Analyse immunohistochimique dans le système nerveux central et périphérique Rat ganglionnaire sections de tissu

Neuroscience

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Adzemovic, M. Z., Zeitelhofer, M., Leisser, M., Köck, U., Kury, A., Olsson, T. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. J. Vis. Exp. (117), e50425, doi:10.3791/50425 (2016).

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Abstract

Immunohistochimie (IHC) permet une visualisation très spécifique, fiable et attrayante protéine. Des performances correctes et l'interprétation d'un étiquetage multicolore à base d'IHC est difficile, surtout lorsqu'il est utilisé pour évaluer les interrelations entre les protéines cibles dans le tissu avec une teneur élevée en matières grasses telles que le système nerveux central (SNC).

Notre protocole représente un perfectionnement de la technique d'immuno-marquage norme particulièrement ajustée pour la détection des deux protéines structurales et solubles dans le SNC de rat et de ganglions lymphatiques périphériques (LN) affecté par la neuro-inflammation. Néanmoins, avec ou sans autres modifications, notre protocole pourrait probablement être utilisé pour la détection d'autres cibles de protéines apparentées, même dans d'autres organes et des espèces que présenté ici.

Introduction

Malgré l'utilisation de pointe à haut débit les analyses effectuées sur le méthylome, transcriptome ou même au niveau du protéome, immunomarquage reste l'étalon or pour la détection de protéines directement dans l'échantillon de tissu, culture cellulaire ou un frottis cellulaire. En révélant le motif de localisation / distribution, immunohistochimie (IHC) peut évaluer les rapports relatifs et interrelations topographiques des protéines cibles, et même indiquer leurs activités biologiques. Par conséquent, IHC est largement utilisé à des fins cliniques et de recherche, par exemple, pour le diagnostic, les évaluations de traitement, l' étude des mécanismes de la maladie, des altérations fonctionnelles et phénotypiques dans des modèles animaux, etc.

Comprenant essentiellement l' histologie, la pathologie, la biochimie et l' immunologie, IHC a considérablement progressé depuis 1941, lorsque les anticorps marqués par fluorescence ont été utilisés pour la première fois pour identifier des antigènes pneumococciques dans le tissu infecté 1. Visualization des produits et des composants par IHC cellulaires est basée sur la liaison des anticorps (Abs) à leur antigène spécifique (Ag). En plus d' utiliser des anticorps fluorophores marqués, les réactions immunitaires peuvent également être visualisés à l'aide d' enzymes comme la peroxydase ou la phosphatase alcaline 2,3 4. En outre, des anticorps marqués de l' or colloïdal 5 sont utilisés pour détecter l' interaction antigène-anticorps spécifique à la fois par la lumière et par microscopie électronique, tandis que des marqueurs radioactifs sont visualisées par autoradiographie.

Le immunoréaction Ag-Ab peut être détectée par des méthodes directes et indirectes. La méthode directe est essentiellement plus rapide et plus simple, car il utilise directement marqué Abs primaire 6. Cependant, en raison du manque de sensibilité significative, les méthodes indirectes sont préférées aux directs. Procédures de détection indirecte en deux étapes nécessitent Abs primaire non marqués, comme le premier, et étiquetés Abs secondaires dirigés contre le Abs primaire, la seconde couche 7.l'amplification du signal peut être obtenue en associant en outre, une enzyme couplée tertiaire Ab (trois étapes méthode indirecte) qui se fixe à l'Ac secondaire. des procédés de détection indirecte couramment utilisés sont la biotine et l'avidine-peroxydase de antiperoxydase (PAP). En variante, la phosphatase alcaline phosphatase antialkaline complexe (APAAP) peut être utilisé à la place de la méthode PAP. Notamment, la phosphatase alcaline (AP) méthodes semblent être encore plus sensible que les méthodes d'immunoperoxydase 4. méthode de complexe avidine-biotine (ABC) utilise biotinylé Ab secondaire en combinaison avec soit étiqueté complexe avidine-biotine (LAB), ou étiqueté streptavidine-biotine complexe (SLAB). La sensibilité de détection peut être encore augmentée en y associant l' avidine marquée à la peroxydase ou la phosphatase alcaline 8. D' autres méthodes de détection utilisées sont l' étiquetage polymère, tyramine amplification et immuno-cercle roulant 9. En particulier, les différentes méthodes de détection peuvent être combinés pour la détection multiple Ag dans le même tissuéchantillon, qui a été signalé pour la première fois en 1978 4. à double immunocoloration simultanée présentée ici a été réalisée dans des coupes de tissus fixés au formol, rat de paraffine et du SNC LN en utilisant des anticorps secondaires peroxydase lié et AP-conjugués, respectivement. Les signaux ont été visualisées en utilisant 3,3'-diaminobencidine (DAB) chromogène et le Fast Blue (FB) APAAP complexe, respectivement.

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Protocol

Déclaration éthique
Présente étude est réalisée conformément aux lignes directrices de l'Office national suédois pour les animaux de laboratoire et de la directive du Conseil Communauté européenne (86/609 / CEE) en vertu des permis éthiques N338 / 09, N15 / 10 et N65 / 10, qui ont été approuvés par le Comité du Nord de Stockholm animal éthique.

1. Préparation des tissus

  1. Perfusion et fixation
    1. Anesthetize l'animal avec de l'isoflurane pour effectuer la perfusion transcardial via ventricule gauche. Amorcer le rinçage du système vasculaire avec du tampon phosphate salin (PBS) pour éliminer les composants du sang, suivie par 4% de paraformaldehyde dans du PBS 0,1 M (PFA).
    2. Fixer les cerveaux disséqués, la moelle épinière et des tissus LN périphérique par immersion en PFA. Après 24 heures à 4 ° C, transférer le tissu de PFA dans du PBS et conserver à 4 ° C jusqu'à un traitement ultérieur. Alternativement à PBS commercial, dissoudre 9 g de NaCl dans 250 ml du S &# 246; tampon rensen et ajouter 750 ml d' eau déminéralisée (dH 2 O); pour préparer 0,2 M de tampon Sörensen (pH 7,4) , dissoudre 13,8 g de NaH 2 PO 4 x 1 H 2 O et 71,2 g de Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O dans 2,5 L dH 2 O.
  2. Déshydratation et intégration
    1. Couper le tissu dans des parties épaisses d'environ 5 mm en utilisant une lame de rasoir.
    2. Initier le processus de durcissement du tissu (déshydratation) en utilisant le vide VIP Infiltration Processeur Tissue-Tek (procédure standard basée sur l' immersion dans des concentrations croissantes d'éthanol, suivi par du xylène et enfin la paraffine (tableau 1).
    3. Placez le tissu dans un moule et versez dans la paraffine liquide autour de l'échantillon pour former un «bloc de paraffine". Le stockage à long terme nécessite la température ambiante (RT). Cependant, avant la coupe, il est recommandé de refroidir les blocs, par exemple pendant une nuit (o / n) à 4 ° C.

2. Sectionnement

  1. Placer le bloc de paraffine dans un support fixe du microtome traîneau, qui peut se déplacer d'avant en arrière à travers le couteau. Ajuster l'angle optimal entre le bloc et la lame de microtome (qui dépend de la géométrie du couteau, mais aussi de la vitesse de coupe et de la technique).
  2. Couper 3-5 um d'épaisseur des sections transversales du bloc de paraffine.
  3. Transfert section simplement couper dans un récipient d'eau et monter ensuite de l'eau sur la lame de verre.
  4. Appuyez sur la section montée avec précaution contre une serviette en papier pour éliminer l'eau résiduelle et les bulles d'air éventuelles. des lames de verre adhésives commercialement pré-revêtus sont à recommander.
  5. Dry diapositives montées pour un couple d'heures dans une étuve à 50 - 60 ° C.

3. Déparaffinage (Réhydratation et blocage de l'Endogène peroxydase)

  1. Immergez les diapositives 2x dans le xylène (substitut alternativement xylèneXEM-200), chaque fois 15 - 20 '.
  2. Rincer à l'éthanol à 99%.
  3. Pour bloquer l'activité de peroxydase endogène, incuber les sections pendant 30 minutes dans une solution de methanol contenant 0,25% de peroxyde d'hydrogène.
  4. Continuer la réhydratation en utilisant de l'éthanol avec l'augmentation de la teneur en eau (99%, 70%, de se retrouver dans l'eau distillée.
  5. De ce point jusqu'à ce que le montage du couvercle glisse sections doivent être maintenus humides.

4. Antigène Retrieval

  1. Utilisez un cuiseur pour faire bouillir les lames dans une solution de récupération d'antigène (dans ce cas EDTA pH 8,5 tampon) 60 '(stock tampon solution d'EDTA contient 1,21 g de Tris et 0,37 g d' EDTA dans 50 ml dH 2 O; pour préparer le travail 2.5ml EDTA solution mère solution diluée dans 47,5 ml 2 O dH).
  2. Refroidir les lames sur la température ambiante pendant env. 1 h, puis rincer 3 - 5x avec une solution saline tamponnée Tris (TBS, utiliser alternativement PBS) constitué de Tris 0,05 M et 0,15 M de NaCl; pH 7,5 ajusté wie HCl. Vous pouvez également utiliser le SCT commercial.

5. Le blocage des sites de liaison Unspecific

  1. Pour éviter des réactions de fond non spécifiques, incuber les sections sur RT pour 30 'dans la solution de blocage contenant 10% de sérum de veau foetal (FCS) et le tampon DAKO 90%.

6. Double immunomarquage: Incubation simultanée avec les Abs primaires

  1. Diluer quantité requise d'anticorps primaires dans la solution de blocage et incuber o / n à 4 ° C. Pour la double immunocoloration combiner α-éotaxine (CCL11, 1: 300) avec α-CD68 (Ed1; 1: 1000) ou α-Iba1 (AIF1, 1: 1000) ou α-CD8a (Ox-8; 1: 200) .
  2. Rincer les lames 3-5x avec un tampon TBS (utiliser un tampon DAKO alternativement 10x dilué).
  3. Diluer quantité requise d'anticorps secondaire (anti-chèvre biotinylé anti-souris et de l'AP-conjugué, à la fois 1: 200) dans de la solution de blocage et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
  4. Rincer les lames 3 - 5x avec du tampon TBS (nouse alternativement 10x dilué tampon DAKO).
  5. Incuber les lames avec un complexe avidine-peroxydase de raifort (HRP) diluée dans la solution de blocage pendant 1 heure à température ambiante.
  6. Rincer les lames 3 - 5x avec du tampon TBS (utiliser un tampon DAKO alternativement 10x dilué).

7. Visualisation

  1. La visualisation de l'anticorps secondaire marqué AP lié
    1. Préparer un tampon 0,1 M de Tris-HCl en dissolvant 12,1 g de Tris dans 1 L dH2Û et ajuster le pH à l'aide de HCl. En utilisant le même tampon Tris-HCl pour préparer une solution 1 M de lévamisole. Préparer fraîchement solution à 4% NaNO2 dans dH 2 O.
    2. Pour obtenir 50 ml de bleu (FB) substrat rapide (volume requis pour une cuvette de verre standard) dissoudre 6,25 mg Naphtol-AS-MX-Phosphate dans 312,5 pi de DMF dans le tube de verre et remuer dans 50 ml de pré-chauffé (37 ° C) du tampon Tris-HCl. Pour dissoudre 12,5 mg FB RR sel dans 312,5 pi 2 N HCl ajouter 312,5 pi de prepa précédemmentrouge 4% NaNO2 solution et agiter le mélange dans les mêmes 50 ml de tampon Tris-HCl préchauffée. Agiter légèrement jusqu'à ce que le liquide jaune devient clair et enfin ajouter 77 pi de solution préalablement préparée 1 M lévamisole. Filtrat obtenu le mélange et versez sur des lames placées dans la cuvette de verre.
    3. Initier l'incubation à 37 ° C et de contrôler le développement de processus sous le microscope optique env. toutes les 15 - 30 min. Si tournant floue, remplacer la solution de FB avec le mélange frais.
    4. Rincer les lames 3 - 5x avec du tampon TBS et le transfert par la suite dans le tampon PBS.
  2. Visualisation de l'anticorps secondaire biotinylé lié
    1. Préparer DAB / H 2 O 2 solution de développement en diluant 1 ml DAB solution mère (25 mg DAB par 1 ml PBS) dans 49 ml de PBS. Ajouter 16,5 ul de H 2 O 2 et le filtrat avant de verser sur les sections.
    2. La conversion du DAB chromogène en front précipitantn pigment peut être immédiate. Contrôler le processus de développement au microscope optique (même de quelques secondes une incubation plus longue peut soulever un bruit de fond élevé et masque le signal spécifique).
    3. L'intensité du pigment précipité brun peut alternativement être améliorée par une incubation dans la solution constituée de 2% de sulfate de cuivre et 0,9% de NaCl pendant 5 '.
    4. Rincer les lames 3 - 5x avec du PBS et finalement avec dH 2 O, utiliser alternativement l' eau du robinet.
    5. Monter les lames avec couvercle glisse directement à partir de l'eau en utilisant un milieu de montage aqueux GelTol. Évitez de créer des bulles d'air.
    6. Autoriser le séchage complet du support de montage, par exemple, o / n à 4 ° C. Magasin séché diapositives sur RT.
1. % d'éthanol 20 ' 40 ° C,
2. % d'éthanol 60 &# 39; 40 ° C,
3. % d'éthanol 90 ' 40 ° C,
4. % d'éthanol 60 ' 40 ° C,
5. % d'éthanol 90 ' 40 ° C,
6. % d'éthanol 60 ' 40 ° C,
7. % d'éthanol 90 ' 40 ° C,
8. % d'éthanol 120 ' 40 ° C,
9. Xylol 30 ' 40 ° C,
dix. Xylol 60 ' 40 ° C,
11. Paraffine 60 ' 60 ° C,
12. Paraffine 60 ' 60 ° C,
13. Paraffine 60 ' 60 ° C,
14. Paraffine 120 ' 60 ° C,

Tableau 1. Traitement des tissus par Tissue-Tek Vacuum VIP Infiltration Processor.

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Representative Results

immunomarquages ​​doubles (co-Colorations) ont été réalisées dans fixés au formol, rat de paraffine sections CNS et LN. 3-5 um tranches de tissu d' épaisseur ont été découpées à l' aide d' un microtome de traîneau, monté ensuite sur des lames de verre adhésives pré-enduits et traités comme décrit précédemment 10,11,12. En bref, après déparaffinage, réhydratation des tissus et de la peroxydase endogène, l'inactivation, des sections ont été soumises au processus de récupération d'antigène, suivie d'une étape de blocage afin d'éliminer les sites de liaison non spécifiques. Les co-colorations ont été réalisées dans les combinaisons suivantes: i) CCL11 / Iba-1, ii) CCL11 / Ed1 et iii) CCL11 / CD8. Le Abs primaire utilisé pour chaque co-coloration ont été soulevées dans deux espèces différentes (de chèvre et de la souris, respectivement), ce qui a permis leur incubation simultanée. CCL11 a été visualisée par le produit de réaction de la peroxydase brune, tandis que Iba-1, Ed1 et CD8 ont été visualisées par le signal bleu AP.

10. Selon l'IHC analyses effectuées chez le rat du système nerveux central, CCL11 était présent dans pericarya, les dendrites et les axones des neurones situés dans les cornes ventrales de la substance grise de la moelle épinière (figure 1A et B). En outre, les cellules CCL11 + plasmatiques individuelles étaient détectables dans les sections de tissu même (figure 1A), ainsi que seul CCL11 + / Ed1 + macrophages et les cellules microgliales résidentes du cerveau observées au site d'inflammation (données non représentées; Ed1 est un marqueur de protéine lysosomique dans les macrophages activés et la microglie 13). Notamment, CCL11 chimiokine n'a pas été trouvé de co-localisant avec Iba-1 + macrophages et les cellules microgliales cerveau résidents (1A; Iba-1 est un marqueur pour la détection de Ca2 * ionisé -bindi ng de protéine 14).

La protéine de ciblage à base d'IHC réalisée dans le LN périphérique de rat présentait une protéine CCL11 co-localisation avec Ed1 (figure 2B). Cependant, aucun des lymphocytes T CD8 + sécrétant de CCL11 étaient détectables dans des coupes de tissus identiques (figure 2A, les cellules CD8 + ont été détectées en utilisant l' anti-CD8a, un marqueur pour les cellules T cytotoxiques qui se lient essentiellement à des molécules du CMH de classe I 15). À l'exception de l'omission Abs primaire au cours o / n incubation dans la solution de blocage, les sections de contrôle ont été traités comme décrit dans le protocole. Aucun signal de détection des protéines cibles (telles que présentées sur les figures 1A, B et 2A, B) ont été observées dans les sections du système nerveux central et LN commande (figure 1C et 2C, respectivement).

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Figure 1. A, B: Double immunocoloration dans la LN Rat. Les anticorps primaires dirigés contre les chimiokines CCL11 en combinaison avec l' α-CD8 (A) ou Ed1 (B). Pas de co-localisation dans la même cellule a été observée pour CCL11 + (marron) et les cellules CD8 + (bleu) B:. Signal de détection CCL11 (brun) co-localisant avec le marqueur pour une protéine lysosomale dans les macrophages (Ed1, bleu). C: contrôle négatif; un détail montrant des cellules résidentes non marquées dans la LN périphérique. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. A, B: double immunocoloration chez le rat SCord pinal. Corne ventrale de la matière grise présentant CCL11 dans pericarya neuronales, dendrites et des axones (brun) co-colorées avec soit Iba-1 + (A, bleu) ou ED1 + (B; bleu) macrophages / cellules microgliales C:. Contrôle négatif; un détail montrant des cellules résidentes non marquées dans la corne ventrale de la moelle épinière matière grise. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

les procédures IHC standard nécessitent souvent des ajustements spécifiques pour obtenir un résultat optimal, ce qui implique généralement une grande expérience, mais aussi l'approche "essais et erreurs". De la préparation des tissus jusqu'à la visualisation cible, presque chaque étape du protocole peut être soumis à des modifications conçues individuellement afin d'améliorer le résultat final. Double protocole de coloration présenté ici illustre la protéine à base de IHC ciblant particulièrement adapté pour évaluer les interrelations entre les protéines cibles de notre intérêt pour des coupes de tissus du système nerveux central et LN fixés au formol, rat de paraffine affectées par neuroinflammation. En tant que tel, il peut être utilisé comme un didacticiel pour l'apprentissage de la technique de CSI, mais aussi comme une source d'inspiration pour les essais les plus avancés. Cependant, il faut garder à l'esprit qu'une simple reproduction de ce protocole pour cibler d'autres protéines et / ou dans d'autres tissus que présenté ici peut générer des résultats optimaux.

L'hybridation in situ en utilisant l' acide nucléique (LNA) ribosonde bloquée contre CCL11 présentait une régulation positive des niveaux d'ARNm respectifs dans le SNC de la souche de rat 10 congéniques. Cette constatation a été confirmée par qPCR analyse. En outre, qPCR révélé CCL11 surexpression aussi dans la LN périphérique congenic par rapport à la souche de type sauvage (wt). Enfin, Western Blot (WB) a montré une régulation positive significative de la protéine CCL11 dans les deux tissus cibles de la souche de rat congenic maladie protégée 10. Par conséquent, nous avons cherché à enquêter sur l'origine de cette chimiokine directement dans les tissus cibles, et à cette fin nous avons développé le protocole de coloration à double décrite ici.

En plus d'éviter d'endommager mécanique du tissu pendant le post-mortem dissection et post-fixation décalcification, tronçonnage des tissus peut sembler assez difficile. Le tronçonnage nécessite généralement des compétences et de la pratique. Qualité de la tranche dépend de nombreux aspects sUCH comme le réglage d' un angle droit entre le bloc de tissu et le couteau afin de réduire la pression exercée sur l' échantillon en cours de coupe, la vitesse de coupe, etc. , l' épaisseur des tranches de tissu inclus dans la paraffine produite par le traîneau microtome peut varier de 2 à 50 um. Couper des tranches de tissu de paraffine sont montés à partir d'un bain d'eau chaude sur des lames de verre revêtues de préférence dans le commerce avec un adhésif tel que la poly-L-lysine ou aminopropyltriéthoxysilane (APTS) afin d'assurer une meilleure tenue lors de la procédure de coloration exigeant. Contrairement aux cryo des coupes de tissu qui sont découpées à environ -20 ° C en utilisant cryomicrotome et séché à la température ambiante avant la coloration, on refroidit les blocs de paraffine sont coupées en tranches à la température ambiante, puis on sèche à 50- 60 ° C avant le déparaffinage.

Hautement conservé l'architecture tissulaire, la morphologie des cellules cibles et des épitopes sont essentiels pour évaluer la localisation et l'interaction des protéines cibles. Afin d'atteindre préser optimale des tissusvation, les échantillons doivent être fixés correctement, en utilisant soit coagulant ou fixateurs de réticulation. coagulantes fixateurs, tels que l'éthanol, sont plus souvent utilisés pour la cryoconservation. Dénaturation des protéines en utilisant l' éthanol est obtenu par déshydratation du tissu 9; ce qui peut entraîner la conservation cellulaire insuffisante 16. Par contraste avec les fixateurs de coagulation, le formaldéhyde est un réticulant fixatif qui est le plus fréquemment utilisé dans l' histologie de routine et 9 IHC tant pour la préservation des tissus cryogénie et la paraffine. Nous avons réalisé une fixation optimale pour le système nerveux central de rat et LN par immersion dans une solution de formol pendant 24 heures à 4 ° C avant de décalcification et de paraffine subséquente enchâssement. Malgré provoquer des changements profonds dans la conformation des macromolécules (formaldéhyde à savoir forme des ponts méthylène qui réticulent les protéines et donc masquent les antigènes, qui peuvent empêcher la liaison spécifique des anticorps), ce semi-réversible, réactif covalente fournit haute quallité préservation des tissus. En particulier, la température et la durée de fixation avec des réactifs de reticulation peuvent influer sur plusieurs aspects tels que l'IHC sectionner, la détection de l'épitope et de même réactivité croisée. Ainsi , les deux sous-fixation et sur-fixation en utilisant des réactifs à base d' aldéhyde tels que le formaldéhyde peuvent causer des artefacts qui sont principalement dues à l' autolyse ou excessives liaisons transversales 17, respectivement. Néanmoins, une coloration de fond non spécifique due à une protéine observée par liaison hydrophobe overfixation peut réduire l' aide de tampons salés contenant des détergents non ioniques à faible ou en augmentant le pH du tampon de dilution lors de l' utilisation des anticorps polyclonaux dirigés 18. Toutefois, une coloration de fond non spécifique (bruit) provoquée par des interactions ioniques , des protéines et électrostatiques pourrait être réduite en utilisant des tampons de dilution avec une force ionique élevée, ce qui en même temps , peut aggraver le bruit causé par la protéine de liaison hydrophobe 18. Quand il vient à la détection d'épitopes cibles, le formaldéhyde-il' altération nduced de la structure tertiaire des protéines peut être, mais pas uniquement, inversé par la récupération de l' antigène 19: i) par chauffage dans les tampons ayant différentes valeurs de pH (de l' épitope induite par la chaleur (HIER), ii) par la dégradation enzymatique (protéase induite par épitope (PIER; 20)), iii) par incubation dans une forte solution alcaline ou acide, ou du saccharose 21, 22 ou iiii) par traitement avec l' acide formique concentré 23. HIER apparaît commode pour la majorité de la cible épitopes 19. En plus de la durée du chauffage, de la valeur du pH des solutions telles que l'EDTA (pH 5,5, 8,5 ou 9,0) ou de tampon citrate de sodium (pH 6.0- 6.2) peut être essentiel pour le résultat de HIER. En particulier, le résultat le plus satisfaisant dans notre étude a été réalisée par traitement à la vapeur des échantillons pendant 1 heure dans la solution d'EDTA à la valeur de pH 8,5.

Bien que les anticorps se lient de préférence à leurs épitopes spécifiques, à l'attraction non spécifique, semblable à l'Ag apparenté de liaisonles sites, ne peuvent pas être totalement exclues. En particulier, sans doute la méthode la plus efficace pour réduire la coloration de fond est une incubation dans le blocage de protéines (telles que SVF utilisées dans notre étude) avant l'application du primaire 9 Abs. Monoclonaux primaires Abs sont de toute façon préférée à Abs polyclonaux en raison de la spécificité plus élevée et par conséquent réduit le signal de fond non spécifique. Néanmoins, la réactivité croisée pourrait encore apparaître, comme Abs monoclonaux sont dirigés contre des épitopes généralement constitués d'un petit nombre d'acides aminés, qui peut être une partie d'un autre (non spécifique) protéines 24. Contrairement monoclonal, Abs polyclonaux ont une plus grande chance de reconnaître plusieurs isoformes de la protéine cible. Nous avons d'abord utilisé deux Abs primaire différente pour détecter CCL11: i) un anticorps polyclonal élevé dans la chèvre et ii) un anticorps monoclonal élevé chez la souris. Dans nos mains, les deux produits présentent le même motif de coloration pour la chimiokine cible. Afin d'effectuer la co-coloration simultanée, nous avons utilisé CCL1 de rat de chèvre antiAc 1, en combinaison avec les anticorps contre Iba-1, et Ed1 CD8 +, respectivement, qui ont tous été produits chez la souris. Néanmoins, outre simultanément, double immunocoloration peut également être effectuée de manière séquentielle 25, tel que requis pour co-marquage de l'Abs primaire produite dans la même espèce.

La concentration optimale de travail des Abs utilisées dans notre étude a été estimée à travers une série de test de dilution comme un rapport optimal entre l'intensité du signal spécifique et le bruit de fond. Cependant, il faut garder à l' esprit qu'une concentration optimale de travail du même anticorps peut parfois varier entre les organes, les espèces, les antécédents de pathologie, etc. Notamment, perméabilisation n'a pas été nécessaire dans notre procédure de coloration effectuée dans la paraffine incorporée, 3-5 pm coupes de tissus épais, cependant, les détergents tels que le Triton X-100 pouvait encore avoir été utilisés pour réduire la tension superficielle et à faciliter ainsi la liaison entre l'antigène et l'anticorps. Sur lecontraire une amélioration, permeabilization- médiation de pénétration Ab est généralement nécessaire pour la détection de protéines dans des cellules ou des suspensions de cellules cultivées (immunocytochimie (ICC)), pour l'immunofluorescence (IF) dans les sections cryo et IHC / IF en frais (épais, vibratome-cut) gratuités- flottante des tranches de tissu.

Plusieurs contrôles sont essentiellement importants pour générer Immunociblage spécifique / fiable. Comme témoin positif, nous avons utilisé les poumons d'un modèle de rat de l' asthme, où nous avons pu détecter CCL11 + éosinophiles. Les contrôles négatifs ont été incubés uniquement dans la solution de blocage O / N à 4 ° C en l'absence de l'ABS primaire.

Nous avons déjà mentionné certaines causes et les remèdes possibles pour la réduction d'un signal d'arrière-plan. Un produit de coloration immunologique non spécifique peut également se produire comme réaction entre DAB et pseudoperoxydase des globules rouges et de peroxydase des cellules myéloïdes 26. L'activité de ces enzymes, tout comme les caus de bruited par la biotine endogène ou AP a déjà été réduite au cours de la formaline fixation. Toutefois, le prétraitement avec du méthanol / H 2 O 2 est nécessaire pour la poursuite de leur inactivation complète ou 27, 28. Coloration de fond causé par l' activité AP dans les tissus de mammifères peut encore être inhibée par le 29 lévamisole, ou par l' acide acétique 29. La liaison non spécifique comme le résultat de l' attraction ionique entre l' avidine et les molécules cellulaires 30 charges opposées peuvent être évités en remplaçant l' avidine de blanc d'oeuf avec de la streptavidine à partir de Streptomyces avidinii 31.

DAB est probablement le chromogène le plus fréquemment utilisé en IHC. Outre DAB (produit de réaction brun), d'autres chromogènes de la peroxydase en cours d'utilisation sont 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC; rouge), 4-Chlor-1-naphtol (CN, bleu) et tétraméthylbenzidine (TMB, bleu). chromogènes AP couramment choisis sont FB, Fast Red (FR), nouvelle fuchsine et 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate / nitro blue chlorure de tétrazolium (BCIP / NBT). Le choix des enzymes et des chromogènes est essentiellement une question de préférence individuelle, cependant, il peut être dirigé par les caractéristiques cibles tels que la localisation, le motif d'expression, mais aussi par la présence de pigments endogènes (mélanine, hémosidérine 32). Counterstain est la dernière étape, facultative dans la procédure IHC habituellement effectuée en utilisant hématoxyline, rouge rapide nucléaire ou vert de méthyle 18. En général, plus approprié pour l'étiquetage unique, de contraste facilite l'interprétation de la morphologie des tissus et il devrait être subtilement conçu pour éviter toute interférence avec le précipité chromogène.

A l'issue de coupes de tissus de la procédure de coloration doit être monté avec soin avec une lamelle couvre-objet en utilisant un milieu de montage. La formation de bulles d'air doit être évitée. A côté de la protection physique, milieu de montage améliore la visualisation et de la qualité de l'imagerie. Soit organique / hydrophobe ou aqueuse / hydrophile, le choix du support de montage est fonction de la solubilité du produit final dans le solvant organique. Alors qu'un moyen de montage à base toluène- serait approprié, par exemple pour DAB, un milieu de montage aqueux peut être appliqué à tous les chromogènes enzymatiques, y compris marquage par fluorescence.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) Baxter 1001936060 Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment.
Sodiumchloride (NaCl) Merck 1.0604
Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet Sigma-Aldrich P4417
Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% in 1x PBS Apl pharma 34 24 28 Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity.
Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) Sigma-Aldrich 459844-1L Flamable.
Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 Sigma-Aldrich 534056 Flamable. Acute toxicity.
Histo-Comp Paraffin Wax Tissue-Tek V0-5-1001
Adhesive Microscope Slides Starfrost MIC-1040-W
Xylol substitute XEM-200 Vogel GmbH ND-HS-200 Respiratory sensitization. Carcinogenicity.
α-CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody AbD Serotec MCA48G
α-Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody Millipore MABN92
α-CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody AbD Serotec MCA341R
α-eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody Santa Cruz BT SC-6181
Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody Dakopatts, Denmark D0314
Biotinylated secondary antibody Amersham Biotech RPN1025
Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) Sigma-Aldrich A3151
Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) Sigma-Aldrich N4875-1G Acute toxicity.
Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) Sigma-Aldrich FBS25
Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) Sigma-Aldrich 31742 Acute toxicity.
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) DAKO S3000 Highly flammable. Toxic.
Copper sulphate (CuSO4) Merck 1.02791 Acute toxicity. Environmental hazzard.
GelTol Aqueous Mounting Medium Thermo Electron Corporation 230100
Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) Merck 107210 Acute toxicity.
Methanol (CH3OH) Fluka 65543 Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable.
Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) AppliChem A1379 Skin and eye irritation.
Tris Buffered Saline (TBS), tablet Sigma-Aldrich T5030
Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) Merck 1.0658
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) Merck 1.06346
Fetal calf serum (FCS) Cambrex BioScience DE-14-802F
DAKO cytomation wash buffer 10x DAKO S3006 Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming.
N,N-Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) Fluka 40250 Flammable. Acute toxicity.
Glas coverslips 24 x 36 mm Menzel-Gläser BB024036A1
Hydrochloric acid, conc. (HCl) Sigma-Aldrich 30721 Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.
Hydrochloric acid solution volumetric, 2 M HCl (2 N) Fluka 71826 Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.
Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) Sigma-Aldrich S2252 Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment.
Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) Merck 1.08454 Oral exposures may cause reproductive and developmental effects.
Equipment
Tissue-TekV.I.P Vacuum Infiltration Processor Sakura 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz
Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome Hacker instruments
Household food steamer Braun MultiGourmet FS 20
Light microscope Leica Polyvar 2

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References

  1. Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
  2. Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
  3. Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
  4. Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
  5. Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
  7. Polak, J. M., Van Noorden, S. Introduction to immunocytochemistry. Bios Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK. (2003).
  8. Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
  9. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).
  10. Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794 (2012).
  11. Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
  12. Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
  13. Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
  14. Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
  15. Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
  16. Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
  17. Hayat, M. Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. Kluwer Academic. New York. (2002).
  18. Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
  19. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
  20. Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
  21. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
  22. Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
  23. Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
  24. Nelson, P. N., et al. Monoclonal antibodies. Molecular pathology : MP. 53, 111-117 (2000).
  25. Van der Loos, C. Immunoenzyme multiple staining methods. Bios Scientifc publishers Ltd. New York. (1999).
  26. Elias, J. Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. ASCP Press. Chicago. (2003).
  27. Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
  28. Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
  29. Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
  30. Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
  31. Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
  32. Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).

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