Análise imuno-histoquímica no sistema nervoso central e periférico Rat linfonodo Tissue Secções

Neuroscience

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Adzemovic, M. Z., Zeitelhofer, M., Leisser, M., Köck, U., Kury, A., Olsson, T. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. J. Vis. Exp. (117), e50425, doi:10.3791/50425 (2016).

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Abstract

A imuno-histoquímica (IHQ) fornece a visualização de proteínas altamente específico, confiável e atraente. execução correcta e a interpretação de um rotulagem multicolor baseado no IHC é difícil, especialmente quando utilizado para avaliar as inter-relações entre proteínas alvo no tecido com um elevado teor de gordura, tais como o sistema nervoso central (SNC).

Nosso protocolo representa um aperfeiçoamento da técnica de imunomarcação padrão particularmente adaptado para a detecção de ambas as proteínas estruturais e solúveis no rato SNC e nódulos linfáticos periféricos (LN) por neuroinflama�o afectadas. No entanto, com ou sem modificações adicionais, o nosso protocolo poderia provavelmente ser utilizados para a detecção de outros alvos de proteína relacionados, mesmo noutros órgãos e espécies que aqui apresentados.

Introduction

Apesar de a utilização de técnicas avançadas de alto rendimento análises realizadas na methylome, transcriptoma ou até mesmo nível de proteoma, imunocoloração continua sendo o padrão ouro para detecção de proteína directamente na amostra de tecido, cultura celular ou um esfregaço celular. Ao revelar o padrão de localização / distribuição, imuno-histoquímica (IHQ) pode avaliar proporções relativas e inter-relações topográficas das proteínas alvo, e até mesmo indicar as suas atividades biológicas. Portanto, IHC é amplamente utilizada para fins clínicos e de pesquisa, por exemplo, para o diagnóstico, avaliações de tratamento, estudo dos mecanismos da doença, alterações funcionais e fenotípicas em modelos animais, etc.

Compreendendo essencialmente histologia, patologia, bioquímica e imunologia, IHC tem avançado de forma significativa desde 1941, quando os anticorpos marcados com fluorescência foram utilizados pela primeira vez para identificar antigénios pneumocócicos no tecido infectado 1. Visualization de produtos e componentes celulares por IHC é baseada na ligação de anticorpos (Abs) para o seu antigénio específico (Ag). Além disso, utilizando anticorpos etiquetados fluoróforo, reacções imunes pode também ser visualizada usando enzimas como peroxidase ou fosfatase alcalina 2,3 4. Além disso, os anticorpos marcaram-ouro coloidal 5 são usados para detectar a interacção específica antigénio-anticorpo por luz e microscopia electrónica, enquanto marcadores radioactivos são visualizadas por autorradiografia.

A imuno Ag-Ab pode ser detectado através de métodos diretos e indiretos. O método directo é essencialmente mais simples e mais rápido, uma vez que utiliza directamente marcado Abs primária 6. No entanto, devido à falta de sensibilidade significativa, métodos indirectos são preferidos para os directos. Procedimentos de detecção indirecta duas etapas requerem unlabeled Abs primária, como o primeiro, e rotuladas Abs secundários dirigidos contra o Abs primário, como a segunda camada 7.amplificação do sinal pode ser conseguida com o envolvimento mais, de enzima acoplada terciária Ab (três passos método indirecto) que se liga ao Ab secundário. métodos de detecção comummente usados ​​são indirectos avidina-biotina peroxidase-antiperoxidase e (PAP). Alternativamente, fosfatase alcalina fosfatase antialcalinos (APAAP) complexo pode ser usado em vez do método PAP. Notavelmente, fosfatase alcalina (AP) métodos parecem ser ainda mais sensível do que os métodos de imunoperoxidase 4. método de complexo avidina-biotina (ABC) utiliza Ab biotinilado secundário em combinação com avidina marcada com biotina complexo (LAB), ou estreptavidina marcada com biotina complexo (LAJE). A sensibilidade da detecção pode ser adicionalmente aumentada através do envolvimento de avidina marcada com peroxidase ou fosfatase alcalina 8. Outros métodos de detecção em uso são rotulagem polimérica, amplificação tiramina eo círculo 9 imuno-rolamento. Notavelmente, os diferentes métodos de detecção podem ser combinados para a detecção múltipla de Ag no mesmo tecidoamostra, que foi relatada pela primeira vez em 1978 4. imunomarcação dupla simultânea aqui apresentado foi realizado em fixado em formol e rato parafinado do SNC e LN cortes de tecidos utilizando anticorpos secundários ligados a peroxidase e AP-conjugados, respectivamente. Os sinais foram visualizados utilizando 3,3'-diaminobencidine cromogénio (DAB) e o Azul Rápido (FB) APAAP complexo, respectivamente.

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Protocol

Declaração de ética
O presente estudo é realizado em conformidade com as orientações do Conselho Nacional Sueco de Animais de Laboratório e a Directiva do Conselho da Comunidade Europeia (86/609 / CEE), sob as licenças éticas N338 / 09, N15 / 10 e N65 / 10, que foram aprovadas pelo Comissão de Ética do Norte Estocolmo animal.

1. Preparação do Tecido

  1. Perfusão e fixação
    1. Anestesiar os animais com isoflurano para realizar perfusão transcardial através do ventrículo esquerdo. Inicia-se a lavagem da vasculatura com salina tamponada com fosfato (PBS) para remover os componentes do sangue, seguido por paraformaldeído a 4% em PBS 0,1 M (PFA).
    2. Fixar cérebros dissecados, medula espinhal e tecido LN periférica por imersão em PFA. Após 24 h a 4 ° C, transferir o tecido de PFA em PBS e armazenar a 4 ° C até posterior processamento. Em alternativa ao PBS comercial, dissolver 9 g de NaCl em 250 ml da S &# 246; tampão Rensen e adicionar 750 mL de água desionizada (dH2O); para preparar tampão 0,2 M Soerensen (pH 7,4) dissolver-se 13,8 g de NaH 2 PO 4 x 1H 2 O e 71,2 g de Na 2 HPO 4 x 2H 2 O em 2,5 L de dH2O
  2. A desidratação e incorporação
    1. Cortar o tecido em cerca de 5 mm de espessura porções utilizando uma lâmina de barbear.
    2. Iniciar o processo de endurecimento do tecido (desidratação), utilizando o processador de vácuo Infiltração VIP Tissue-Tek (procedimento padrão com base em submersão em concentrações crescentes de etanol, seguindo-se o xileno e, finalmente, parafina (Tabela 1).
    3. Colocar o tecido em um molde e despeje a parafina líquida em torno da amostra de modo a formar um "bloco de parafina". armazenamento de longo prazo requer temperatura ambiente (RT). No entanto, antes do corte, é recomendável para arrefecer os blocos, por exemplo, durante a noite (O / N) a 4 ° C.

2. Seccionamento

  1. Colocar o bloco de parafina em um suporte fixo do micrótomo trenó, que pode mover-se para a frente e para trás através da faca. Ajustar o ângulo óptimo entre o bloco e a faca micrótomo (que depende da geometria da faca, mas também sobre a velocidade de corte e da técnica).
  2. Cortar 3-5 mm de espessura secções transversais do bloco de parafina.
  3. Transferir secção basta cortar em um recipiente de água e montá-lo posteriormente a partir da água sobre a lâmina de vidro.
  4. Pressione a seção montada cuidadosamente contra uma toalha de papel para remover a água residual e bolhas de ar em potencial. Comercialmente pré-revestidos lâminas de vidro adesivas são recomendáveis.
  5. Dry slides montados por um par de horas em um fogão em 50 - 60 ° C.

3. desparafinização (Reidratação e bloqueio da peroxidase endógena)

  1. Mergulhe as lâminas 2x em xileno (substituto alternativamente xilenoXEM-200), cada período de 15 - 20 '.
  2. Enxágüe em 99% de etanol.
  3. Para bloquear a actividade da peroxidase endógena, incubar as secções durante 30 minutos em solução de metanol contendo 0,25% de peróxido de hidrogénio.
  4. Continuar a reidratação usando etanol com o aumento do teor de água (99%, 70%, terminando-se em água destilada.
  5. A partir deste ponto até que a montagem da cobertura desliza seções tem que ser mantido úmido.

4. Antigen Retrieval

  1. Usar um vapor de alimentos para ferver as lâminas numa solução de recuperação de antigénio (neste caso de EDTA pH 8,5 tampão) durante 60 '(EDTA solução tampão contém 1,21 g de Tris e 0,37 g de EDTA em 50 ml de dH2O; para preparar o trabalho solução de 2,5 ml de EDTA em solução diluída de 47,5 ml de dH2O).
  2. Esfriar as lâminas sobre RT durante aprox. 1 h e, em seguida, lavar 3 - 5x com solução salina tamponada com Tris (TBS, usar alternativamente PBS) que consiste em Tris 0,05 M e NaCl 0,15 M; pH 7,5 ajustado with HCl. Como alternativa, use TBS comercial.

5. O bloqueio dos Sites ligação inespecífica

  1. Para evitar reacções inespecíficas fundo, incubar as secções em RT durante 30 minutos na solução de bloqueio contendo 10% de soro fetal de vitelo (FCS) e 90% de tampão DAKO.

6. Faça duplo imunomarcação: incubação simultânea com as Abs primárias

  1. Dilui-se a quantidade necessária de anticorpos primários na solução de bloqueio e incubar o / n a 4 ° C. Para o duplo imunocoloração combinar α-eotaxina (CCL11; 1: 300) com α-CD68 (Ed1; 1: 1000) ou α-Iba1 (Aif1, 1: 1000) ou α-CD8a (Ox-8; 1: 200) .
  2. Enxaguar as lâminas 3-5x com tampão de TBS (usar alternativamente 10x tampão DAKO diluído).
  3. Dilui-se a quantidade necessária de anticorpos secundários (anti-cabra biotinilado e anti-murganho conjugado com AP, tanto 1: 200) em solução de bloqueio e incubar durante 1 h em TA.
  4. Lavar as lâminas 3 - 5x com tampão de TBS (use, alternativamente, 10x diluída tampão DAKO).
  5. Incubar as lâminas com o complexo de avidina-peroxidase de rábano (HRP), diluído em solução de bloqueio durante 1 h em TA.
  6. Lavar as lâminas 3 - 5 vezes com tampão TBS (tampão de usar alternativamente 10x diluída DAKO).

7. Visualization

  1. A visualização do anticorpo secundário marcado ligado AP-
    1. Preparar tampão Tris-HCl 0,1 M por dissolução de 12,1 g de Tris em 1 L de dH2O e ajustar o pH para, utilizando HCl. Utilizar o mesmo tampão Tris-HCl para preparar a solução de 1 M de levamisol. Preparar de fresco uma solução a 4% de NaNO2 em dH 2 O.
    2. Para se obter 50 ml do azul (FB) substrato rápido (volume necessário para uma cuvete de vidro padrão) dissolvem 6,25 mg de Naftol-AS-MX-fosfato em 312,5 DMF ul no tubo de vidro e agita-se em 50 ml de pré-aquecido (37 ° C) tampão Tris-HCl. Para dissolver 12,5 mg FB RR sal em 312,5 mL de HCl 2 N adicionar 312,5 ul de previamente prepavermelho 4% de solução de NaNO2 e agitar a mistura para os mesmos 50 ml de tampão Tris-HCl a pré-aquecido. Agitar suavemente até que o líquido amarelo claro e torna-se, finalmente, adicionar 77 ul de uma solução 1 M Levamisol previamente preparada. Filtrado obtido mistura e despeje em lâminas colocados na cuba de vidro.
    3. Inicia-se a incubação a 37 ° C e controlar processo de desenvolvimento sob a luz do microscópio aprox. cada 15-30 min. Se virando irregular, substitua a solução FB com a nova mistura.
    4. Lavar as lâminas 3 - 5x com tampão de TBS e, subsequentemente, a transferência para tampão de PBS.
  2. Visualização do anticorpo secundário biotinilado ligado
    1. Prepare DAB / H 2 O 2 a solução de revelação por diluição de 1 ml de solução de DAB (25 mg de DAB por 1 mL de PBS) em 49 ml de PBS. Adicionar 16.5 ul de H 2 O 2 e filtrado antes vertendo-a em secções.
    2. Conversão do DAB cromogénio em precipitando testan pigmento pode ser imediata. Controlar o processo de desenvolvimento sob o microscópio de luz (mesmo par de segundos a mais de incubação pode levantar um fundo de altura e mascarar o sinal específico).
    3. A intensidade do pigmento castanho precipitado pode ser aumentada em alternativa, através de incubação na solução que consiste de 2% de sulfato de cobre e 0,9% de NaCl em 5 '.
    4. Lavar as lâminas 3 - 5 vezes com PBS e finalmente com dH2O, utilize em alternativa, a água da torneira.
    5. Montar as lâminas com tampa desliza diretamente da água, utilizando meio de montagem GelTol aquosa. Evitar a criação de bolhas de ar.
    6. Permitir a secagem completa do meio de montagem, por exemplo, o / n a 4 ° C. Loja seca lâminas em RT.
1. % Etanol 20 ' 40 ° C
2. % Etanol 60 &# 39; 40 ° C
3. % Etanol 90 ' 40 ° C
4. % Etanol 60 ' 40 ° C
5. % Etanol 90 ' 40 ° C
6. % Etanol 60 ' 40 ° C
7. % Etanol 90 ' 40 ° C
8. % Etanol 120 ' 40 ° C
9. xilol 30 ' 40 ° C
10. xilol 60 ' 40 ° C
11. Parafina 60 ' 60 ° C
12. Parafina 60 ' 60 ° C
13. Parafina 60 ' 60 ° C
14. Parafina 120 ' 60 ° C

Tabela 1. Processamento de tecido por Tissue-Tek VIP Vacuum Infiltração Processor.

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Representative Results

imunomarcações duplos (co-colorações) foram realizados em fixado em formol e rato parafinado do SNC e LN seções. 3-5 uM fatias de tecido de espessura foram cortadas usando um micrótomo trenó, montado posteriormente em lâminas de vidro pré-revestida com adesivo e tratou-se como anteriormente descrito 10,11,12. Resumidamente, após deparaffinizing, re-hidratação do tecido e inactivação da peroxidase endógena, as secções foram submetidas ao processo de recuperação de antigénio, seguido por um passo de bloqueamento para eliminar os locais de ligação não específicos. Os co-colorações foram realizadas nas seguintes combinações: i) CCL11 / Iba-1, ii) CCL11 / Ed1 e iii) CCL11 / CD8. O Abs primária utilizada para cada co-coloração foram levantadas em duas espécies diferentes (caprinos e rato, respectivamente), o que permitiu a sua incubação simultânea. CCL11 foi visualizado por o produto da reacção de peroxidase de Brown, enquanto Iba-1, Ed1 e CD8, foram visualizadas por o sinal do AP azul.

10. De acordo com as análises do IHC realizado no rato do SNC, CCL11 estava presente em pericarya, dendrites e axónios dos neurónios localizados nos cornos ventrais da matéria cinzenta da medula espinal (Figura 1A e B). Além disso, as células CCL11 + plasmáticos individuais eram detectáveis nas mesmas secções de tecido (Figura 1A), bem como único CCL11 + / Ed1 + macrófagos e microglia residentes do cérebro observadas no local da inflamação (dados não apresentados; Ed1 é um marcador de proteína lisossómica em macrófagos activados e microglia 13). Notavelmente, CCL11 quimiocina não foi encontrada co-localizar com Iba-1 + macrófagos residentes e microglia cerebral (1A; Iba-1 é um marcador para a detecção de Ca2 + ionizado -bindi proteína ng 14).

Proteína à base de IHC segmentação realizada no rato LN periférico exibiu co-localização de proteínas CCL11 com Ed1 (Figura 2B). No entanto, não há linfócitos T CD8 + secretoras CCL11 foram detectáveis nas mesmas secções de tecido (Figura 2A; células CD8 + foram detectadas utilizando anti-CD8a, marcador de células predominantemente T citotóxicos que se ligam a moléculas MHC classe I 15). Excepto para a omissão de Abs primárias durante o / n de incubação na solução de bloqueio, as secções de controlo foram tratados como descrito no protocolo. Não há sinais de detecção das proteínas alvo (tal como apresentado nas figuras 1A, B e 2A, B) foram observadas nas secções do SNC e de controlo LN (Figura 1C e 2C, respectivamente).

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Figura 1. A, B: Double Imunomarcação no Rato LN. Os anticorpos primários dirigidos contra a quimiocina CCL11 em combinação quer com α-CD8 (A) ou Ed1 (B). Sem co-localização dentro da mesma célula foi observado para CCL11 + (castanho) e CD8 + (azul). B: sinal de detecção CCL11 (castanho) de co-localizar com o marcador de uma proteína lisossómica em macrófagos (Ed1, azul). C: controlo negativo; um detalhe que mostra células residentes não marcados na LN periférica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. A, B: Double Imunomarcação no Rato SCord Pinal. Corno anterior da substância cinzenta exibindo CCL11 em pericarya neuronais, dendritos e axônios (marrom) co-coradas quer com Iba-1 + (A; azul) ou ED1 + (B; azul) macrófagos / células microgliais C:. Controlo negativo; um detalhe que mostra células residentes não marcados no corno ventral da substância cinzenta da medula espinhal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

procedimentos IHC padrão muitas vezes exigem ajustes específicos para obter um ótimo resultado, que normalmente implica uma vasta experiência, mas também abordagem de "tentativa e erro". De preparação do tecido até visualização alvo, quase cada etapa do protocolo pode ser submetido a modificações concebidas individualmente, a fim de melhorar o resultado final. protocolo de coloração dupla aqui apresentado exemplifica proteínas na IHC visando particularmente ajustada para avaliar as inter-relações entre as proteínas-alvo do nosso interesse em fixado em formol e rato embebido em parafina seções CNS e LN tecidos afetados por neuroinflamação. Como tal, pode ser utilizado como um tutorial para a aprendizagem da técnica de IHQ, mas também como uma fonte de inspiração para os ensaios mais avançados. No entanto, ele deve ser mantido em mente que uma mera reprodução deste protocolo para o direcionamento de outras proteínas e / ou em outros tecidos do que aqui apresentados podem gerar resultados menos favoráveis.

A hibridização in situ usando ácido nucleico riboprobe (LNA) bloqueado contra CCL11 exibiu regulação positiva dos respectivos níveis de mRNA em CNS da estirpe de rato congênica 10. Esta descoberta foi confirmada por qPCR analisa. Além disso, a regulação positiva de qPCR revelou CCL11 também no LN periférica congénica em comparação com a estirpe de tipo selvagem (wt). Finalmente, o Western Blot (WB) mostraram regulação positiva significativa da proteína CCL11 em ambos os tecidos alvo da estirpe de rato congénica protegido-10 doença. Portanto, teve como objetivo investigar a origem desta quimiocina diretamente nos tecidos-alvo, e para essa finalidade foi desenvolvido o protocolo de coloração dupla aqui descrito.

Além de evitar danos mecânica do tecido durante a dissecção pós-mortem e descalcificação pós-fixação, corte de tecido pode parecer bastante desafiador. O corte geralmente requer habilidade e prática. Qualidade de fatia é dependente de muitos aspectos suito como o ajuste de um ângulo recto entre o bloco de tecido e a faca, a fim de reduzir a pressão aplicada na amostra durante o corte, velocidade de corte, etc espessura das fatias de tecido embebidas em parafina produzidos por micrótomo trenó pode variar de 2 a 50 um. Cortar fatias de tecido de parafina são montados a partir de um banho de água quente em lâminas de vidro comercialmente preferencialmente revestidos com um adesivo tal como poli-L-lisina ou aminopropiltrietoxissilano (APTS) para assegurar uma melhor preensão durante o procedimento de coloração exigente. Em contraste com crio secções de tecido que são cortadas a aproximadamente -20 ° C utilizando cryomicrotome e secas à TA, antes da coloração, arrefeceu-se blocos de parafina são cortados à TA e, subsequentemente, secou-se a 50- 60 ° C antes da desparafinação.

arquitetura do tecido, morfologia celular e de destino epítopos altamente preservados são essenciais para avaliar a localização e inter-relação das proteínas-alvo. A fim de alcançar preser tecido óptimavação, as amostras têm de ser corrigido adequadamente, utilizando coagulante ou fixadores de ligação cruzada. fixadores de coagulação, como o etanol, são mais frequentemente usados ​​para criopreservação. Desnaturação das proteínas utilizando etanol é conseguido através de desidratação dos tecidos 9; o que pode resultar na preservação celular inadequada 16. Em contraste com fixadores de coagulação, o formaldeído é um fixador de reticulação que é mais frequentemente usado em histologia de rotina e IHC 9 tanto para preservação de tecido cryo- e parafina. Nós conseguimos uma fixação óptima para o rato do SNC e LN por imersão em solução de formaldeído durante 24 horas a 4 ° C antes da descalcificação e subsequente inclusão em parafina. Apesar de causar mudanças profundas na conformação de macromoléculas (formaldeído ou seja, forma pontes de metileno que reticulam proteínas e, assim, mascaram antígenos, que podem impedir a ligação específica de anticorpos), este semi-reversível, reagente covalente fornece alta qualpreservação de tecido dade. Notavelmente, a temperatura e a duração da fixação com reagentes de reticulação pode ter um impacto vários aspectos do IHC, tais como o corte, a detecção e mesmo epitopo reactividade cruzada. Assim, tanto sub-fixação e excesso de fixação com reagentes à base de aldeído como o formaldeído pode causar artefactos que são principalmente devido a autólise ou ligações cruzadas excessivos 17, respectivamente. No entanto, uma coloração de fundo não específica, devido à proteína hidrofóbica ligação observada por excessiva fixação pode ser reduzida utilizando tampões salgados de baixa contendo detergentes não iónicos, ou por aumento do pH do tampão de diluição quando se utiliza policlonais Abs 18. No entanto, uma coloração de fundo não específica (ruído) causada por interacções electrostáticas proteína iónicos e poderia ser reduzida utilizando tampões diluentes com força iónica elevada, o que ao mesmo tempo pode agravar o ruído causado pela ligação da proteína hidrofóbica de 18. Quando se trata de detecção dos epitopos alvo, formaldeído-ialteração nduced da estrutura terciária de proteínas pode ser, embora não totalmente, revertida pela recuperação de antigénio de 19: I) por aquecimento em tampões com vários valores de pH (recuperação de epítopo induzida pelo calor (HIER), ii), por degradação enzimática (induzida por protease recuperação de epítopo (CAIS; 20)), iii) por incubação em meio alcalino forte ou uma solução de ácido, ou sacarose 21, 22 ou iiii) por tratamento com ácido fórmico concentrado 23. HIER parece conveniente para a maioria do alvo epitopos 19. Além duração de aquecimento, o valor de pH das soluções, tais como o EDTA (pH 5,5, 8,5 ou 9,0) ou tampão de citrato de sódio (pH 6.0- 6.2) pode ser essencial para o resultado de HIER. Notavelmente, o resultado mais satisfatório no nosso estudo foi conseguida por tratamento com vapor as amostras durante 1 h na solução de EDTA com o valor de pH 8,5.

Embora os anticorpos ligam-se preferencialmente aos seus epitopos específicos, a atracção não específica, similar à Ag cognato obrigatóriolocais, não pode ser totalmente excluído. Notavelmente, provavelmente o método mais eficaz para a redução da coloração de fundo é a incubação no bloqueio de proteínas (tais como FCS utilizados no nosso estudo) antes da aplicação do primário 9 Abs. Monoclonais primários Abs são de qualquer modo preferido sobre Abs policlonal devido a uma maior especificidade e reduza sinal de fundo inespecífica. No entanto, a reactividade cruzada pode ainda aparecer, como Abs monoclonais são dirigidos contra epitopos que consistem geralmente de um pequeno número de aminoácidos, que pode ser uma parte de um outro (não específica) da proteína 24. Ao contrário monoclonal, Abs policlonais têm uma maior probabilidade de reconhecer várias isoformas da proteína alvo. Inicialmente usou dois Abs principal diferente para detectar CCL11: i) um anticorpo policlonal criado em cabra e ii) um anticorpo monoclonal produzidos em ratinhos. Nas nossas mãos, ambos os produtos exibiram o mesmo padrão de coloração para a quimiocina alvo. A fim de realizar a co-coloração simultânea, utilizou-CCL1 rato de cabra antiAb 1 em combinação com os anticorpos contra Iba-1, Ed1 e CD8, respectivamente, que foram todos produzidos em rato. No entanto, além de, simultaneamente, a imunocoloração dupla pode também ser realizada sequencialmente 25, como necessário para a co-marcação do Abs primária produzida na mesma espécie.

A concentração de trabalho óptima dos Abs usados ​​em nosso estudo foi estimada através de uma série de testes de diluição como uma óptima relação entre a intensidade do sinal específico e o ruído de fundo. No entanto, deve-se ter em mente que uma concentração óptima de trabalho do mesmo anticorpo pode, por vezes variar entre órgãos, espécie, patologia de fundo, etc. Notavelmente, a permeabilização não era exigido no nosso procedimento de coloração realizada na embebido em parafina, 3-5 uM secções de tecido de espessura, no entanto, os detergentes como Triton X-100 pode ainda ter sido usado para reduzir a tensão superficial e, assim, para facilitar a ligação entre o antigénio e o anticorpo. Nomelhoria contrário, permeabilization- mediada de penetração AB é normalmente necessário para a detecção de proteínas em células ou de suspensões de células em cultura (imunocitoquímica (ICC)), para imunofluorescência (IF) nas secções de crio e IHC / IF em fresco (, vibratome de corte de espessura) LIVRE flutuante fatias de tecido.

Vários controlos são essencialmente importante para a geração específica immunotargeting / fiável. Como controlo positivo, utilizou-se os pulmões, de um modelo de rato da asma, onde se pode detectar CCL11 + eosinófilos. Os controlos negativos foram incubados apenas em solução de bloqueio o / n a 4 ° C na ausência do Abs primária.

Já mencionamos algumas causas e possíveis soluções para a redução de um sinal de fundo. Um produto imunocoloração inespecífica podem também ocorrer como uma reacção entre DAB e pseudoperoxidase das células vermelhas do sangue e a peroxidase de células mielóides 26. Atividade dessas enzimas, assim como os caus ruídoed por biotina endógena ou AP já tenha sido reduzido durante formalina-fixação. No entanto, o pré-tratamento com metanol / H 2 O 2 é necessário para a sua posterior completa ou inactivação 27, 28. Coloração de fundo causado por actividade de AP em tecidos de mamíferos pode ser adicionalmente inibido por levamisol 29, ou por ácido acético 29. Ligação não especifica como o resultado de atracção iónica entre avidina e com cargas opostas moléculas celulares 30 pode ser evitada por substituição por avidina de clara de ovo com estreptavidina de Streptomyces avidinii 31.

DAB é provavelmente o cromógeno mais utilizado em IHC. Além DAB (produto reaccional de cor castanha), outros cromogénios peroxidase em uso são o 3-amino-9-etilcarbazole (AEC; vermelho), 4-cloro-1-naftol (CN, azul) e tetrametilbenzidina (TMB; azul). cromogénios AP são geralmente escolhido FB, Fast Red (FR), nova fucsina e 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato / nitro BLcloreto de tetrazólio ue (BCIP / NBT). A escolha das enzimas e cromogénios, basicamente, é um assunto de preferência individual, no entanto, pode ser orientada pelas características alvo, tais como localização, padrão de expressão, mas também pela presença de pigmentos de melanina (endógenos, hemossiderina) 32. Contracorante é o último passo, facultativa no procedimento IHC normalmente realizada utilizando hematoxilina, nuclear rápido vermelho ou verde 18 metilo. Geralmente mais adequadas para a rotulagem única, de contraste facilita a interpretação da morfologia do tecido e deve ser subtilmente desenvolvido para evitar qualquer interferência com o precipitado cromogénio.

Após a conclusão das secções de tecido procedimento de coloração deve ser cuidadosamente montadas com uma lamela utilizando um meio de montagem. A formação de bolhas de ar deve ser evitada. Ao lado de protecção física, meio de montagem melhora a visualização e qualidade de imagem. De qualquer orgânica / hidrofóbica ou aquosa / hidrofílico, o choice do meio de montagem é em função da solubilidade do produto final no solvente orgânico. Embora um meio de montagem com base tolueno- seria adequado, por exemplo, para DAB, meio de montagem aquoso pode ser aplicado a todos os cromogénios enzimáticas, incluindo a marcação por fluorescência.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) Baxter 1001936060 Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment.
Sodiumchloride (NaCl) Merck 1.0604
Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet Sigma-Aldrich P4417
Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% in 1x PBS Apl pharma 34 24 28 Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity.
Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) Sigma-Aldrich 459844-1L Flamable.
Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 Sigma-Aldrich 534056 Flamable. Acute toxicity.
Histo-Comp Paraffin Wax Tissue-Tek V0-5-1001
Adhesive Microscope Slides Starfrost MIC-1040-W
Xylol substitute XEM-200 Vogel GmbH ND-HS-200 Respiratory sensitization. Carcinogenicity.
α-CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody AbD Serotec MCA48G
α-Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody Millipore MABN92
α-CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody AbD Serotec MCA341R
α-eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody Santa Cruz BT SC-6181
Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody Dakopatts, Denmark D0314
Biotinylated secondary antibody Amersham Biotech RPN1025
Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) Sigma-Aldrich A3151
Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) Sigma-Aldrich N4875-1G Acute toxicity.
Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) Sigma-Aldrich FBS25
Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) Sigma-Aldrich 31742 Acute toxicity.
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) DAKO S3000 Highly flammable. Toxic.
Copper sulphate (CuSO4) Merck 1.02791 Acute toxicity. Environmental hazzard.
GelTol Aqueous Mounting Medium Thermo Electron Corporation 230100
Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) Merck 107210 Acute toxicity.
Methanol (CH3OH) Fluka 65543 Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable.
Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) AppliChem A1379 Skin and eye irritation.
Tris Buffered Saline (TBS), tablet Sigma-Aldrich T5030
Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) Merck 1.0658
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) Merck 1.06346
Fetal calf serum (FCS) Cambrex BioScience DE-14-802F
DAKO cytomation wash buffer 10x DAKO S3006 Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming.
N,N-Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) Fluka 40250 Flammable. Acute toxicity.
Glas coverslips 24 x 36 mm Menzel-Gläser BB024036A1
Hydrochloric acid, conc. (HCl) Sigma-Aldrich 30721 Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.
Hydrochloric acid solution volumetric, 2 M HCl (2 N) Fluka 71826 Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.
Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) Sigma-Aldrich S2252 Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment.
Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) Merck 1.08454 Oral exposures may cause reproductive and developmental effects.
Equipment
Tissue-TekV.I.P Vacuum Infiltration Processor Sakura 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz
Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome Hacker instruments
Household food steamer Braun MultiGourmet FS 20
Light microscope Leica Polyvar 2

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