Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

1Humanitas Clinical and Research Center, Italy, 2Institute of Genetic and Biomedical Research (IRGB), National Research Council (CNR)
Biology

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Summary

Pluripotenten Stammzellen, entweder embryonale oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), eine wertvolle Quelle der menschlichen differenzierten Zellen, einschließlich Herzmuskelzellen. Hier werden wir auf die kardiale Induktion der iPS-Zellen zu konzentrieren, die zeigen, wie man sie benutzt, um funktionelle menschliche Herzmuskelzellen durch eine Embryoidkörpern-basiertes Protokoll zu erhalten.

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Di Pasquale, E., Song, B., Condorelli, G. Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (76), e50429, doi:10.3791/50429 (2013).

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Abstract

Um die Ereignisse Antreiben Entwicklung des Herzens zu untersuchen und um die molekularen Mechanismen, die zu myokardialen Erkrankungen beim Menschen zu bestimmen, ist es wichtig, erste funktionalen humanen Kardiomyozyten (CMS) zu erzeugen. Die Verwendung dieser Zellen in der Wirkstoffforschung und toxikologischen Studien wäre auch sehr vorteilhaft, so dass neue pharmakologische Moleküle zur Behandlung von Herzerkrankungen vor, klinisch Zellen menschlichen Ursprungs validiert werden. Von den möglichen Quellen der CMs sind induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) zu den vielversprechendsten, da sie direkt aus leicht zugänglichen Patientengewebe abgeleitet werden und besitzen eine intrinsische Fähigkeit, die zu allen Zelltypen des Körpers 1 zu geben. Mehrere Methoden zur Differenzierung iPS-Zellen in CMs vorgeschlagen worden, angefangen von der klassischen Embryoidkörpern (EVG) Aggregation Ansatz zur chemisch definierten Protokollen 2,3. In diesem Artikel werden wir vorschlagen, ein EBS-basiertes Protokoll und zeigen, wie diese method eingesetzt werden, um effizient zu erzeugen funktionale CM-Zellen aus Feeder-freie iPS-Zellen werden.

Introduction

Historisch gesehen hat die Untersuchung der genetischen und molekularen Mechanismen, die menschliche Entwicklung und die Krankheit auf die Erzeugung von gentechnisch veränderten Tiermodellen basiert. Allerdings scheitern zahlreichen menschlichen Phänotypen bei Mäusen erfolgreich repliziert werden, vor allem wegen der biologischen Unterschiede zwischen den beiden Arten. Auf der anderen Seite, zu menschlichen Geweben zugreifen kann begrenzt werden und oft nicht genügend Material für eingehende experimentelle Untersuchungen erhalten werden. Das Gebiet der Herz-Kreislauf-Biologie leidet unter diesen beiden Einschränkungen: die Physiologie des menschlichen Herzens ist signifikant verschieden von der Maus, und eine beträchtliche Menge von Herzgewebe ist nur post-mortem oder während einer Herzoperation. Das Finden einer optimalen Quelle für die Differenzierung von funktionellen humanen CMS hat deshalb zu einem zentralen Thema in der Herz-Kreislauf-Biologie und viel Anstrengung wurde unternommen, um dieses Problem zu beheben. Verschiedene Zelltypen wurden vorgeschlagen, including Skelettmyoblasten, lokalen kardialen Stammzellen, Knochenmark mononukleären Zellen, Endothelzellen Vorläuferzellen und mesenchymalen Stammzellen. Allerdings erhaltenen Daten unter Verwendung dieser Zellen noch nicht durchgängig 4.

Die Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen (ESC) und die ersten 5 bahnbrechende Entdeckung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von Yamanaka und Thomson 6,7 später schien Lösungen: Diese Zellen haben die Fähigkeit, unbegrenzt zu wachsen und das Potenzial zu geben steigen, um alle Zellen Derivate der drei Keimblätter, einschließlich der CMs. Die Verwendung von IPS-Zellen bietet weitere Vorteile: ist aus autologen adulten Zellen abgeleitet, tragen sie die gleichen Genom des Individuums oder Patienten, aus denen sie abgeleitet sind. Sie ermöglichen damit die Entwicklung von in-vitro-Modelle, die die Untersuchung von menschlichen genetischen Erkrankungen und Mechanismen der Entwicklung zu erleichtern. Auf Grund dieser Eigenschaft können iPS-Zellen auch overcome Probleme im Zusammenhang mit Immunabwehr und ethische Fragen 8. Aus diesen Gründen, obwohl WSR noch den Goldstandard im Bereich der Stammzellbiologie darstellen, sind Forscher weltweit nun mehr bewegen zu iPS-Technologie.

iPS-Zellen werden nun verwendet werden, um menschliche Krankheiten in vitro-Modell für verschiedene Bedingungen, einschließlich angeborenen Herz-Kreislaufstörungen 9,10. Vor kurzem hat Anwendung von iPS-Zellen Krankheit Modellierung für monogenic Herzerkrankungen (dh Long-QT-Syndrome, katecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie) und Pathologien, bei denen Herzfehler sind Teil eines komplexen Phänotyp (dh Leopard und Timothy-Syndrom, dilatative Kardiomyopathie) durchgeführt. Diese Berichte bestätigt, dass Patienten-spezifischen iPS-Zellen, die in CMs differenziert werden ähnliche phänotypische und funktionelle Eigenschaften aufweisen, wie die Krankheit in vivo.

Allerdings gibtsind noch viele Herausforderungen, um die Wirksamkeit zu induzieren die iPS-Zellen in das Herz-Linie zu verbessern. Spontane Generation von CMS aus menschlichen WSR über Aggregatbildung genannt Embryoidkörpern (EVG) haben erfolgreich 17 bewährt. Seit dieser Entdeckung wurden viele andere Methoden vorgeschlagen worden. Viele Gruppen haben sich die Effizienz der Differenzierung Protokoll weiterentwickelt und haben zu chemisch definierten und Tier-product-freie Kultur Reagenzien bewegt (siehe Mummery, C., et al., Circulation Research (2012) für eine umfassende Überprüfung aller bestehenden Methoden 3 ).

Dennoch ist die klassische Methode auf EB Aggregation basiert immer noch das am häufigsten für die Durchführung funktionelle Studien und Erforschung von Krankheiten Mechanismen eingesetzt. Unsere vorgeschlagene Protokoll basiert auf der Aggregation von iPS-Zellen in EBs und Kultur in Gegenwart von Serum und Ascorbinsäure, die gezeigt wurde, dass die kardiale Differenzierung Prozess zu verbessern und po Basissitively Auswirkungen auf die Reifung dieser Zellen 18,19. In diesem Artikel werden wir durch diese Methodik im Detail zu gehen und zeigen, wie Feeder-freie iPS-Zelllinien zur Erzeugung von Patienten-spezifischen iPS-abgeleiteten CMs verwenden.

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Protocol

1. Feeder-freie Wartung und Passagieren der menschlichen iPS-Zelllinien

  1. Bereiten Sie die Matrigel-beschichteten Schalen. Tauwetter ein Fläschchen des menschlichen ESC qualifizierte Matrix auf Eis für eine Stunde und verdünnen Sie es in 25 ml DMEM-F12 Medium. 1 ml bis 35 mm je Platte (oder äquivalente Mengen pro Fläche, wenn andere Gerichte verwendet werden), halten alles auf Eis und sicherzustellen, dass alle Platten und Rohre vorgekühlt sind. Die Platten mit Aluminiumfolie.

Hinweis: Matrigel stock Konzentrationen je nach der Partie. Dilution Anweisungen auf dem Datenblatt angegeben.

  1. Halten Platten auf Eis über Nacht und entfernen von Eis am nächsten Tag. Die Platten können im Kühlschrank aufbewahrt werden, bis zu einer Woche vor dem Gebrauch.
  2. Bereiten Sie die mTESR1 Vollmedium (oder auftauen ein Fläschchen Nutristem mittel) und die H-ESM (human ESC mittel) gemäß der folgenden Tabelle.
    H-ESM Endkonz. Für 500 ml
    Knockout Serum Replacement (KSR) 20% 100 ml
    GlutaMAX 100X 2 mM 5 ml
    MEM nicht-essentielle Aminosäuren 0,1 mM 5 ml
    Penicillin-Streptomycin 100 U / ml - 0,1 mg / ml 5 ml
    2-Mercaptoethanol 0,1 mM 900 ul
    B27 Supplement - ohne VitaminA 1% 10 ml
    N2 Supplement 1% 5 ml
    Knockout DMEM - 370 ml

    Auf Medium kann bei 4 ° C für nicht mehr als 2 Wochen gelagert werden. Um eine vollständige Nährmedium herzustellen, wird nur vor dem basischen FGF hinzugefügte Fütterung in einer Endkonzentration von 20 ng / ml.

Hinweis: Komplette H-ESM auf embryonale Maus-Fibroblasten bedingt kann anstelle mTESR1 oder Nutristem für iPS-Zellen verwendet werden.

  1. Platzieren beschichteten Platten im Brutschrank bei 37 ° C für 30 min bis 2 h vor Passage.
  2. Die Zellen sollten passagiert etwa alle 5 Tage, auch wenn sie nicht Zusammenfluss erreicht. Kolonien sollten sich nicht berühren.
  3. Ersetzen Nährmedium mit 1 ml Dispase (1 mg / ml, gelöst von einer 10 mg / ml Brühe in PBS).
  4. Entfernen differenzierenden Bereiche mit gezogenem Glas Pasteur Pipetten. Bereiche, die entfernt werden sollten kraterförmige oder zystische Strukturen in der Mitte der Kolonien, und alle Bereiche, in denen Zellen werden aus Kolonien getrennt und abgeflacht zu sein scheinen Migration nach außen.
  5. Bei 37 ° C unter einer Kultur Haube bis Kolonie Grenzen heller geworden und beginnen zu lösen (in der Regel ca. 5-7 min). Discard Dispase. Waschen mit 1 ml H-ESM und zu verwerfen.
  6. In 1 ml H-ESM, verwenden Sie eine Zelle Heber (Spachtel-wie Schaber) zur Ernte Kolonien und sammeln sich in einem 15 ml Eppendorf-Röhrchen. Spülen mit 1 ml H-ESM und zu dem Rohr. Spin bei 1.000 rcf für 4 min und entfernen Sie den Überstand.
  7. Pellet in 1 ml vorgewärmten Wachstumsmedium (entweder mTESR1 oder Nutristem). Vermeiden Aufbrechen Klumpen zu viel - und Abpipettieren weniger als 6-8x. Ermitteln Sie, wie viele Zellen sollten überzogene und unnötige Zellen (in der Regel 1.04 oder 1:5 Verdünnung), für 2 Platten bei 1.05 zB, entfernen Sie 600 ul, dann fügen Sie 1,6 ml frisches Medium.
  8. Entfernen Matrigel von Platten. Platz Zellen durch tropfenweise verteilen gleichmäßig auf der Platte. Vermeiden Sie Schütteln der Röhre übermäßig, da dies dazu führen, Zellen in Richtung Zentrum bewegen.
  9. Waschen Rohr mit 1 ml Medium und Kluft zwischen den Platten. Das endgültige Volumen in jeder Platte sollte 1,5 -2 ml betragen.
  10. Ändern Medium jeden Tag, außer für den Tag nach Passagieren. Obwohl esideal, um das Medium täglich ändern, kann dies gelegentlich bei einer Frequenz von einmal alle zwei Tage gewechselt werden, wenn nicht mehr als 2-3 Tage seit dem letzten Durchgang, ohne die Pluripotenz oder Differenzierungspotentials bestanden haben.
  11. Wenn die Zelllinie müssen eingefroren werden, statt erneut zu suspendieren in 1-2 ml mFreSR Einfrieren Medium unter Verwendung einer 2 ml Pipette und Platz 1 ml / cryovial. Platz in einem Fläschchen Gefriertruhen bei -80 ° C und Transfer zum flüssigen Stickstoff in 3-4 Tagen.

Hinweis: Die manuelle Mikrodissektion von iPS-Zellen müssen unter einem Stereomikroskop durchgeführt werden. Ein in-vitro-Fertilisation (IVF) Arbeitsstation (zB eine IVF Workstation aus KSystem) mit einem Stereomikroskop integriert ermöglicht Manipulation der Zellen unter sterilen Bedingungen während sie auf einer erhitzten Oberfläche gehalten werden. Wenn diese nicht vorhanden, kann ein Stereomikroskop nach einem regelmäßigen Laminarströmungshaube bewegt werden.

2. Embryoidkörpern Aggregation und Cardiac induction

  1. Bereiten EBM-20 Medium gemäß der folgenden Tabelle.
    EBM-20 Endkonz. Für 500 ml
    Fetal Bovine Serum (Herkunft Südamerika) 20% 100 ml
    MEM nicht-essentielle Aminosäuren 0,1 mM 5 ml
    Penicillin - Streptomycin 100U/ml - 0,1 mg / ml 5 ml
    GlutaMAX 100X 0,1 mM 5 ml
    2-Mercaptoethanol 50 &mgr; M 450 ul
    DMEM/F12 - 385 ml

    Verwendung von FBS Südamerikas Herkunft ist entscheidend für die Bestimmung der Differenzierung Effizienz: Beschäftigung von anderen Arten von sera beeinflussen könnendie Differenzierung. Um eine vollständige EBM-20, Add Ascorbinsäure (AA) auf eine Endkonzentration von 50 ug / ml vorbereiten. Komplettem Wachstumsmedium kann bei 4 ° C für nicht länger als eine Woche gelagert werden.
  2. Ernte iPS Kolonien wie oben (Schritte 1.6 bis 1.9) beschrieben.
  3. Resuspendieren vorsichtig in 1 ml EBM-20 mit einer 2 ml Pipette. Vermeiden Aufbrechen Klumpen zu viel - und Abpipettieren nicht mehr als 2-3x, die Überprüfung der Größe der Kolonien unter dem Stereomikroskop. Platte auf ultra-low Befestigungsplatten im Verhältnis 1:1 (zB für eine 35 mm-Schale, verwenden Sie 1 Well einer 6-Well-Platte). Spülen Rohr mit 1 ml EBM-20 und in den Teller.

Anmerkung: Die Größe der Kolonien auf die Differenzierung, die Steuerung der Effizienz und Timing der kardialen Induktion. Aggregation von homogen große EBs wurde gezeigt, dass die Variabilität während der Differenzierung beobachtet reduzieren.

  1. Am 3. Tag, EBM-20 einmal zu ändern mit Hilfe eines Mikroskops zu vermeiden erneutfernung von EBs. Halten Pipette nahe der Plattenkante und entfernen Medium.
  2. Am Tag 7, Schalter EBs Platten mit 0,1% Gelatine und zuvor bei 37 ° C für 30 Minuten platziert beschichtet. Falls erforderlich, können Gelatine entfernt, und die Platten ließ unter einer Zellkultur Haube O / N. In 35-40 EK pro 35 mm-Schale.
  3. Prüfen EBs für den Sieg gegen Gebiete und Änderung EBM-20 zweimal pro Woche. Markieren Sie heraus, wo schlagen Bereichen sind auf der Oberseite der Schale Abdeckung, um sie unter dem Stereomikroskop Lokalisierung zu erleichtern. Öffentlicher Bereiche sollten nach etwa 10-20 Tagen erscheinen.
  4. Als Gebiete mit spontanen Kontraktion erscheinen, schalten mittel-bis EBM-2 (Vorbereitung als EBM-20, mit 2% FBS statt) und isolieren sie wie unten beschrieben in Abschnitt 3.
  5. Weiter auf andere Bereiche für das Schlagen und ändern Medium zweimal pro Woche bis gegen Bereiche für weitere Experimente nötig sind, zu überprüfen.

Hinweis: Wirkungsgrad der Differenzierung ist stark abhängig vonmehreren Faktoren ab, sind die kritischen wobei bestimmte Zelllinien und der Ansatz von Serum verwendet, um Herz-Differenzierung zu induzieren. Um die höchste Effizienz zu erzielen, Test Zelllinien für kardiomyogenen Potential und verschiedenen Chargen von Serum.

3. Beating Bereiche Isolation und Kultur

  1. Coat 12-Well-Platten (4 cm 2 Fläche) oder die Platten von Interesse mit 5 ug / cm 2 Fibronektin, in PBS verdünnt, um genügend Volumen, um die gesamte Fläche vollständig abdecken (300 ul insgesamt pro Well in 12-Well-Platten) zu machen. Halten aufgedeckt in Zellkultur Kapuze und trocknen lassen. Die Platten können gewickelt und bei 4 ° CO / N.
  2. Entfernen schlagen Bereich mit einem Glas gezogen Pasteur Pipette und Skalpell, je nach Bedarf. Übertragen auf Fibronectin-beschichteten Platten mit einer 1 ml Pipette.
  3. 1 ml EBM-2.
  4. Überqueren Sie die Platte, um die Bereiche, in denen Zellen wurden entfernt angeben und ändern Sie das Medium. Die Platten können gehalten werden bis zu 1 Monat, wie andere Bereiche b beginnen kannessen später.

Hinweis: Wenn kleinere Klumpen schlagen benötigt werden, Pipette die explantierten Bereich nach oben und unten mehrmals unter dem Stereomikroskop, bis es in kleinere Stücke bricht. Dies wird in Gruppen von ein paar Schläge Zellen (siehe Film 3) führen.

  1. Ändern Medium zweimal pro Woche bis bereit für die Analysen.

Hinweis: Kardiomyozyten aus diesem Protokoll erhaltenen besitzen fetalen wie morphologische und funktionelle Eigenschaften; Reifung gegenüber einem Erwachsenen-ähnlichen Phänotyp kann durch Erhöhen der Zeit in Kultur weiter differenzieren diese Zellen erhalten werden.

4. Einzel-Beating Cells Isolierung und Analyse

  1. Coat 2-Kammer-Objektträgern (4 cm 2 Fläche) oder andere geeignete Träger mit 5 ug / cm 2 Fibronektin in ausreichender PBS verdünnt, um die gesamte Kultur bedecken. Wenn ein Glasträger dient, Mantel mit Laminin und Fibronektin (5 ug / cm <sup> je 2).
  2. Entfernen Sie schlagen mit einer Pasteurpipette / Skalpell von den Platten aus dem Abschnitt 3.
  3. Verwendung einer 1 ml abpipettiert, Zellen in ein 15 ml Röhrchen mit 500 ul Collagenase II (480 U / ml in PBS mit Mg und Ca), Inkubation 15 min bei 37 ° C und schüttelt das Rohr einmal während der Inkubation.
  4. Pipette nach oben und unten mit einer 200 ul Pipette. Wenn irgendwelche Klumpen bleiben, an die frische Collagenase II übertragen und wiederholen Sie Schritt 4.3.
  5. Wiederholen Sie Schritt 4,4 bis keine großen Klumpen übrig sind.
  6. Inactivate Kollagenase mit 3 ml EBM-2 (kein AA). Das Rohr kann dann unter der Haube in einem beheizten Rack belassen werden, bis andere Rohre bereit sind. Zentrifuge bei 1.000 rcf für 4 min.
  7. Pellet in 1 ml 0,25% Trypsin / EDTA (verdünnt aus einer 0,5%-Lager in 1X PBS) und bei 37 ° C inkubieren für 5 min. Kombinieren Fraktionen Aufschlüsse aus dem gleichen ursprünglichen Probe.
  8. Trypsin inaktivieren mit 4 ml EBM-2 (kein AA). Pass-Zellen durch eine 18G Nadel auf einer 2,5-ml-Spritze nicht mehr than 7x. Zentrifuge bei 1.000 rcf für 4 min.
  9. Zellpellet in 1 ml EBM-2 pro Well und Platte. Zellen können zur funktionellen und morphologischen Analysen 2-3 Tage nach der Beschichtung verwendet werden.

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Representative Results

In unseren Studien haben wir erzeugt CMs aus mehreren iPS-Zelllinien. Diese Linien wurden zunächst auf einem MEF Feeder-Schicht erzeugt, sondern wurden sofort auf Matrigel platziert mit einem definierten Medium (entweder mTESR1 oder Nutristem). Verschiedene Tests wurden verwendet, um die Wartung der morphologischen Eigenschaften, die Expression von Markern typisch für pluripotente Zellen (OCT-4, SSEA4 und TRA1-60) und ihre Stabilität des Genoms (Abbildung 1) zu überprüfen.

Induktion in der kardialen Zelllinie wurde durch Aggregation von iPS-Zellen in EBs und Kultur in der Gegenwart von einer bestimmten Art von Serum und AA (2A und 2B) ausgelöst. Öffentlicher Bereichen vertreten 20-35% der Gesamtkosten, abhängig von der verwendeten Zelllinie (2C und Film 1). Öffentlicher CMs aus diesen Regionen durch enzymatische Verdauung (Movie 2) isoliert ausgedrückt typische cardiomyocyte strukturelle Proteine ​​(Troponin, & alpha;-sarcomeric Aktin, Myosin schweren Ketten α und β), gap junction-Proteine ​​(Connexin-43), und die großen Ionenkanäle (Abb. 2D-2F). Elektrophysiologische Analyse dieser Zellen ergab eine heterogene Population aus Zellen mit Knotenpunkten, Vorhof-und Kammerflimmern Profile (Daten nicht gezeigt, Priori, SG, et al., J. Clin. Invest., In Press, 14,15,20).

Abbildung 1
Abbildung 1. Feeder-freie iPS-Zellen Wartung nicht beeinträchtigt Pluripotenz. AB) iPS Kolonien auf Matrigel gewachsen behalten ihre menschlichen ESC-ähnliche Morphologie, mit Phase-hellen Kanten und prominenten Nukleolen. CD) Immunfluoreszenz Analysen zeigen, iPS-Zellen korrekt Expression des Transkriptionsfaktors Oct-4 (C)und die TRA1-60 Oberflächen-Antigen (Maßstabsbalken: 50 um). (D) (E) Cytofluorimetric Analyse bestätigte die Expression von typischen Oberfläche Pluripotenz Antigene (SSEA-4 und TRA1-60). Die Gating-Strategie wird von der linken Streuung gezeigt. (F) Vertreter Karyotypanalyse von iPS-Zellen auf Matrigel gewachsen. Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 2
Abbildung 2. Differenzierung von funktionellen iPS-CMs abgeleitet. A) Schematische Darstellung der Differenzierung Protokoll. B) Embryoid Leichen aus iPS-Zellen aggregiert. C) Darstellung einer Fläche von Kontraktion. D) RT-PCR zeigenING die Expression einiger Herz-spezifische Ionenkanäle durch die iPS-abgeleiteten schlagen Klumpen (CACNA1A - Calcium-Kanal-, Spannungs-abhängigen, alpha 1A-Untereinheit; SCN5A - Natrium-Kanal-, Spannungs-gated, Typ V, alpha-Untereinheit; KCNQ1 - Kalium-Spannung gated Kanal KQT wie Unterfamilie, member 1) und beide Formen der Myosin schwere Kette (MHC-a und MHC-b). Keine Expression wurde in IPS-Zellen nachweisbar, während cDNA von fetalen Zellen als positive Kontrolle verwendet wurde. HGPRT wurde als Housekeeping-Gen verwendet. EF) Immunfluoreszenzfärbung zeigt einzigen iPS-abgeleiteten CMs Ausdruck der strukturellen Protein α-sarcomeric Aktin, Troponin I (TNNI) und die herz-spezifische Kreuzung Connexin 43 (CNX-43). Maßstab Bars: 50 um. Die Bilder wurden mit einem Zeiss Fluoreszenz Axiovision inversen Mikroskop analysiert und mit ImageJ. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

<strong> Film 1. Öffentlicher Bereich aus iPS-Zellen abgeleitet. Klicken Sie hier, um Film anzusehen.

Movie 2. Einzel-Contracting iPS-abgeleiteten CMs von enzymatischen Abbau von einem Vertragsstaat Bereich erhalten. Klicken Sie hier, um Film anzusehen.

Movie 3. Kleine Auftraggeber Cluster durch partielle mechanische Präparation erhalten. Klicken Sie hier, um Film anzusehen.

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Discussion

Pluripotenten Stammzellen haben das Potenzial, spontan differenzieren sich in CMs, wenn auch mit geringer Effizienz und hohe Variabilität zwischen Linien. Die Entwicklung neuer Induktion Methoden wurde deshalb zur Verbesserung der Effizienz des Verfahrens und der sich in Richtung mehr definierten Protokollen konzentriert. Allerdings sind die meisten dieser neuen Differenzierungsmethoden ziemlich komplex und erfordert aufwendige Kulturbedingungen Feinsteuerung der Zeitpunkt und die Konzentration der Reagenzien, und die Behandlung mit teuren Zytokinen und Wachstumsfaktoren. Außerdem machen Unterschiede in der endogenen Produktion von Cytokinen Signalisierung Werten verschiedener IPS Zelllinien es schwierig, die Cytokin-Konzentrationen, die häufig auf geeignete Pegel für jede Zelllinie angepasst werden muss standardisieren.

Reifung des erhaltenen iPS-abgeleiteten CMs stellt auch einen kritischen Aspekt zu berücksichtigen, wenn Sie versuchen kardialen Differenzierung von iPS-Zellen für Krankheit Modellierung und Wirkstoffforschung Anwendungen. Die differentiation von menschlichen iPS-Zellen WSR und in der Regel verursacht CMs mit einer fetalen Phänotyp dh ohne völlig gewachsene Struktur. Dies gilt insbesondere, wenn Monoschicht Ansätze verwendet werden, und als Folge davon sind zur Erzeugung, Verstärkung und Isolierung spezifischer Herzvorläuferzellen Populationen 2,3.

In diesem Szenario scheint der "klassischen" EBs Aggregation Methode, die immer noch weit verbreitet ist für Krankheit Modellierung verwendet, um besser an die experimentellen Anforderungen. Diese Methode ist einfach, ökonomisch, leicht durchführbar und eignet sich für alle Linien. Es gibt keine Notwendigkeit für zusätzliche Wachstumsfaktoren oder Cytokine oder für Single-Cell-Verdauung, die oft nicht sehr gut von iPS-Zellen toleriert, auch, benötigen sie zusätzliche Behandlungen mit ROCK-Inhibitoren 21. Darüber hinaus gleicht die Aggregation in EBS die natürliche Entwicklungsprozess einer pluripotenten Zelle, die EBs Bereitstellen eines 3-dimensionalen Umwelt und paracrine Signale, die mehr Ähnlichkeit mit physiologischen Bedingungen. Darüber hinaus hat die Zugabe von AA konsequent zu kardialen Differenzierung von iPS-Zellen zu verbessern gezeigt, und auch ihre strukturelle und funktionelle Reifung 18,19 verbessern. Die Wahl iPS-Zelllinien auf ihre kardiogenen Potential basiert, zusammen mit der Auswahl des am besten geeigneten Charge von Serum, kann die weitere Verbesserung der Effizienz der CM Generation.

Schließlich hat die hier vorgeschlagene Verfahren auch den Vorteil, dass keine Maus Feeder-Zellen, die die Möglichkeit einer Kontamination mit Maus-Zellen eliminiert und auch weiter vereinfacht die technischen Verfahren für iPS-Zellen und EBs Passagieren Bildung. Dieses Verfahren verleiht zahlreiche Vorteile und stellt eine deutliche Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik, den Weg für zukünftige kardiovaskuläre regenerative Medizin-Anwendungen.

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Disclosures

Keine finanziellen Interessen offen zu legen.

Acknowledgements

BS wurde von der Universität Mailand-Bicocca Summer Student Research Training Programm unterstützt, die Forschung wurde aus Mitteln des italienischen Gesundheitsministeriums und der italienischen Ministerium für Bildung, Universität und Forschung und Fondazione Humanitas GC unterstützt; wir dank Michael VG Latronico für die kritische Durchsicht der Manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Media and Reagents
Human ESC-qualified Matrix BD Biosciences 354277 Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C .
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution Sigma F0896-2MG Working concentration: 5 μg/cm2
Laminin Sigma L2020-1MG Working concentration: 5 μg/cm2
PBS (no Mg and Ca), 10X Lonza BE17-515F
PBS (with Mg and Ca), 10X Bio Sera XC-S2067/500
Dispase II, neutral protease, grade II Roche 4942078001 Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)
Trypsin/EDTA, 0.5% Sigma T3924
Collagenase type 2 Worthington 4176 Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca
DMEM-F12 Life Technologies 21331-020
Knockout DMEM Life Technologies 10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR) Life Technologies 10828-028 Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C
F–tal Bovine Serum (origin South America) Invitrogen 10270-106 Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X Life Technologies 15140-122
GlutaMAX, 100X Life Technologies 35050-038
MEM NEAA, 100X Invitrogen 11140-135
N2 supplement, 100X Life Technologies 17502-048
B27 supplement, 50X Life Technologies 12587-010
2-mercapt–thanol Invitrogen 31350-010
Gelatin, from porcine skin Sigma G1890-100G Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C
mTeSR1 Stem Cell Technologies 5850 Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week
Nutristem hESC XF Stemgent from Biological Industries 05-100-1A Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week.
mFreSR Stem Cell Technologies 5853
Ascorbic acid Sigma A4544-25G Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)
Plasticware
35 mm culture dishes Becton Dickinson 353001
Cell scraper Corning Incorporated 3008
12-well plates Becton Dickinson 353043
Permanox 2-well chamber slides Thermo Fisher Scientific 177437
Glass 2-well chamber slides Thermo Fisher Scientific 177380
6-well plates, ultra-low-attachment surface Corning Incorporated 3471
18G needle Becton Dickinson 304622
Glass pasteur pipettes, 230 mm VWR International 612-1702
2.5 ml syringe Becton Dickinson 300188
Equipments
IVF Workstation KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope Nikon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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