forte alcalini o soluzione acida, o saccarosio 21, 22 o iiii) per trattamento con acido formico concentrato 23. HIER appare conveniente per la maggior parte del target epitopi 19. Inoltre durata riscaldamento, pH delle soluzioni come EDTA (pH 5.5, 8.5 o 9.0) o tampone citrato di sodio (pH 6.0- 6.2) può essere essenziale per l'esito di HIER. In particolare, il risultato più soddisfacente nel nostro studio è stato ottenuto vapore campioni per 1h nella soluzione di EDTA con il valore di pH 8,5.

Anche se gli anticorpi si legano preferenzialmente ai loro epitopi specifici, attrazione per aspecifica, simile al cognate Ag vincolantesiti, non possono essere completamente esclusi. In particolare, probabilmente il metodo più efficiente per ridurre la colorazione di fondo è incubazione nel bloccare proteine (come FCS utilizzati nel nostro studio) prima dell'applicazione di Abs primaria 9. Monoclonali primari Abs sono comunque preferito su Abs policlonale causa di una maggiore specificità e quindi la riduzione del segnale di fondo aspecifica. Tuttavia, ancora potrebbe apparire cross-reattività, come Abs monoclonali sono diretti contro epitopi comunemente costituiti da un piccolo numero di amminoacidi, che può essere una parte di un altro (non specifica) proteina 24. A differenza monoclonale, Abs policlonali hanno una maggiore probabilità di riconoscere molteplici isoforme della proteina bersaglio. Inizialmente abbiamo usato due diversi Abs primario per rilevare CCL11: i) un policlonale cresciuto in capra e ii) un anticorpo monoclonale cresciuto in mouse. Nelle nostre mani, entrambi i prodotti esposti lo stesso pattern di colorazione per la chemochina bersaglio. Per eseguire simultaneamente co-colorazione, abbiamo usato capra anti topo CCL11 Ab in combinazione con gli anticorpi contro Iba-1, Ed1 e CD8, rispettivamente, che sono stati prodotti in topo. Tuttavia, oltre simultaneamente, doppia immunostaining può anche essere eseguita in sequenza 25, come richiesto per co-etichettatura della Abs primaria prodotta nella stessa specie.

La concentrazione ottimale dei Abs utilizzati nel nostro studio di lavoro è stato stimato attraverso serie di test di diluizione come un rapporto ottimale tra l'intensità del segnale specifico e il rumore di fondo. Tuttavia, va tenuto presente che una concentrazione ottimale dello stesso anticorpo lavoro può talvolta variare tra organi, specie, patologia sfondo, ecc In particolare, permeabilizzazione non era richiesto nella nostra procedura di colorazione eseguita in paraffina, 3-5 micron sezioni di tessuto di spessore, tuttavia, detergenti come Triton X-100 potrebbero ancora sono stati utilizzati per ridurre la tensione superficiale e facilitare così l'associazione tra antigene e anticorpo. SulAnzi, il miglioramento permeabilization- mediata di penetrazione Ab è comunemente richiesto per la rilevazione delle proteine ​​nelle cellule o sospensioni di cellule in coltura (immunocitochimica (ICC)), per immunofluorescenza (IF) in sezioni crio e IHC / IF a fresco (, vibratome taglio di spessore) free- fette di tessuto fluttuante.

controlli multipli sono essenzialmente importante per la generazione di specifiche immunotargeting / affidabile. Come controllo positivo, abbiamo utilizzato i polmoni da un modello di ratto di asma, dove abbiamo potuto rilevare CCL11 + eosinofili. I controlli negativi sono stati incubati solo nella soluzione bloccante o / n a 4 ° C in assenza di Abs primario.

Abbiamo già accennato alcune cause e possibili soluzioni per la riduzione di un segnale di fondo. Un prodotto immunostaining aspecifica può anche verificarsi come reazione tra DAB e pseudoperossidasi dei globuli rossi e perossidasi delle cellule mieloidi 26. Attività di questi enzimi, proprio come i Caus rumorecati da biotina endogena o AP è già stata ridotta durante formalina fissazione. Tuttavia, il pretrattamento con metanolo / H 2 O 2 è necessaria per il loro ulteriore o completa inattivazione 27, 28. Sfondo colorazione provocata dall'attività AP nei tessuti dei mammiferi può essere ulteriormente inibita da levamisolo 29, o acido acetico 29. Legame aspecifico come il risultato di attrazione ionica tra avidina e molecole cellulari di carica opposta 30 possono essere evitati sostituendo avidina dal bianco d'uovo con streptavidina da Streptomyces avidinii 31.

DAB è probabilmente il cromogeno più frequentemente usato in IHC. Oltre DAB (prodotto di reazione marrone), altri cromogeni perossidasi in uso sono 3-ammino-9-etilcarbazolo (AEC, rosso), 4-cloro-1-naftolo (CN, blu) e tetrametilbenzidina (TMB, blu). cromogeni AP comunemente scelti sono FB, Fast Red (FR), nuova fucsina e 5-bromo-4-cloro-3-indolylphosphate / nitro blue tetrazolio cloruro (BCIP / NBT). La scelta di enzimi e cromogeni è fondamentalmente una questione di preferenza specifica, tuttavia, può essere guidato dalle caratteristiche bersaglio come localizzazione, pattern di espressione, ma anche dalla presenza di pigmenti endogeni (melanina, emosiderina) 32. Di contrasto è l'ultimo passo facoltativa della procedura IHC di solito eseguita con ematossilina, nucleare rosso veloce o metile verde 18. Generalmente più adatto per il singolo etichettatura, di contrasto facilita l'interpretazione della morfologia tissutale e dovrebbe essere sottilmente sviluppato per evitare qualsiasi interferenza con il precipitato cromogeno.

Al termine delle sezioni di tessuto procedura di colorazione deve essere montato accuratamente con coprioggetto utilizzando un mezzo di montaggio. La formazione di bolle d'aria deve essere evitato. Accanto a protezione fisica, mezzo di montaggio migliora la visualizzazione e la qualità delle immagini. In entrambi i casi organico / idrofobiche o acquosa / idrofilo, il choice del mezzo di montaggio dipende solubilità del prodotto finale nel solvente organico. Mentre un mezzo di montaggio a base di toluene sarebbe adatto, ad esempio, per DAB, mezzo di montaggio acquoso può essere applicato a tutti i cromogeni enzimatici, compresa l'etichettatura fluorescenza.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) Baxter 1001936060 Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment.
Sodiumchloride (NaCl) Merck 1.0604
Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet Sigma-Aldrich P4417
Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% in 1x PBS Apl pharma 34 24 28 Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity.
Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) Sigma-Aldrich 459844-1L Flamable.
Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 Sigma-Aldrich 534056 Flamable. Acute toxicity.
Histo-Comp Paraffin Wax Tissue-Tek V0-5-1001
Adhesive Microscope Slides Starfrost MIC-1040-W
Xylol substitute XEM-200 Vogel GmbH ND-HS-200 Respiratory sensitization. Carcinogenicity.
α-CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody AbD Serotec MCA48G
α-Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody Millipore MABN92
α-CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody AbD Serotec MCA341R
α-eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody Santa Cruz BT SC-6181
Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody Dakopatts, Denmark D0314
Biotinylated secondary antibody Amersham Biotech RPN1025
Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) Sigma-Aldrich A3151
Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) Sigma-Aldrich N4875-1G Acute toxicity.
Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) Sigma-Aldrich FBS25
Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) Sigma-Aldrich 31742 Acute toxicity.
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) DAKO S3000 Highly flammable. Toxic.
Copper sulphate (CuSO4) Merck 1.02791 Acute toxicity. Environmental hazzard.
GelTol Aqueous Mounting Medium Thermo Electron Corporation 230100
Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) Merck 107210 Acute toxicity.
Methanol (CH3OH) Fluka 65543 Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable.
Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) AppliChem A1379 Skin and eye irritation.
Tris Buffered Saline (TBS), tablet Sigma-Aldrich T5030
Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) Merck 1.0658
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) Merck 1.06346
Fetal calf serum (FCS) Cambrex BioScience DE-14-802F
DAKO cytomation wash buffer 10x DAKO S3006 Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming.
N,N-Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) Fluka 40250 Flammable. Acute toxicity.
Glas coverslips 24 x 36 mm Menzel-Gläser BB024036A1
Hydrochloric acid, conc. (HCl) Sigma-Aldrich 30721 Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.
Hydrochloric acid solution volumetric, 2 M HCl (2 N) Fluka 71826 Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.
Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) Sigma-Aldrich S2252 Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment.
Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) Merck 1.08454 Oral exposures may cause reproductive and developmental effects.
Equipment
Tissue-TekV.I.P Vacuum Infiltration Processor Sakura 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz
Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome Hacker instruments
Household food steamer Braun MultiGourmet FS 20
Light microscope Leica Polyvar 2

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