Generation of Human cardiomyocytes: En Differentiering Protocol fra Feeder-fri Menneskelige induceret pluripotente stamceller

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Pluripotente stamceller, enten embryonale eller induceret pluripotente stamceller (iPS-celler), udgør en værdifuld kilde til humane differentierede celler, herunder cardiomyocytter. Her vil vi fokusere på hjertets induktion af iPS celler, der viser, hvordan man bruger dem til at opnå funktionelle menneskelige cardiomyocytes gennem en embryoid organer-baseret protokol.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Di Pasquale, E., Song, B., Condorelli, G. Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (76), e50429, doi:10.3791/50429 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

For at undersøge de begivenheder køre hjerte udvikling og at bestemme de molekylære mekanismer, der fører til myocardiale sygdomme hos mennesker, er det vigtigt først at generere funktionelle humane cardiomyocytter (CMS). Brugen af ​​disse celler i lægemiddelforskning og toksikologiske undersøgelser ville også være meget gavnlig, så nye farmakologiske molekyler til behandling af hjertesygdomme skal valideres præ-klinisk på celler af menneskelig oprindelse. Af de mulige kilder til CMS er induceret pluripotente stamceller (iPS-celler) blandt de mest lovende, da de kan udledes direkte af lettilgængelig patient vævet og har en egentlig kapacitet til at give anledning til alle celletyper i kroppen 1.. Flere metoder er blevet foreslået til at differentiere iPS celler i CMS, der spænder fra de klassiske embryoid organer (EBS) sammenlægning tilgang til kemisk definerede protokoller 2,3. I denne artikel vil vi foreslå en EB-baseret protokol, og vise, hvordan dette method kan anvendes til effektivt at generere funktionelle CM-lignende celler fra feeder-fri iPS celler.

Introduction

Historisk set har undersøgelsen af ​​de genetiske og molekylære mekanismer kørsel menneskelig udvikling og sygdom været baseret på generation af genetisk modificerede dyremodeller. Men mange menneskelige fænotyper ikke med held gentaget i mus, primært på grund af de biologiske forskelle mellem de to arter. På den anden side, adgang til humane væv kan begrænses, og ofte ikke nok materiale til at opnås for dybdegående eksperimentelle studier. Feltet af kardiovaskulære biologi lider begge disse begrænsninger: fysiologi af det menneskelige hjerte er væsentligt forskellig fra musen, og en betydelig mængde af hjerte væv er kun tilgængelige post mortem eller under hjerteoperation. Finde en optimal kilde til differentiering af funktionelle menneske CMS er derfor blevet et centralt emne i kardiovaskulær biologi og meget indsats er gjort for at løse dette problem. Forskellige celletyper er blevet foreslået, including skelet myoblaster, lokale hjerte stamceller, knoglemarvsceller mononukleære celler, endotelceller progenitorer og mesenkymale stamceller. Men data opnået ved hjælp af disse celler ikke har været konsekvente 4..

Udledningen af menneskelige embryonale stamceller (ESC) først 5 og banebrydende opdagelse af inducerede pluripotente stamceller (iPS) celler ved Yamanaka og Thomson 6,7 senere syntes at levere løsninger: Disse celler har evnen til at vokse på ubestemt tid og potentialet til at give stige til alle celle derivater af de tre kimlag, herunder CMS. Anvendelsen af ​​iPS celler giver yderligere fordele: bliver afledt fra autologe voksne celler, de udfører den samme genom som individ eller patient, hvorfra de er afledt. De har derfor mulighed for udvikling af in vitro-modeller, der letter undersøgelse af genetiske sygdomme hos mennesker og mekanismer i udvikling. I kraft af denne egenskab, kan iPS celler også overcome problemer relateret til immun afvisning og etiske spørgsmål 8.. Af disse grunde, selvom økonomiske og sociale råd udgør stadig guldstandarden inden for stamceller biologi forskere over hele verden bevæger sig nu mere mod iPS-celle teknologi.

iPS celler bliver nu ansat til at modellere menneskelig sygdom in vitro for forskellige forhold, herunder medfødte kardiovaskulære lidelser 9,10. For nylig har anvendelsen af iPS celle sygdom modellering blevet udført for monogene hjertelidelser (dvs. lange QT-syndrom, katekolaminerge polymorf ventrikulær takykardi) og patologier, hvor hjerte-defekter er en del af en kompleks fænotype (dvs. Leopard og Timothy syndromer, dilaterede kardiomyopati). Disse rapporter bekræftede, at patient-specifikke iPS celler, der er differentieret i CMS viser lignende fænotypiske og funktionelle karakteristika som sygdommen in vivo.

Men derer stadig mange udfordringer for at forbedre effektiviteten af ​​inducere iPS celler i hjertets afstamning. Spontan generation af CMS fra humane økonomiske og sociale råd via samlet formation kaldet embryoid organer (EBS) har vist sig succesfuld 17.. Siden denne opdagelse, har mange andre metoder blevet foreslået. Mange grupper har i høj grad forbedret effektiviteten af differentiering protokol og har bevæget mod kemisk definerede og animalsk produkt-fri kultur reagenser (se Mummery, C., et al., Circulation Research (2012) for en omfattende gennemgang af alle eksisterende metoder 3 ).

Ikke desto mindre er den klassiske metode baseret på EB sammenlægning udgør fortsat den mest almindeligt anvendte til at udføre funktionelle undersøgelser og efterforskning sygdomsmekanismer. Vores foreslåede protokol er baseret på aggregering af iPS celler i EB'er og kultur i nærvær af serum og ascorbinsyre, der har vist sig at forbedre hjerte-differentiering proces og positively påvirke modningen af disse celler 18,19. I denne artikel vil vi gå gennem denne metode i detaljer og vil vise, hvordan man bruger feeder-fri iPS cellelinier til at generere patient-specifikke iPS-afledt CMS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Feeder-fri Vedligeholdelse og Passaging Menneskerettighedsdomstols iPS cellelinier

  1. Forbered Matrigelcoatede retter. Thaw et hætteglas med human ESC-kvalificeret Matrix på is i en time og fortynde det i 25 ml DMEM-F12 medium. Tilsæt 1 ml til hver 35 mm plade (eller tilsvarende beløb pr areal, hvis andre retter er brugt), holde alt på is og sikre, at alle plader og rør er præ-afkølet. Dækplader med aluminiumsfolie.

Bemærk: Matrigel lager koncentrationerne varierer ved batch. Fortyndingsvejledning er angivet på databladet.

  1. Hold pladerne på is natten over og fjerne fra is næste dag. Plader kan opbevares i køleskab op til en uge før brug.
  2. Forbered mTESR1 komplette medium (eller tø et hætteglas med Nutristem medium) og H-ESM (human ESC medium) i henhold til nedenstående tabel.
    H-ESM Slutkoncentration FOR 500 ml
    Knockout Serum udskiftning (KSR) 20% 100 ml
    Glutamax 100X 2 mM 5 ml
    MEM ikke-essentielle aminosyrer 0,1 mM 5 ml
    Penicillin-streptomycin 100 E / ml - 0,1 mg / ml 5 ml
    2-mercaptoethanol 0,1 mM 900 gl
    B27 Supplement - uden Vitamina 1% 10 ml
    N2 Supplement 1% 5 ml
    Knockout DMEM - 370 ml

    Stock medium kan opbevares ved 4 ° C i ikke mere end 2 uger. For at forberede komplet vækstmedium, der grundlæggende FGF tilsættes bare before fodring i en endelig koncentration på 20 ng / ml.

Bemærk: Komplet H-ESM betinget af muse embryonale fibroblaster kan anvendes i stedet for mTESR1 eller Nutristem for iPS celler.

  1. Placer overtrukne plader i en inkubator ved 37 ° C i 30 min til 2 timer før passage.
  2. Cellerne skal passeres ca hver 5 dage, selv om de ikke har nået sammenløb. Kolonier bør ikke røre.
  3. Erstat vækstmedium med 1 ml dispase (1 mg / ml, opløses fra en 10 mg / ml stamopløsning i PBS).
  4. Fjern differentiere områder med trukket glas Pasteur-pipetter. Områder, der bør fjernes omfatte krater-lignende eller cystisk strukturer i midten af ​​kolonier, og eventuelle områder, hvor cellerne er blevet separeret fra kolonierne og flad og synes at være vandrende udad.
  5. Inkuber ved 37 ° C under en kultur hætte indtil koloni grænser bliver lysere og begynde at løsrive (normalt omkring 5-7 min). Der ad dispase. Vask med 1 ml H-ESM og kassér.
  6. I 1 ml H-ESM bruge en celle løfteren (spatel-lignende skraber) at høste kolonier og samles i en 15 ml eppendorfrør. Skyl med 1 ml H-ESM og tilføje til røret. Spin ved 1.000 RCF i 4 min og fjern supernatanten.
  7. Resuspender pellet i 1 ml forvarmet vækstmedium (enten mTESR1 eller Nutristem). Undgå at bryde op klumper for meget - pipettér op og ned mindre end 6-8x. Bestemme, hvor mange celler bør være belagt og fjerne unødvendige celler (sædvanligvis 1:04 eller 1:5 fortynding), fx til 2 plader på 1:5, fjerne 600 pi, tilsæt derefter 1,6 ml frisk medium.
  8. Fjern Matrigel fra pladerne. Place celler dråbe for dråbe, distribuere jævnt på pladen. Undgå at ryste røret overdrevent, da dette vil medføre celler til at bevæge sig mod midten.
  9. Vask rør med 1 ml medium, og skel mellem pladerne. Endelige volumen af ​​hver plade bør være 1,5 -2 ml.
  10. Skift medium hverdagen, bortset fra dagen efter passage. Selv om det erideel til at ændre mediet hverdag, kan dette undertiden ændres ved en frekvens på én gang hver to dage, hvis ikke mere end 2-3 dage er gået siden sidste passage uden at påvirke pluripotency eller differentiering potentiale.
  11. Hvis cellelinje skal indefryses, genopslæmmes stedet i 1-2 ml mFreSR frysemedium ved hjælp af en 2 ml pipette og sted 1 ml / cryovial. Sted hætteglas i en cryobox ved -80 ° C og overføres til flydende nitrogen i 3-4 dage.

Bemærk: Manuel mikrodissektion af iPS celler skal udføres under et stereomikroskop. Et in vitro fertilisering (IVF) arbejdsstation (fx en IVF Workstation fra KSystem) integreret med et stereomikroskop tillader manipulation af cellerne i sterile betingelser, mens de holdes på et opvarmet overfladeareal. Hvis dette ikke er tilgængelig, kan et stereomikroskop flyttes under en regelmæssig laminar strømning hætte.

2.. Embryoid organer Aggregering og Cardiac Induction

  1. Forbered EBM-20 medium i henhold til tabellen nedenfor.
    EBM-20 Slutkoncentration FOR 500 ml
    Føtalt bovint serum (oprindelse Sydamerika) 20% 100 ml
    MEM ikke-essentielle aminosyrer 0,1 mM 5 ml
    Penicillin - streptomycin 100U/ml - 0,1 mg / ml 5 ml
    Glutamax 100X 0,1 mM 5 ml
    2-mercaptoethanol 50um 450 pi
    DMEM/F12 - 385 ml

    Anvendelse af FBS i Sydamerika oprindelse er afgørende for at bestemme differentiering virkningsgrad: ansættelse af andre typer sera kan påvirkedifferentiering proces. At forberede komplet EBM-20, add ascorbinsyre (AA) til en slutkoncentration på 50 ug / ml. Komplet vækstmedium kan opbevares ved 4 ° C i ikke mere end en uge.
  2. Harvest iPS kolonier som beskrevet ovenfor (trin 1,6-1,9).
  3. Resuspender forsigtigt i 1 ml EBM-20 med en 2 ml pipette. Undgå at bryde op klumper for meget - pipettér op og ned ikke mere end 2-3x, kontrol af størrelsen af ​​kolonierne under stereomikroskop. Plade på ultralave vedhæftede plader i forholdet 1:1 (fx til en 35 mm skål, brug 1 brønd i en 6-brønds plade). Skyl rør med 1 ml EBM-20 og tilføje til plade.

Bemærk: Størrelsen af kolonierne påvirker differentiering proces, kontrollerende effektivitet og timing af hjertets induktion. Aggregering af homogent mellemstore EB'er har vist sig at reducere variabiliteten observeret under differentiering.

  1. På dag 3, ændre EBM-20 en gang ved hjælp af et mikroskop for at undgå renelse af EB'er. Hold pipette tæt på kanten af ​​pladen og fjerne medium.
  2. På dag 7, switch EB til plader overtrukket med 0,1% gelatine og tidligere placeret over ved 37 ° C i 30 min. Hvis det er nødvendigt, kan gelatine fjernes, og pladerne efterladt under en cellekultur hætte O / N. Tilføj 35-40 EB'er pr 35 mm skål.
  3. Tjek EB'er for at slå områder og ændre EBM-20 to gange om ugen. Afmærke hvor beating områder er beliggende på toppen af ​​skålen dækslet, for at lette de lokalisering under stereomikroskop. De kontraherende områder skal vises efter ca 10-20 dage.
  4. Når områder med spontan sammentrækning vises, skifter medium til EBM-2 (forberede sig så EBM-20, med 2% FBS i stedet), og isolere dem som beskrevet nedenfor i § 3. Stk.
  5. Fortsæt med at kontrollere andre områder til at slå og ændre medium to gange om ugen, indtil bankende områder er behov for yderligere forsøg.

Bemærk: Effektivitet af differentiering processen er meget afhængig afflere faktorer, den mest kritiske af hvilke specifikke cellelinier og det parti serum anvendes til at fremkalde hjerte differentiering. For at opnå den højeste effektivitet, prøverumstemperaturer linjer for cardiomyogenic potentiale og forskellige partier af serum.

3.. Beating Områder Isolering og Kultur

  1. Coat 12-brønds plader (4 cm 2 område) eller plader af interesse med 5 ug / cm 2 fibronectin, fortyndet i PBS at gøre nok volumen til at dække hele overfladen fuldstændigt (300 pi alt pr brønd i 12-brønds plader). Hold afsløret i cellekultur hætte og lad det tørre. Plader kan pakkes og opbevares ved 4 ° CO / N.
  2. Fjern slå område ved hjælp af et glas trukket Pasteur-pipette og skalpel, som er nødvendigt. Overførsel til fibronectin-plader med en 1 ml pipette.
  3. Tilsæt 1 ml EBM-2.
  4. Krydse fra pladen for at angive de områder, hvor celler blev fjernet og ændre mediet. Plader kan opbevares i op til 1 måned, og som andre områder kan begynde bspise senere.

Bemærk: Hvis mindre slå klumper er nødvendige, pipetteres det eksplanterede område op og ned flere gange under stereomikroskop, indtil det bryder i mindre stykker. Dette vil resultere i klynger af et par bankende celler (se film 3).

  1. Skift medium to gange om ugen indtil den er klar til analyserne.

Bemærk: cardiomyocytter opnået fra denne protokol besidder føtal-lignende morfologiske og funktionelle karakteristika, modning til en voksen-lignende fænotype kan opnås ved at øge den tid i kultur for en yderligere differentiering af disse celler.

4.. Single Beating Cells Isolering og analyse

  1. Coat 2-kammer slides (4 cm 2 område) eller andre egnede understøtninger med 5 ug / cm 2 fibronektin fortyndet i tilstrækkelig PBS til at dække hele kulturen overfladen. Hvis en glas-støtten anvendes, frakke med laminin og fibronectin (5 pg / cm <sup> 2 hver).
  2. Fjern slå område med en Pasteur pipette / skalpel fra pladerne fra punkt 3.
  3. Anvendelse af en 1 ml pipette, overfør celler til en 15 ml rør indeholdende 500 pi collagenase II (480 U / ml i PBS med Mg og Ca), og inkuberes 15 minutter ved 37 ° C, ryste røret en gang under inkubationen.
  4. Pipetteres op og ned med en 200 pi pipette. Hvis der stadigvæk er klumper, overførsel til frisk collagenase II, og gentag trin 4.3.
  5. Gentag trin 4.4, indtil ingen store klumper er tilbage.
  6. Inaktivere collagenase med 3 ml EBM-2 (ingen AA). Røret kan overlades derefter under hætten i en opvarmet rack indtil andre rør er klar. Centrifuger ved 1000 rcf i 4 min.
  7. Resuspender pellet i 1 ml 0,25% trypsin / EDTA (fortyndet fra en 0,5% bestand i 1X PBS) og inkuberes ved 37 ° C i 5 min. Kombiner fraktioner af digestions fra samme oprindelige stikprøve.
  8. Inaktivere trypsin med 4 ml EBM-2 (ingen AA). Passere celler gennem en 18G nål på en 2,5 ml sprøjte ikke mere tHan 7x. Centrifuger ved 1000 rcf i 4 min.
  9. Resuspender cellepelleten i 1 ml EBM-2 per godt og plade. Celler kan anvendes til funktionelle og morfologiske analyser 2-3 dage efter udpladning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I vores studier har vi genereret CMS fra flere iPS cellelinier. Disse linjer blev oprindeligt genereret på en MEF feeder lag, men blev straks placeret på Matrigel ved hjælp af et defineret medium (enten mTESR1 eller Nutristem). Forskellige assays blev anvendt til at verificere vedligeholdelse af de morfologiske egenskaber, ekspressionen af markører typiske pluripotente celler (OLT-4, SSEA4 og TRA1-60) og deres genom stabilitet (figur 1).

Induktion i hjertets afstamning blev udløst ved sammenlægning af iPS celler i EB'er og kultur i tilstedeværelse af en bestemt type serum og AA (figur 2A og 2B). Kontraherende områder er 20-35% af det samlede, afhængigt af den anvendte cellelinie (figur 2C og Movie 1). Kontraherende CMS isoleret fra disse regioner ved enzymatisk fordøjelse (Movie 2) udtrykte typiske cardiomyocyte strukturelle proteiner (kardial troponin, & alphen,-sarcomerisk actin, myosin tunge kæder α og β), gap junction proteiner (connexin-43), og de ​​store ionkanaler (figur 2D-2F). Elektrofysiologisk analyse af disse celler viste en heterogen population omfatter celler med nodal, atrielle og ventrikulære profiler (data ikke vist, Priori, SG, et al., J. Clin. Invest., I trykken, 14,15,20).

Figur 1
Figur 1. Feeder-fri iPS-celler vedligeholdelse påvirker ikke pluripotency. AB) iPS kolonier dyrket på Matrigel bevarer deres menneskelige ESC-lignende morfologi, med fase-lyse kanter og fremtrædende nucleoli. CD) Immunofluorescens analyser viser iPS celler korrekt udtrykker transskriptionsfaktoren OLT 4 (C)og TRA1-60 overfladeantigen (skalapanelerne: 50 um). (D) (E) Cytofluorimetric analyse bekræftede ekspressionen af typiske overflade pluripotens antigener (SSEA-4 og TRA1-60). Gating-strategi fremgår af den venstre scatter. (F) Repræsentant karyotype analyse af iPS celler dyrket på Matrigel. Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2. Differentiering af funktionelle iPS-afledt CMS. A) Skematisk repræsentation af differentiering protokollen. B) embryoid organer kumulerede iPS celler. C) Repræsentation af et område med sammentrækning. D) RT-PCR showING udtryk for nogle hjerte-specifikke ionkanaler fra de iPS-afledt slå klumper (CACNA1A - calcium kanal spænding afhængige, alpha 1A subunit, SCN5A - natrium-kanal, spænding-gated, type V, alpha subunit, KCNQ1 - kalium spænding- gated kanal, KQT ligesom underfamilien medlem 1), og begge former for myosin tung kæde (MHC-a og MHC-b). Ingen ekspression blev detekteret i iPS-celler, hvorimod cDNA fra føtale hjerteceller blev anvendt som en positiv kontrol. HGPRT blev anvendt som husholdning gen. EF) Immunfluorescensfarvning viser enkelt iPS-afledt CMS udtrykker strukturelle protein α-sarcomerisk actin kardial troponin I (TNNI) og hjerte-specifikke krydset connexin 43 (CNX-43). Skalapanelerne: 50 pm. Billederne blev optaget ved hjælp af en AxioVision Zeiss fluorescens omvendt mikroskop og analyseres med ImageJ. Klik her for at se større figur .

<strong> Movie 1. Kontraherende område stammer fra iPS celler. Klik her for at se filmen.

Movie 2. Enkelt kontraherende iPS-afledt CMS, fremstillet af enzymatisk fordøjelse af en ordregivende område. Klik her for at se filmen.

Movie 3.. Små ordregivende klynge, fremstillet ved delvis mekanisk dissektion. Klik her for at se filmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Pluripotente stamceller har potentiale til at differentiere spontant i CMS, omend med lav effektivitet og høj variabilitet blandt linjer. Udviklingen af ​​nye induktionsmetoder har derfor fokuseret på at forbedre effektiviteten af ​​processen og bevæger sig mod mere definerede protokoller. Men de fleste af disse nye differentiering metoder er ganske komplekse, kræver udførlige dyrkningsbetingelser, finkontrol af timing og koncentration af reagenser, og behandling med dyre cytokiner og vækstfaktorer. Også forskelle i de endogene cytokin signal niveauerne for forskellige iPS cellelinier gør det vanskeligt at standardisere cytokinkoncentrationer, der ofte skal justeres til passende niveauer for hver cellelinie.

Modning af den opnåede iPS-afledte CMS repræsenterer også et kritisk aspekt at overveje, når de forsøger hjerte differentiering af iPS celler til sygdom modellering og drug discovery applikationer. Den differentiation af menneskelige økonomiske og sociale råd og iPS-celler giver som regel anledning til CMS med en føtal fænotype dvs. uden en helt moden struktur. Dette er især tilfældet, når enkeltlagshylstre tilgange anvendes, og som et resultat af disse er mere egnet til generering, forstærkning og isolering specifikke hjerte progenitorpopulationer 2,3.

I dette scenario synes den "klassiske" EBS sammenlægning metode, som stadig i vid udstrækning brugt til sygdom modellering formål, for bedre at passe de eksperimentelle behov. Denne metode er enkel, økonomisk, let praktisk og egnet til alle linier. Der er ikke behov for yderligere vækstfaktorer eller cytokiner, eller for enkelt-celle fordøjelse, som ofte ikke er meget veltolereret af iPS celler også, de kræver yderligere behandlinger med ROCK hæmmere 21.. Endvidere sammenlægning i EBS ligner den naturlige udviklingsproces af en pluripotente celle, med EBS giver en 3-dimensionel miljø og paraCrine signaler, der er mere ligner fysiologiske betingelser. Endvidere har tilsætningen af AA vist konsekvent at forøge hjertets differentiering af iPS celler, og også at forbedre deres strukturelle og funktionelle modning 18,19. Valg iPS cellelinier baseret på deres cardiogent potentiale sammen med valg af den mest hensigtsmæssige batch af serum, kan yderligere forbedre effektiviteten af ​​CM generation.

Endelig har den metode foreslås her har også den fordel, at der ikke kræver mus feeder celler, som fjerner muligheden for forurening med museceller, og også yderligere forenkler de tekniske procedurer for iPS-celle passage og EBS-dannelse. Denne metode giver mange fordele, og udgør en væsentlig forbedring i forhold til tidligere teknikker, der baner vejen for fremtidige kardiovaskulære regenerativ medicin applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen finansielle interesser at afsløre.

Acknowledgements

BS blev støttet af universitetet i Milano-Bicocca Summer Student Research Training Program, forskning blev støttet med midler fra det italienske sundhedsministerium og italienske undervisningsministerium, universiteter og forskning og Fondazione Humanitas til GC, vi takker Michael VG Latronico for kritisk læsning af manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Media and Reagents
Human ESC-qualified Matrix BD Biosciences 354277 Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C .
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution Sigma F0896-2MG Working concentration: 5 μg/cm2
Laminin Sigma L2020-1MG Working concentration: 5 μg/cm2
PBS (no Mg and Ca), 10X Lonza BE17-515F
PBS (with Mg and Ca), 10X Bio Sera XC-S2067/500
Dispase II, neutral protease, grade II Roche 4942078001 Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)
Trypsin/EDTA, 0.5% Sigma T3924
Collagenase type 2 Worthington 4176 Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca
DMEM-F12 Life Technologies 21331-020
Knockout DMEM Life Technologies 10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR) Life Technologies 10828-028 Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C
F–tal Bovine Serum (origin South America) Invitrogen 10270-106 Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X Life Technologies 15140-122
GlutaMAX, 100X Life Technologies 35050-038
MEM NEAA, 100X Invitrogen 11140-135
N2 supplement, 100X Life Technologies 17502-048
B27 supplement, 50X Life Technologies 12587-010
2-mercapt–thanol Invitrogen 31350-010
Gelatin, from porcine skin Sigma G1890-100G Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C
mTeSR1 Stem Cell Technologies 5850 Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week
Nutristem hESC XF Stemgent from Biological Industries 05-100-1A Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week.
mFreSR Stem Cell Technologies 5853
Ascorbic acid Sigma A4544-25G Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)
Plasticware
35 mm culture dishes Becton Dickinson 353001
Cell scraper Corning Incorporated 3008
12-well plates Becton Dickinson 353043
Permanox 2-well chamber slides Thermo Fisher Scientific 177437
Glass 2-well chamber slides Thermo Fisher Scientific 177380
6-well plates, ultra-low-attachment surface Corning Incorporated 3471
18G needle Becton Dickinson 304622
Glass pasteur pipettes, 230 mm VWR International 612-1702
2.5 ml syringe Becton Dickinson 300188
Equipments
IVF Workstation KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope Nikon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function. Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).
  2. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473, 326-335 (2011).
  3. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circulation Research. 111, 344-358 (2012).
  4. Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132, 537-543 (2008).
  5. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  6. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  7. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  8. Yamanaka, S. A fresh look at iPS cells. Cell. 137, 13-17 (2009).
  9. Josowitz, R., Carvajal-Vergara, X., Lemischka, I. R., Gelb, B. D. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as models for genetic cardiovascular disorders. Curr. Opin. Cardiol. 26, 223-229 (2011).
  10. Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
  11. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2012).
  12. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2010).
  13. Yazawa, M., et al. Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome. Nature. 471, 230-234 (2011).
  14. Itzhaki, I., et al. Modeling of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific human-induced pluripotent stem cells. Journal of the American College of Cardiology. 60, 990-1000 (2012).
  15. Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Molecular Medicine. 4, 180-191 (2012).
  16. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4, 130ra147 (2012).
  17. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108, 407-414 (2001).
  18. Cao, N., et al. Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells. Cell Research. 22, 219-236 (2012).
  19. Takahashi, T., et al. Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes. Circulation. 107, 1912-1916 (2003).
  20. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2011).
  21. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics