El análisis inmunohistoquímico en el sistema nervioso central y periférico de la rata de nodo linfático secciones de tejido

Neuroscience

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Adzemovic, M. Z., Zeitelhofer, M., Leisser, M., Köck, U., Kury, A., Olsson, T. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. J. Vis. Exp. (117), e50425, doi:10.3791/50425 (2016).

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Abstract

La inmunohistoquímica (IHC) proporciona una visualización altamente específico, fiable y atractivo proteína. rendimiento correcta y la interpretación de un etiquetado multicolor basado en la IHC es un reto, especialmente cuando se utiliza para la evaluación de las interrelaciones entre las proteínas diana en el tejido con un alto contenido de grasa, tales como el sistema nervioso central (SNC).

Nuestro protocolo representa un refinamiento de la técnica immunolabeling estándar especialmente ajustado para la detección de ambas proteínas estructurales y solubles en el CNS de rata y de los ganglios linfáticos periféricos (LN) afectadas por la neuroinflamación. No obstante, con o sin modificaciones adicionales, nuestro protocolo probablemente podría ser utilizado para la detección de proteínas relacionadas con otros objetivos, incluso en otros órganos y especies que aquí se presenta.

Introduction

A pesar de la utilización de tecnologías avanzadas de alto rendimiento de los análisis realizados en el metiloma, transcriptoma o incluso de proteoma, inmunotinción sigue siendo el estándar de oro para la detección de proteínas directamente en la muestra de tejido, cultivo celular o un frotis celular. Al revelar el patrón de localización / distribución, inmunohistoquímica (IHC) puede evaluar proporciones relativas y las interrelaciones topográficas de las proteínas diana, e incluso indicar sus actividades biológicas. Por lo tanto, IHC se utiliza ampliamente para fines clínicos y de investigación, por ejemplo, para el diagnóstico, tratamiento, evaluaciones estudio de los mecanismos de la enfermedad, alteraciones funcionales y fenotípicas en modelos animales, etc.

Que comprende esencialmente la histología, patología, bioquímica e inmunología, IHC ha avanzado significativamente desde 1941, cuando se utilizaron anticuerpos marcados con fluorescencia por primera vez para identificar antígenos de neumococo en el tejido infectado 1. Visualization de productos y componentes por IHC celulares se basa en la unión de anticuerpos (Abs) a su antígeno específico (Ag). Además de utilizar anticuerpos fluoróforo etiquetado, reacciones inmunes también se pueden visualizar mediante el uso de enzimas como la peroxidasa de 2,3 o fosfatasa alcalina 4. Además, los anticuerpos de oro coloidal-etiquetado 5 se utilizan para detectar la interacción específica antígeno-anticuerpo tanto por microscopía óptica y electrónica, mientras marcadores radiactivos se visualizaron por autorradiografía.

La inmunorreacción Ag-Ab se puede detectar a través de métodos directos e indirectos. El método directo es esencialmente más rápido y más sencillo, ya que utiliza directamente etiquetada Abs primaria 6. Sin embargo, debido a la significativa falta de sensibilidad, los métodos indirectos se prefieren a los directos. Procedimientos de detección indirecta de dos pasos requieren no marcados Abs primaria, ya que el primero, y se marcaron Abs secundarios dirigidos contra el Abs primario, como la segunda capa 7.la amplificación de la señal se puede lograr mediante la participación adicional, terciaria Ab enzima acoplada (de tres pasos método indirecto) que se une al Ab secundario. métodos de detección indirectos utilizados están avidina-biotina y peroxidasa-antiperoxidasa (PAP). Alternativamente, fosfatasa alcalina fosfatasa antialkaline (APAAP) complejo se puede utilizar en lugar del método PAP. En particular, la fosfatasa alcalina (AP) métodos parecen ser aún más sensible que los métodos de inmunoperoxidasa 4. método del complejo avidina-biotina (ABC) utiliza biotina Ab secundario en combinación con la etiqueta complejo avidina-biotina (LAB), o el etiquetado de estreptavidina-biotina (LOSA). Sensibilidad de detección se puede aumentar más mediante la participación de avidina marcada con peroxidasa o fosfatasa alcalina 8. Otros métodos de detección utilizados son el etiquetado polimérico, tiramina y la amplificación círculo 9 inmuno-balanceo. En particular, los métodos de detección diferentes se pueden combinar para la detección múltiple Ag en el mismo tejidomuestra, el cual fue reportado por primera vez en 1978 4. inmunotinción doble simultánea que aquí se presenta se realizó en fijado en formol, ratas incluido en parafina cortes de tejido del SNC y LN utilizando peroxidasa unida y AP-conjugado con anticuerpos secundarios, respectivamente. Las señales se visualizaron utilizando 3,3'-diaminobencidina cromógeno (DAB) y el Fast Blue (FB) APAAP compleja, respectivamente.

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Protocol

Declaración de ética
El presente estudio se realizó de acuerdo con las directrices de la Junta Nacional Sueca de Animales de Laboratorio y la Directiva del Consejo de la Comunidad Europea (86/609 / CEE), por los permisos éticos N338 / 09, N15 / 10 y N65 / 10, los cuales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal Estocolmo Norte.

1. Preparación del tejido

  1. Perfusión y de fijación
    1. Anestesiar al animal con isoflurano para realizar la perfusión transcardial a través del ventrículo izquierdo. Iniciar el enjuague de la vasculatura con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar los componentes de la sangre, seguido de paraformaldehído al 4% en PBS 0,1 M (PFA).
    2. Fijar los cerebros disecados, la médula espinal y el tejido LN periférica mediante la inmersión en PFA. Después de 24 horas a 4 ° C, transferir el tejido de PFA en PBS y se almacena a 4 ° C hasta su posterior procesamiento. Como alternativa a PBS comercial, se disuelven 9 g de NaCl en 250 ml del S &# 246; rensen tampón y añadir 750 ml de agua desionizada (DH 2 O); para preparar tampón 0,2 M Sörensen (pH 7,4) disolver 13,8 g NaH 2 PO 4 x 1H 2 O y 71,2 g de Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O en 2,5 L dH 2 O.
  2. La deshidratación y la incrustación
    1. Cortar el tejido en aproximadamente 5 mm partes gruesas mediante el uso de una hoja de afeitar.
    2. Iniciar el proceso de endurecimiento del tejido (deshidratación) mediante el uso del procesador de infiltración a vacío Tissue-Tek VIP (procedimiento estándar basado en la inmersión en concentraciones ascendentes de etanol, seguido de xileno y finalmente parafina (Tabla 1).
    3. Coloque el tejido en un molde y se vierte en la parafina líquida alrededor de la muestra para formar un "bloque de parafina". El almacenamiento a largo plazo requiere la temperatura ambiente (TA). Sin embargo, antes de seccionar, es recomendable para enfriar los bloques, por ejemplo, durante la noche (o / n) a 4 ° C.

2. Seccionamiento

  1. Coloque el bloque de parafina en un soporte fijo de la microtomo trineo, que puede moverse hacia atrás y hacia delante a través de la cuchilla. Ajuste el ángulo óptimo entre el bloque y el cuchillo microtomo (que depende de la geometría de cuchillo, sino también de la velocidad de corte y la técnica).
  2. Cortar 3 - 5 de m de espesor secciones transversales del bloque de parafina.
  3. Transferir la sección acaba de cortar en un recipiente de agua y montarlo posteriormente del agua sobre el portaobjetos de vidrio.
  4. Presione la sección montada cuidadosamente con una toalla de papel para eliminar el agua residual y las burbujas de aire potenciales. Comercialmente pre-revestidas portaobjetos de vidrio adhesivas son recomendables.
  5. Diapositivas montadas en seco por un par de horas en una estufa a 50 - 60 ° C.

3. desparafinación (Rehidratación y bloqueo de la peroxidasa endógena)

  1. Sumergir los portaobjetos en xileno 2x (sustituto de xileno, alternativamente,XEM-200), cada vez 15 a 20 '.
  2. Enjuague con etanol al 99%.
  3. Para bloquear la actividad peroxidasa endógena, se incuban las secciones para 30 'en solución de metanol que contiene 0,25% de peróxido de hidrógeno.
  4. Continuar la rehidratación mediante el uso de etanol con el aumento de contenido de agua (99%, 70%, terminando en agua destilada.
  5. Desde este punto hasta el montaje de la cubierta se desliza secciones tienen que mantenerse húmedo.

4. La recuperación del antígeno

  1. Utilice una vaporera para hervir los portaobjetos en una solución de recuperación de antígeno (en este caso EDTA pH 8,5 tampón) durante 60 '(EDTA reserva de estabilización solución contiene 1,21 g de Tris y 0,37 g de EDTA se disuelve en 50 ml de H2O destilada, para preparar el trabajo solución diluida solución de 2,5 ml de EDTA de valores en 47,5 ml dH2O).
  2. Enfriar los portaobjetos en la temperatura ambiente durante aprox. 1 hr y luego enjuague 3 - 5x con solución salina tamponada con Tris (TBS, usar alternativamente PBS) que consiste en 0,05 M Tris y 0,15 M NaCl; pH 7,5 ajustado wiTH HCl. Alternativamente, puede utilizar TBS comercial.

5. El bloqueo de los sitios de unión inespecífica

  1. Para evitar reacciones de fondo no específicas, se incuban las secciones sobre TA durante 30 'en la solución de bloqueo que contiene 10% de suero de ternera fetal (FCS) y tampón DAKO 90%.

6. Doble Immunolabeling: La incubación simultánea con los Abs primarias

  1. Diluir cantidad necesaria de anticuerpos primarios en la solución de bloqueo y se incuba o / n a 4 ° C. Para la inmunotinción doble combinar α-eotaxina (CCL11; 1: 300) con α-CD68 (Ed1; 1: 1.000) o α-Iba1 (AIF1, 1: 1.000) o α-CD8a (Ox-8; 1: 200) .
  2. Enjuague los portaobjetos 3-5X con tampón TBS (alternativamente usar tampón 10x diluida DAKO).
  3. Diluir cantidad necesaria de anticuerpos secundarios (biotinilado anti-cabra y AP-conjugado anti-ratón, ambos 1: 200) en la solución de bloqueo y se incuba 1 h en RT.
  4. Enjuague las diapositivas 3 - 5 veces con tampón TBS (use alternativamente 10x diluido tampón DAKO).
  5. Incubar los portaobjetos con complejo de avidina-peroxidasa de rábano (HRP) diluidos en la solución de bloqueo durante 1 h en RT.
  6. Enjuagar las diapositivas 3 - 5 veces con tampón TBS (utilizar alternativamente 10x tampón DAKO diluida).

7. Visualización

  1. La visualización del anticuerpo secundario marcado con AP enlazado
    1. Preparar tampón Tris-HCl 0,1 disolviendo 12,1 g de Tris en 1 L dH 2 O y ajustar el pH a mediante el uso de HCl. Usar el mismo tampón Tris-HCl para preparar una solución 1 M levamisol. Preparar solución recién 4% NaNO2 en dH2O
    2. Para obtener 50 ml del sustrato Fast Blue (FB) (volumen requerido para una cubeta de vidrio estándar) disolver 6,25 mg Naftol-AS-MX-fosfato en 312,5 DMF l en el tubo de vidrio y se agita en 50 ml de pre-calentado (37 ° C) de tampón Tris-HCl. Para disolver 12,5 mg FB RR sal en l HCl 2 N 312,5 312,5 l de añadir previamente preparojo 4% de solución de NaNO 2 y se agita la mezcla en los mismos 50 ml de tampón Tris-HCl pre-calentado. Agitar suavemente hasta que el líquido amarillo se vuelve claro y por último añadir 77 l de solución 1 M levamisol previamente preparada. Filtrado obtenido mezcla y se vierte sobre portaobjetos colocados en la cubeta de vidrio.
    3. Iniciar la incubación a 37 ° C y el control de procesos en desarrollo bajo el microscopio de luz aprox. cada 15 - 30 min. Si al girar difusa, reemplace la solución FB con la mezcla fresca.
    4. Enjuague las diapositivas 3 - 5 veces con tampón TBS y la transferencia a continuación en tampón PBS.
  2. La visualización del anticuerpo secundario biotinilado unido
    1. Preparar DAB / H 2 O 2 solución de revelado diluyendo 1 ml de solución de DAB (DAB 25 mg por 1 ml de PBS) en 49 ml de PBS. Añadir 16,5 l de H 2 O 2 y filtrado antes de verter en secciones.
    2. La conversión del cromógeno DAB en la frente precipitandon pigmento puede ser inmediata. Controlar el proceso de desarrollo bajo el microscopio de luz (incluso par de segundos de incubación más largo puede plantear un alto fondo y enmascarar la señal específica).
    3. La intensidad del precipitado pigmento marrón puede ser, alternativamente, reforzada por la incubación en la solución que consiste en 2% de sulfato de cobre y 0,9% de NaCl para 5 '.
    4. Enjuague las diapositivas 3 - 5 veces con PBS y finalmente con H2O destilada Alternativamente, puede utilizar el agua del grifo.
    5. Montar los portaobjetos con tapa se desliza directamente del agua mediante el uso de un medio de montaje acuoso GelTol. Evitar la creación de burbujas de aire.
    6. Deje secar por completo del medio de montaje, por ejemplo, O / N a 4 ° C. Tienda secó diapositivas en RT.
1. % etanol 20 ' 40 ° C
2. % etanol 60 y# 39; 40 ° C
3. % etanol 90 ' 40 ° C
4. % etanol 60 ' 40 ° C
5. % etanol 90 ' 40 ° C
6. % etanol 60 ' 40 ° C
7. % etanol 90 ' 40 ° C
8. % etanol 120 ' 40 ° C
9. xilol 30 ' 40 ° C
10. xilol 60 ' 40 ° C
11. Parafina 60 ' 60 ° C
12. Parafina 60 ' 60 ° C
13. Parafina 60 ' 60 ° C
14. Parafina 120 ' 60 ° C

Tabla 1. Procesamiento de tejido por vacío Tissue-Tek VIP procesador de infiltración.

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Representative Results

immunostainings dobles (co-tinciones) se realizaron en fijado en formol e incluido en parafina de rata secciones del SNC y LN. 3-5 micras rodajas de tejido espesor fueron cortadas usando un microtomo trineo, montados posteriormente en portaobjetos de vidrio recubierto con adhesivo previamente y se trata como se ha descrito previamente 10,11,12. En resumen, después deparaffinizing, la rehidratación del tejido y la inactivación de la peroxidasa endógena, las secciones se sometieron al proceso de recuperación de antígeno, seguido por una etapa de bloqueo para eliminar los sitios de unión no específica. Los compañeros de tinciones se realizaron en las siguientes combinaciones: i) CCL11 / Iba-1, ii) CCL11 / Ed1 y iii) CCL11 / CD8. El Abs principal que se utiliza para cada co-tinción se plantearon en dos especies diferentes (de cabra y de ratón, respectivamente), lo que permitió su incubación simultánea. CCL11 fue visualizado por el producto de reacción de peroxidasa de color marrón, mientras Iba-1, Ed1 y CD8, se visualizaron por la señal de AP azul.

10. De acuerdo con los análisis de IHC realiza en el CNS de rata, CCL11 estaba presente en pericarya, dendritas y axones de las neuronas localizadas en los cuernos ventrales de la materia gris de la médula espinal (Figura 1A y B). Además, las células CCL11 + plasmáticas individuales fueron detectables en las mismas secciones de tejido (Figura 1a), así como única CCL11 + / Ed1 + macrófagos y microglia residentes del cerebro observados en el sitio de la inflamación (datos no mostrados; Ed1 es un marcador de proteína lisosómica en los macrófagos activados y microglia 13). Notablemente, CCL11 quimioquinas no se encontró co-localización con Iba-1 + macrófagos y microglia residentes cerebro (1A; Iba-1 es un marcador para la detección de ionizado Ca 2+ -bindi proteína ng 14).

Proteínas a base de IHC focalización realiza en el LN de ratas periférica exhibido proteína CCL11 co-localización con Ed1 (Figura 2B). Sin embargo, no hay linfocitos T CD8 + CCL11 secretoras fueron detectables en las mismas secciones de tejido (Figura 2A; se detectaron células CD8 + usando anti-CD8a, marcador de células T predominantemente citotóxicos que se unen a moléculas de MHC de clase I 15). Excepto por la omisión de Abs primarios durante o / n de la incubación en la solución de bloqueo, las secciones de control se trataron como se describe en el protocolo. No hay señales de detección de las proteínas diana (tal como se presenta en las figuras 1A, B y 2A, B) se observaron en las secciones de control del SNC y LN (Figura 1C y 2C, respectivamente).

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Figura 1. A, B: doble inmunotinción en el LN rata. Los anticuerpos primarios dirigidos contra la quimiocina CCL11 en combinación con α-CD8 (A) o Ed1 (B). No se observó co-localización dentro de la misma célula para CCL11 + (marrón) y las células CD8 + (azul) B:. Señal de detección de CCL11 (marrón) co-localización con el marcador de una proteína lisosómica en los macrófagos (Ed1, azul). C: Control negativo; un detalle que muestra células residentes no marcados en el LN periférica. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. A, B: doble inmunotinción en la rata SCable de Pinal. Asta ventral de la sustancia gris que exhibe CCL11 en pericarya neuronales, dendritas y axones (marrón) co-tiñó con cualquiera Iba-1 + (A; azul) o ED1 + (B; azul) macrófagos / células microgliales C:. Control negativo; un detalle que muestra células residentes no marcados en el asta ventral de la sustancia gris de la médula espinal. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los procedimientos estándar de IHC menudo requieren ajustes específicos para obtener un resultado óptimo, lo que comúnmente implica una amplia experiencia, sino también de "ensayo y error" enfoque. Desde la preparación hasta la visualización del tejido diana, casi cada paso en el protocolo puede ser sometida a modificaciones diseñadas de forma individual con el fin de mejorar el resultado final. protocolo de tinción doble que aquí se presenta un ejemplo de proteínas a base de IHC focalización particular ajustado para evaluar las interrelaciones entre las proteínas diana de nuestro interés en las secciones de tejido del SNC y LN fijado en formalina, rata incluido en parafina afectadas por la neuroinflamación. Como tal, puede ser utilizado como un tutorial para aprender la técnica de la IHC, pero también como una fuente de inspiración para ensayos más avanzados. Sin embargo, se debe tener en cuenta que una mera reproducción de este protocolo para dirigir otras proteínas y / o en otros tejidos que aquí se presenta puede generar resultados subóptimos.

Hibridación in situ utilizando ribosonda (LNA) de ácido nucleico cerrado contra CCL11 exhibió la regulación positiva de los respectivos niveles de mRNA en el SNC de la cepa de rata congenic 10. Este hallazgo fue confirmado por análisis qPCR. Además, qPCR reveló CCL11 upregulation también en el LN periférica congenic en comparación con la cepa de tipo salvaje (wt). Finalmente, Western Blot (WB) mostró upregulation significativa de la proteína CCL11 en ambos tejidos diana de la cepa de rata congenic protegido de la enfermedad 10. Por lo tanto, el objetivo fue investigar el origen de esta quimiocina directamente en los tejidos diana, y para ello hemos desarrollado el protocolo de tinción doble que aquí se describe.

Además de evitar el daño mecánico del tejido durante la disección post-mortem y post-fijación descalcificación, seccionar los tejidos podría parecer bastante difícil. El seccionamiento por lo general requiere habilidad y práctica. Calidad de la rebanada depende de muchos aspectos sUCH como el ajuste de un ángulo recto entre el bloque de tejido y el cuchillo con el fin de reducir la presión aplicada sobre la muestra durante el corte, velocidad de corte, etc. Espesor de los cortes de tejido incluidos en parafina producidos por microtomo trineo puede variar de 2 a 50 micras. Cortar rodajas de tejido en parafina se montan a partir de un baño de agua caliente en portaobjetos de vidrio recubiertos preferentemente comercialmente con un adhesivo tal como poli-L-lisina o aminopropiltrietoxisilano (APTS) para asegurar una mejor sujeción durante el procedimiento de tinción exigente. En contraste con crio secciones de tejido que se cortan a aproximadamente -20 ° C usando criomicrotomo y se secó a RT antes de la tinción, se enfrió bloques de parafina se cortan a TA, y se secaron posteriormente a 50- 60 ° C antes de la desparafinación.

Altamente conservadas arquitectura de los tejidos, la morfología celular y de destino epítopos son esenciales para evaluar la localización y la interrelación de las proteínas diana. Con el fin de lograr preser tejido óptimavación, las muestras tienen que ser fijado correctamente, utilizando coagulante o fijadores de reticulación. fijadores de coagulación, tales como etanol, se utilizan con más frecuencia para la crioconservación. Desnaturalización de las proteínas utilizando etanol se logra mediante la deshidratación del tejido 9; que puede resultar en insuficiente preservación celular 16. En contraste con fijadores de coagulación, el formaldehído es un reticulante fijador que se utiliza con mayor frecuencia en la histología de rutina y IHC 9 tanto para la conservación de tejidos crio y parafina. Hemos logrado una fijación óptima para el CNS de rata y LN mediante la inmersión en una solución de formaldehído durante 24 horas a 4 ° C antes de la descalcificación y la posterior inclusión en parafina. A pesar de causar cambios profundos en la conformación de macromoléculas (formaldehído es decir, forma puentes de metileno que se reticulan proteínas y, por tanto enmascaran los antígenos, que pueden impedir la unión específica de anticuerpos), esto, reactivo covalente semi-reversible ofrece alta calila conservación del tejido dad. En particular, la temperatura y la duración de la fijación con reactivos de reticulación puede afectar a varios aspectos de la IHC como el corte, la detección epítopo e incluso la reactividad cruzada. Así, tanto en virtud de la fijación y el exceso de fijación utilizando reactivos a base de aldehído tal como formaldehído puede causar artefactos que se deben principalmente a la autolisis o excesivos enlaces transversales 17, respectivamente. Sin embargo, una tinción de fondo no específica debido a la proteína de unión hidrofóbica observado por overfixation puede reducirse utilizando tampones salados bajos que contienen detergentes no iónicos, o elevando el pH de la tampón de dilución utilizando Abs policlonales 18. Sin embargo, una tinción de fondo no específica (ruido) causada por las interacciones proteína iónicos y electrostáticas podría reducirse utilizando tampones diluyentes con fuerza iónica alta, lo que al mismo tiempo puede agravar el ruido causado por la proteína de unión hidrófobo 18. Cuando se trata de la detección de los epítopos diana, formaldehído-ialteración nduced de la estructura terciaria de las proteínas puede ser, aunque no del todo, revertido por la recuperación de antígeno 19: i) por calentamiento en tampones con diferentes valores de pH (recuperación del epítopo inducida por calor (HIER), ii) por la degradación enzimática (inducida por la proteasa recuperación del epítopo (PIER; 20)), iii) por incubación en fuerte alcalina o solución de ácido, o sacarosa 21, 22 o iiii) por tratamiento con ácido fórmico concentrado 23. HIER parece conveniente para la mayoría de la diana epítopos 19. Además de la duración de calentamiento, el valor de pH de las soluciones, tales como EDTA (pH 5,5, 8,5 o 9,0) o tampón de citrato de sodio (pH 6.0- 6.2) puede ser esencial para el resultado de HIER. En particular, el resultado más satisfactorio en nuestro estudio se logró por tratamiento al vapor las muestras durante 1 h en la solución de EDTA con el valor de pH 8,5.

Aunque los anticuerpos se unen preferentemente a sus epítopos específicos, atracción a no específica, similar a la cognado Ag uniónsitios, no puedan ser enteramente excluidos. Cabe destacar que, probablemente, el método más eficiente para reducir la tinción de fondo es la incubación en el bloqueo de proteínas (tales como FCS utilizados en nuestro estudio) antes de la aplicación de Abs primaria 9. Abs monoclonales primarios son los preferidos de todos modos sobre Abs policlonales debido a una mayor especificidad y por lo tanto reduce la señal de fondo no específica. Sin embargo, la reactividad cruzada todavía podría aparecer, como Abs monoclonales se dirigen contra epítopos comúnmente consisten en un pequeño número de aminoácidos, que puede ser una parte de alguna otra proteína 24 (no específica). A diferencia monoclonal, Abs policlonales tienen una mayor probabilidad de reconocer múltiples isoformas de la proteína diana. Inicialmente se utilizaron dos Abs principal diferente para detectar CCL11: i) un policlonal en cabra y ii) un anticuerpo monoclonal se crió en ratón. En nuestras manos, ambos productos mostraron el mismo patrón de tinción para la quimiocina diana. Para llevar a cabo simultánea co-tinción, se utilizó CCL1 rata de cabra anti1 Ab en combinación con los anticuerpos contra Iba-1, Ed1 y CD8, respectivamente, todos los cuales se produjeron en el ratón. Sin embargo, además de forma simultánea, doble inmunotinción también puede realizarse de forma secuencial 25, como se requiere para co-etiquetado de la Abs primaria producida en la misma especie.

La concentración óptima de trabajo de los Abs utilizados en nuestro estudio se estimó a través de la serie de pruebas de dilución, según una óptima relación entre la intensidad de la señal específica y el ruido de fondo. Sin embargo, se debe tener en cuenta que una concentración de trabajo óptima del mismo anticuerpo puede variar a veces entre los órganos, las especies, la patología de fondo, etc. En particular, no se requiere la permeabilización en nuestro procedimiento de tinción se realiza en el embebidos en parafina, 3-5 micras secciones de tejidos gruesos, sin embargo, los detergentes como Triton X-100 podrían todavía se han utilizado para reducir la tensión superficial y por lo tanto para facilitar la unión entre el antígeno y el anticuerpo. Sobre elal contrario, la mejora de la penetración permeabilization- mediada por Ab es comúnmente necesario para la detección de proteínas en células o suspensiones de células cultivadas (inmunocitoquímica (CPI)), por inmunofluorescencia (IF) en los cortes congelados y IHC / SI en fresco (de espesor, vibratome de corte) de libre flotación secciones de tejido.

Múltiples controles son esencialmente importantes para generar immunotargeting específica / fiable. Como control positivo, se utilizó pulmones de un modelo de rata de asma, en donde pudimos detectar eosinófilos CCL11 +. Los controles negativos se incubaron sólo en la solución de bloqueo o / n a 4 ° C en ausencia de la Abs primaria.

Ya hemos mencionado algunas de las causas y las posibles soluciones para la reducción de una señal de fondo. Un producto inmunotinción no específica también puede ocurrir como reacción entre DAB y pseudoperoxidasa de las células rojas de la sangre y la peroxidasa de las células mieloides 26. La actividad de estos enzimas, al igual que los caus ruidoed por la biotina endógena o AP ya se ha reducido durante la fijación con formalina. Sin embargo, el tratamiento previo con metanol / H 2 O 2 es necesario para su posterior o completa inactivación 27, 28. La tinción de fondo causado por la actividad AP en tejidos de mamíferos se puede inhibir adicionalmente por levamisol 29, o por el ácido acético 29. La unión no específica como resultado de la atracción iónica entre avidina y moléculas celulares con carga opuesta 30 se pueden evitar mediante la sustitución de avidina de clara de huevo con estreptavidina de Streptomyces avidinii 31.

DAB es probablemente el cromógeno utilizado con mayor frecuencia en IHC. Además de DAB (producto de reacción de color marrón), otros cromógenos de la peroxidasa en uso son 3-amino-9-etilcarbazol (AEC; rojo), 4-cloro-1-naftol (CN, azul) y tetrametilbencidina (TMB; azul). cromógenos AP comúnmente elegidos son FB, Fast Red (FR), nueva fucsina y 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato / nitro blcloruro de tetrazolio ue (BCIP / NBT). La elección de las enzimas y cromógenos es básicamente una cuestión de preferencia individual, sin embargo, puede ser dirigida por las entidades de destino como la localización, patrón de expresión, sino también por la presencia de pigmentos endógenos (melanina, hemosiderina) 32. Contratinción es la última etapa, facultativa en el procedimiento de IHC suele realizarse usando hematoxilina, nuclear rápido de color rojo o verde de metilo 18. Generalmente más adecuado para el único etiquetado, de contraste facilita la interpretación de la morfología del tejido y debe ser sutilmente desarrollado para evitar cualquier interferencia con el precipitado cromógeno.

Al término de las secciones de tejido del procedimiento de tinción deben montarse con cuidado con un cubreobjetos usando un medio de montaje. La formación de burbujas de aire debe ser evitado. Al lado de la protección física, medio de montaje mejora la visualización y la calidad de la imagen. De cualquier orgánico / hidrófoba o acuoso / hidrófilo, el choice del medio de montaje está en función de la solubilidad del producto final en el disolvente orgánico. Mientras que un medio de montaje basado tolueno- sería adecuado, por ejemplo, por DAB, medio de montaje acuoso se puede aplicar a todos los cromógenos enzimáticos, incluyendo etiquetado de fluorescencia.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) Baxter 1001936060 Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment.
Sodiumchloride (NaCl) Merck 1.0604
Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet Sigma-Aldrich P4417
Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% in 1x PBS Apl pharma 34 24 28 Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity.
Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) Sigma-Aldrich 459844-1L Flamable.
Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 Sigma-Aldrich 534056 Flamable. Acute toxicity.
Histo-Comp Paraffin Wax Tissue-Tek V0-5-1001
Adhesive Microscope Slides Starfrost MIC-1040-W
Xylol substitute XEM-200 Vogel GmbH ND-HS-200 Respiratory sensitization. Carcinogenicity.
α-CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody AbD Serotec MCA48G
α-Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody Millipore MABN92
α-CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody AbD Serotec MCA341R
α-eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody Santa Cruz BT SC-6181
Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody Dakopatts, Denmark D0314
Biotinylated secondary antibody Amersham Biotech RPN1025
Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) Sigma-Aldrich A3151
Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) Sigma-Aldrich N4875-1G Acute toxicity.
Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) Sigma-Aldrich FBS25
Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) Sigma-Aldrich 31742 Acute toxicity.
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) DAKO S3000 Highly flammable. Toxic.
Copper sulphate (CuSO4) Merck 1.02791 Acute toxicity. Environmental hazzard.
GelTol Aqueous Mounting Medium Thermo Electron Corporation 230100
Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) Merck 107210 Acute toxicity.
Methanol (CH3OH) Fluka 65543 Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable.
Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) AppliChem A1379 Skin and eye irritation.
Tris Buffered Saline (TBS), tablet Sigma-Aldrich T5030
Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) Merck 1.0658
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) Merck 1.06346
Fetal calf serum (FCS) Cambrex BioScience DE-14-802F
DAKO cytomation wash buffer 10x DAKO S3006 Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming.
N,N-Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) Fluka 40250 Flammable. Acute toxicity.
Glas coverslips 24 x 36 mm Menzel-Gläser BB024036A1
Hydrochloric acid, conc. (HCl) Sigma-Aldrich 30721 Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.
Hydrochloric acid solution volumetric, 2 M HCl (2 N) Fluka 71826 Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.
Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) Sigma-Aldrich S2252 Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment.
Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) Merck 1.08454 Oral exposures may cause reproductive and developmental effects.
Equipment
Tissue-TekV.I.P Vacuum Infiltration Processor Sakura 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz
Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome Hacker instruments
Household food steamer Braun MultiGourmet FS 20
Light microscope Leica Polyvar 2

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