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1Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Genetics, Harvard Medical School

Biology
 

Summary

हम unfertilized के संग्रह का वर्णन

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Sharp, J. A., Blower, M. D. Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs. J. Vis. Exp. (76), e50434, doi:10.3791/50434 (2013).

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Abstract

कई जीवों spatially और अस्थायी नियंत्रण जीन की अभिव्यक्ति के लिए विशिष्ट subcellular स्थलों के लिए mRNAs स्थानीय बनाना. हाल के अध्ययनों से transcriptome के बहुमत कोशिकाओं और भ्रूण में एक nonrandom स्थिति के लिए स्थानीय है कि प्रदर्शन किया है. स्थानीय mRNAs की पहचान करने के लिए एक दृष्टिकोण biochemically ब्याज की एक कोशिकीय संरचना को शुद्ध करने और सभी संबद्ध टेप की पहचान है. हाल ही में विकसित उच्च throughput अनुक्रमण प्रौद्योगिकी का उपयोग कर यह अब एक subcellular संरचना से संबद्ध सभी RNAs की पहचान करने के लिए सरल है. प्रतिलेख पहचान की सुविधा के लिए यह एक पूरी तरह से अनुक्रम जीनोम के साथ एक जीव के साथ काम करने के लिए आवश्यक है. Subcellular संरचनाओं के जैव रासायनिक शुद्धिकरण के लिए एक आकर्षक प्रणाली मेंढक Xenopus laevis से उत्पादित अंडे अर्क हैं. हालांकि, एक्स laevis वर्तमान प्रतिलिपि पहचान बाधित जो एक पूरी तरह से अनुक्रम जीनोम, नहीं है. इस अनुच्छेद में हम एक विधि का वर्णनएक संबंधित मेंढक, एक्स से अंडा अर्क का उत्पादन करने के लिए एक पूरी तरह से अनुक्रम जीनोम है कि tropicalis,. हम सूक्ष्मनलिका polymerization, शोधन और प्रतिलेख अलगाव के लिए जानकारी प्रदान करते हैं. इस लेख microtubule जुड़े टेप की पहचान के लिए एक विशेष विधि का वर्णन करते हैं, हम इसे आसानी से अन्य subcellular संरचनाओं को लागू किया जाएगा और स्थानीय RNAs की पहचान के लिए एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करेगा.

Introduction

जीन अभिव्यक्ति के स्थानिक और लौकिक नियंत्रण सभी कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है, और 1 pattering जल्दी भ्रूण के नियंत्रण के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. जीन अभिव्यक्ति के स्थानिक नियंत्रण कक्षों या भ्रूण के भीतर विशिष्ट स्थलों के लिए mRNAs की सक्रिय स्थानीयकरण के माध्यम से हासिल की है. कई बहुत बड़े प्रकार की कोशिकाओं में, (जैसे oocytes, भ्रूण, और न्यूरॉन्स) mRNA के स्थानीयकरण कोडित प्रोटीन की कार्रवाई की साइट के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रतिबंधित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. एक स्थानीय mRNA के प्रोटीन के उत्पादन के कई दौर के लिए उत्प्रेरित कर सकते हैं कि यह व्यक्ति प्रोटीन अणु स्थानीयकरण से एक mRNA स्थानीयकरण के लिए और अधिक कुशल है. वे आगे कोडित 2 प्रोटीन का स्थानीयकरण सीमित करने के लिए कार्य करता है जो अपने गंतव्य तक पहुंचने तक स्थानीयकृत mRNAs आमतौर translationally दमित रहे हैं. भ्रूण patterning नियंत्रित करने के लिए शाही सेना स्थानीयकरण के कई अच्छी तरह से प्रलेखित मामलों के अलावा, कई अध्ययनों स्थानीयकृत हैं कि mRNAs दस्तावेज हैइनकोडिंग प्रोटीन की कार्रवाई की साइट के लिए. प्रमुख उदाहरण चलता - फिरता fibroblasts की अग्रणी धार को β-actin के 3 और Arp2 / 3 4 mRNAs का स्थानीयकरण और meiotic और mitotic स्पिंडल 5-7 करने के लिए कई mitotic नियामकों के लिए mRNAs का स्थानीयकरण में शामिल हैं.

स्थानीय mRNAs का क्लासिक उदाहरण के कई मातृ प्रभाव परिवर्तन के लिए आनुवंशिक स्क्रीन के माध्यम से पहचान की गई और बाद में स्थानीय RNAs के सांकेतिक शब्दों में बदलना करने के लिए निर्धारित किया गया है. हालांकि, हाल के जीनोम चौड़ा पढ़ाई स्थानीयकृत RNAs के दायरे में व्यापक अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए शुरू कर दिया है. ड्रोसोफिला भ्रूण में स्वस्थानी संकरण स्क्रीन में हाल ही में एक सब mRNAs की ~ 70% कई उपन्यास स्थलों 8 सहित एक विशिष्ट स्थानीयकरण, है कि प्रदर्शन किया. माउस fibroblasts से pseudopodia के शोधन स्थानीयकृत mRNAs 9 की एक विविध समूह की पहचान की. Meiotic Xeno से सूक्ष्मनलिकाएं की जैव रासायनिक शुद्धिकरण का उपयोग कर हमारे समूह से कार्य करेंमवाद अंडा धुरी 5,7 साथ copurify कि mRNAs की पहचान सैकड़ों निकालता है. हमारा काम mRNAs कोडित प्रोटीन की कार्रवाई की साइट के लिए स्थानीय कर रहे हैं कि इस विचार का समर्थन microtubule, स्थानीय mRNAs का बहुमत पिंजरे का बँटवारा के नियंत्रण में है कि समारोह प्रोटीन सांकेतिक शब्दों में पता चला है कि. इसके अलावा, जैव रासायनिक शुद्धि से एक subcellular अंश में mRNA संवर्धन पता लगाने की क्षमता स्थानीयकृत mRNAs की पहचान के लिए इस दृष्टिकोण की शक्ति पर प्रकाश डाला गया.

अधिकांश स्थानीय RNAs के अपने अंतिम गंतव्य के लिए 10 से परिवहन को प्राप्त करने के लिए, actin या सूक्ष्मनलिकाएं, cytoskeleton पर सक्रिय परिवहन का उपयोग करें. यह cytoskeletal प्रक्रियाओं पुनरावृत्ति कर सकते हैं कि इन विट्रो प्रणाली में एक है करने के लिए आवश्यक है एक जैव रासायनिक दृष्टिकोण का उपयोग कर विशिष्ट स्थलों के लिए स्थानीय कर रहे हैं कि RNAs की हद और प्रकार का एक बेहतर समझ हासिल करने के लिए. Cytoskeletal जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए प्रमुख प्रणालियों में से एक उत्पादित अंडे अर्क हैमेंढक Xenopus laevis. एक्स से unfertilized अंडे से laevis अंडे अर्क cytoskeletal प्रक्रियाओं की एक व्यापक व्यवस्था का अध्ययन करने के लिए दशकों से इस्तेमाल किया गया है और cytoskeletal विधानसभा और गतिशीलता 11 कि नियंत्रण तंत्र और अणुओं के बारे में हमारी समझ के लिए बहुत योगदान दिया है. इसके अलावा, एक्स laevis अंडे अर्क सूक्ष्मनलिकाएं और जुड़े प्रोटीन 12,13 की बड़े पैमाने पर purifications के लिए उत्तरदायी हैं और अंडा अर्क 14-16 के विभिन्न प्रकार के उत्पादन के लिए अच्छी तरह से डिजाइन तरीके हैं. हालांकि, जीनोमिक अध्ययन के लिए एक्स का उपयोग करने के लिए कई कमियां हैं एक मॉडल प्रणाली के रूप laevis.

दशकों के लिए Xenopus laevis मेंढ़क बड़े oocyte के आकार और मजबूत बाहरी विकास 17 के कारण विकास और कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली से किया गया है. इसके अलावा, कई सेलुलर processe पुनरावृत्ति कर सकते हैं कि अंडा निकालने प्रणालियों का विकासएक टेस्ट ट्यूब में इस मेंढक एक शक्तिशाली प्रायोगिक मॉडल बना दिया है. हालांकि, Xenopus laevis genome.In विपरीत की allotetraploid प्रकृति द्वारा धीमा कर दिया गया है जो एक पूरा जीनोम अनुक्रम, की कमी के द्वारा बाधा उत्पन्न किया गया है, एक निकट से संबंधित प्रजातियों, Xenopus tropicalis, 2010 18 में अनुक्रम निर्धारण किया गया था कि एक द्विगुणित जीनोम है. जबकि एक्स tropicalis एक्स के रूप में प्रयोगात्मक विनयशील नहीं है laevis 17 एक अनुक्रम जीनोम की उपलब्धता यह जीनोम विस्तृत विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल प्रणाली बनाता है.

इस रिपोर्ट में हम एक्स से अर्धसूत्रीविभाजन द्वितीय, cytostatic कारक गिरफ्तार अर्क (सीएसएफ) बनाने के लिए एक विधि का वर्णन tropicalis 19. हम तो इस निकालने से सूक्ष्मनलिकाएं और संबद्ध RNAs के शुद्ध करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन है. RNAs के तो हाल ही में विकसित उच्च throughput अनुक्रमण प्रौद्योगिकी का उपयोग कर अनुक्रमण करने के लिए उत्तरदायी पुस्तकालयों में परिवर्तित किया जा सकता है. पुस्तकालयों एक बारवे कुल निकालने की तुलना में microtubule के नमूने में समृद्ध कर रहे हैं कि विशिष्ट mRNAs की पहचान के लिए मेंढक के जीनोम के लिए गठबंधन किया जा सकता है अनुक्रम निर्धारण कर रहे हैं. यह एक जीनोम व्यापक पैमाने पर सूक्ष्मनलिका लक्षित mRNA के स्थानीयकरण का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है. स्थानीय mRNAs का पता लगाने के लिए सक्षम होने के अलावा, उच्च throughput अनुक्रमण और एक अनुक्रम जीनोम का उपयोग सार्वजनिक डेटाबेस एनोटेशन में वर्तमान में मौजूद नहीं हैं कि उपन्यास टेप की खोज की संभावना प्रदान करते हैं.

Protocol

1. एक्स tropicalis अंडे की पीढ़ी

सभी Xenopus tropicalis मेंढ़क NASCO से आदेश दिए हैं. हमारे मेंढ़क recirculating पानी की व्यवस्था 27 पर रखा एक जलीय निवास में रखे जाते हैं डिग्री सेल्सियस एक्स की देखभाल के लिए पानी की व्यवस्था के लिए कई विकल्प हैं tropicalis. इस मेंढक प्रजाति पर कुछ अच्छा सामान्य जानकारी (Harland और Grainger प्रयोगशालाओं की वेब साइटों पर पाया जा सकता है http://tropicalis.berkeley.edu/home/ , http://www.faculty.virginia.edu/xtropicalis / ). हमारे मेंढ़क (0.4 ग्राम Ciclid झील साल्ट, 0.6 ग्राम समुद्री नमक, पानी, पीएच 7.0 लीटर प्रति 0.625 ग्राम 3 NaHCO) 20 से मिलकर tankwater में रखा जाता है. एक्स के लिए एक उच्च लवणता है जो ~ 1800 μS की चालकता, में यह नुस्खा परिणाम tropicalis. हालांकि, हम अपने मेंढ़क थी में कामयाब होना पाया है किपर्यावरण और oocyte गुणवत्ता में सुधार हुआ है. वैकल्पिक tankwater व्यंजनों सामान्य एक्स के लिए सूचीबद्ध संसाधनों पर ऊपर पाया जा सकता है tropicalis देखभाल.

  1. मेंढक के अंडे बिछाने प्रोत्साहित करने के लिए लगातार तीन दिनों पर मानव chorionic gonadotropin (एचसीजी) इंजेक्शन के साथ कर रहे हैं: पहला, एचसीजी समाधान के दो सांद्रता तैयार करते हैं. 1,000 यू / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 10 मिलीलीटर बाँझ, विआयनीकृत एच 2 ओ में lyophilized एचसीजी पाउडर की resuspend 10,000 यू. फिर, 100 यू / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 9 मिलीलीटर एच 2 ओ में 1,000 यू / एमएल एचसीजी समाधान के 1 मिलीलीटर पतला. 4 डिग्री सेल्सियस पर दोनों के समाधान की दुकान
  2. 1 दिन, 2:00-3:00 के बीच एचसीजी के साथ इंजेक्शन लगाने के द्वारा अंडे बिछाने के लिए 4-6 मेंढ़क तैयार करते हैं. 0.2 मिलीलीटर 100 यू / एमएल एचसीजी समाधान के साथ गंदा नाला के पास पृष्ठीय लिम्फ थैली में प्रत्येक मेंढक इंजेक्षन. बाद के दो इंजेक्शन दौरान मेंढ़क तेजी से बीत रहा है अंडे बिछाने के दौरान मेंढक कचरे की मात्रा को कम करने, लेकिन वैकल्पिक है जाएगा.
  3. 2 दिन, एक ही मेंढ़क इंजेक्षन2:00-3:00 के बीच 0.2 मिलीलीटर 100 यू / एमएल एचसीजी समाधान के साथ.
  4. 3 दिन, AM 7:00-10:00 के बीच, 0.2 मिलीलीटर 1,000 यू / एमएल एचसीजी समाधान के साथ ही मेंढ़कों इंजेक्षन. ताजा tankwater साथ एक 6 चौथाई गेलन प्लास्टिक की बाल्टी को भरने, 25 पर अंधेरे में मेंढ़क और जगह जोड़ने डिग्री सेल्सियस: अंडे देना मेंढ़क सेट करें इस इंजेक्शन के बाद, अंडे बिछाने के 4 घंटे के बाद शुरू हो जाएगा और 7 घंटा तक पूरा हो जाएगा. मेंढक 25 की एक न्यूनतम पर बनाए रखा है कि एक वातावरण में अंडे डिग्री सेल्सियस रखना चाहिए
  5. समाधान निकालने और अंडे इकट्ठा करने से पहले तुरंत तैयार उपकरण है बनाओ.

20X एमएमआर: 100 मिमी HEPES, पीएच 7.8, 2 मिमी EDTA पीएच 7.8, 2 एम NaCl, KCl, 40 मिमी, 20 मिमी 2 MgCl, 40 मिमी 2 CaCl. कमरे के तापमान पर आटोक्लेव और दुकान. तैयारी को निकालने के लिए सिर्फ पूर्व 1X एमएमआर का 1 एल तैयार.

10X XB: 100 मिमी HEPES, pH7.7, 10 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी 2 CaCl, 1 एम KCl, 500 मिमी sucrose. 4 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव और दुकान 1X XB जम्मू के 1 एल तैयारतैयारी निकालने से पहले उस्त. Dejelly समाधान: 10 एन NaOH के साथ 7.8-8.0 विआयनीकृत एच 2 हे और पीएच में 250 मिलीलीटर 3% सिस्टीन समाधान तैयार है. तैयारी को निकालने के लिए बस से पहले तैयार करो.

सीएसएफ-XB: 1X XB के 200 मिलीलीटर ले और 2 मिलीलीटर 0.5 एम EGTA पीएच 7.7 और 200 μl 1 एम 2 MgCl जोड़ें. तैयारी को निकालने के लिए बस से पहले तैयार करो.

सीएसएफ-XB + सीएसएफ-XB की 50 मिलीलीटर ले और LPC के 50 μl (10 मिलीग्राम / एमएल प्रत्येक Leupeptin, Pepstatin के शेयर, और DMSO में Chymostatin) जोड़ें. 50 μl Cytochalasin डी (DMSO में 10 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें. तैयारी को निकालने के लिए बस से पहले तैयार करो.

बाँझ भंग करने और फिल्टर करने के लिए विआयनीकृत एच 2 ओ, माइक्रोवेव में एक 0.2% जिलेटिन समाधान तैयार है. कमरे के तापमान पर स्टोर.

रिजर्व 2 बैकमैन 2 एक्स आधा इंच ultracentrifuge ट्यूबों.

तकिया प्रत्येक में 2 एच ओ के 0.5 मिलीलीटर के साथ दो 15 मिलीलीटर गिलास दौर तली अपकेंद्रित्र ट्यूबों तैयारट्यूब ultracentrifuge.

आग पॉलिश कांच पाश्चर pipettes करें. एक व्यापक खोलने का पर्दाफाश करने के लिए 5 ¾ इंच कांच pipettes के अंत बंद स्नैप, और नई उजागर पिपेट टिप सुचारू करने के लिए लौ को बेनकाब.

  1. कोट बीकर की दीवारों के लिए चारों ओर एक 0.2% जिलेटिन समाधान घूमता द्वारा अंडे के भंडारण के लिए एक 500 मिलीलीटर कांच बीकर तैयार. उपयोग के बाद बीकर से जिलेटिन समाधान त्यागें.
  2. 3 दिन पर तीसरे इंजेक्शन के बाद 6-7 घंटे बिछाने के लिए इस्तेमाल प्लास्टिक की बाल्टी से अंडे ले लीजिए. अगर वांछित, धीरे से किसी भी शेष अंडे पाने के लिए एक बार एक मेंढक निचोड़. ताजा tankwater और 0.2% जिलेटिन समाधान के साथ लेपित 500 मिलीग्राम गिलास बीकर को हस्तांतरण के साथ एक बार अंडे धो लें.

2. एक्स से निकालने की तैयारी tropicalis अंडे

निकालने की तैयारी के सभी चरणों का लगभग 25 डिग्री सेल्सियस, कमरे के तापमान पर किया जा सकता है Washes के दौरान, यह अंडे रखने के लिए महत्वपूर्ण हैवे गीला रहने के लिए इतना है कि एस तरल तहत जलमग्न. हवा के संपर्क में अंडे सेल चक्र गिरफ्तारी से बचने या lyse करने के लिए पैदा कर सकता है.

  1. अंडे गीला रखने के लिए पर्याप्त तरल आरक्षित है, जबकि संभव के रूप में ज्यादा tankwater रूप छानना. पक्ष को अंडे युक्त बीकर झुकाएँ और बीकर की दीवार को धीरे ~ 300 मिलीलीटर 1X एमएमआर जोड़ने, अंडे की ताकि शारीरिक आंदोलन के कम से कम है. तैरनेवाला युक्त मलबे से दूर तो छानना, अंडे व्यवस्थित करते हैं. एक्स tropicalis अंडे इस कदम पर चिपचिपा हैं, तो सक्रिय अंडे को हटाने dejellying के बाद किया जाता है. तीन 1X एमएमआर washes के एक कुल के लिए दोहराएँ.
  2. Dejelly अंडे. Dejelly समाधान के संभावित और जोड़ आधे के रूप में ज्यादा एमएमआर के रूप में बंद छानना. लगभग 5 मिनट के लिए लगातार भंवर. जेली कोट भंग मिनट के एक जोड़े के बाद सतह पर तैरनेवाला में दिखाई जाएगी. बंद छानना और शेष dejelly समाधान जोड़ने. अंडे बहुत कसकर पैक लगातार तक चक्कर आने के लिए जारी है और उनके वनस्पति पोल (साथ सभी पूरबी पोलसफेद रंग के साथ) पकवान के नीचे की ओर. जल्दी संभव के रूप में ज्यादा dejelly समाधान के रूप में बंद छानना. अंडे dejellied कर रहे हैं एक बार वे यांत्रिक जोड़तोड़ के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं.
  3. ध्यान से अंडे को XB जोड़ें. पहले XB धोने में lysed, झोंके, सफेद, और pseudocleavage अंडे को हटाने के द्वारा सीएसएफ गिरफ्तारी से बच गई है कि अंडे को हटा दें. सक्रिय एक्स tropicalis अंडे शीर्ष केंद्र में व्यवस्थित करते हैं, इसलिए इन बाहर खींचने के लिए एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग करें. इसके अलावा त्वचा और मेंढक कचरे के टुकड़े को हटा दें. धीरे washes के बीच अंडे घूमता और उन्हें बीकर के तल पर व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देता है, ~ 300 मिलीलीटर 1X XB समाधान के साथ अंडे तीन बार की कुल धो लें. बहुत संभव के रूप में प्रत्येक धोने के समाधान के अंडे गीला रखते हुए के रूप में पहले के रूप में, छानना.
  4. सीएसएफ-XB और छानना साथ दो बार अंडे धो लें.
  5. सीएसएफ-XB जोड़ें + अंडे को. ई पर्दाफाश करने के लिए नहीं ख्याल रख रही है, एक जिलेटिन इलाज आग पॉलिश पाश्चर पिपेट, सीएसएफ-XB + के साथ स्थानांतरण अंडे अल्ट्रा अपकेंद्रित्र ट्यूबों का प्रयोगहवा के GGS. पानी तकिया के साथ 15 मिलीलीटर गिलास अपकेंद्रित्र ट्यूबों के अंदर रखें.
  6. 1 मिनट के लिए 200 XG पर एक नैदानिक ​​अपकेंद्रित्र में अंडे स्पिन, 30 सेकंड के लिए 800 XG और स्पिन की गति को बढ़ाने.
  7. अंडे से जितना संभव हो उतना बफर दूर करने के लिए एक Aspirator का प्रयोग करें. वे शीर्ष पर लगभग सूखा होना चाहिए. जल्दी से एक एचबी-6 रोटर (या समतुल्य) के साथ सुसज्जित एक Sorvall आर सी -6 अपकेंद्रित्र को अंडे ले जाने और 20 पर 15 मिनट के लिए 17,000 XG स्पिन डिग्री सेल्सियस
  8. एक 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी एक 18 गेज सुई का उपयोग वर्णक और लिपिड परतों के बीच पीले साइटोप्लाज्मिक परत निकालें. पंचर ट्यूब के पक्ष और धीरे साइटोप्लाज्मिक निकालने परत प्राप्त करने के लिए सिरिंज बैरल खींच. वर्णक दाने जितना संभव हो सके बचें.
  9. नई ultracentrifugation ट्यूब के cytoplasm स्थानांतरण. निकालने के इस कदम पर थोड़ा बादल प्रकट करने के लिए यह सामान्य बात है. 15 मिलीलीटर गिलास अपकेंद्रित्र ट्यूब पानी तकिया के साथ अंदर रखें. 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए फिर से 17,000 XG स्पिन एक्सटेंशन दोहराएँ18 गेज सुई के साथ raction.
  10. एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब कोशिका द्रव्य स्थानांतरण. निकालने की मात्रा का अनुमान लगाने और निकालने में Cytochalasin डी और LPC 1:1,000 पतला. , एक 1 मिलीलीटर विंदुक टिप के साथ अच्छी तरह से मिलाएं हवाई बुलबुले की शुरूआत के बिना कई बार ऊपर नीचे pipetting और. एक स्वस्थ मेंढक कॉलोनी से एक ठेठ उपज निकालने / मेंढक की लगभग 300-500 μl है. अधिकतम गतिविधि को बनाए रखने के लिए, इसे निकालने की दुकान है और कमरे के तापमान पर प्रयोगात्मक जोड़तोड़ (20-25 डिग्री सेल्सियस) प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है.

3. एक्स से शोधन Taxol स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं tropicalis निकालें

  1. 10 माइक्रोन का एक अंतिम एकाग्रता में निकालने के एक 100-200 μl विभाज्य Taxol जोड़ें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. नियंत्रण प्रतिक्रियाओं के लिए microtubule, destablilzing दवा Nocodazole (10 माइक्रोन) के साथ निकालने के एक बराबर मात्रा का इलाज. विश्लेषण के लिए अनुपचारित निकालने रिजर्व 100 μl.
  2. दवा का इलाज पतला10 संस्करणों BRB-80 (80 मिमी पाइप पीएच 6.8, 1 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी EGTA) + 30% ग्लिसरॉल के साथ निकाल सकते हैं. BRB-80 + 60% ग्लिसरॉल तकिया के 10 मिलीग्राम से युक्त 14 मिलीलीटर दौर नीचे polypropylene ट्यूब इकट्ठे. एक विस्तृत बोर पिपेट टिप, परत BRB-80 के ऊपर धीरे दवा का इलाज निकालने प्रतिक्रिया + 60% ग्लिसरॉल तकिया का उपयोग करना. 20 में 17,000 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र ° एक एचबी-6 रोटर (या समकक्ष) और ट्यूब एडाप्टर के साथ सुसज्जित एक Sorvall आर सी -6 अपकेंद्रित्र में सी.
  3. तैरनेवाला युक्त unsedimented निकालने सामग्री महाप्राण, और विआयनीकृत एच 2 ओ के साथ दो बार इंटरफेस धोना सूक्ष्मनलिकाएं, microtubule जुड़े प्रोटीन, और Taxol के इलाज के नमूने में microtubule जुड़े आरएनए युक्त जेल की तरह गोली परेशान नहीं ख्याल रख रही है, धीरे धीरे शेष तकिया मात्रा महाप्राण. Nocodazole का इलाज नमूना दिखाई सामग्री शामिल नहीं है. 1 मिलीलीटर TRIzol में गोली Resuspend और शाही सेना को अलग करने के लिए निर्माता के निर्देशों के साथ आगे बढ़ना. Untreated निकालने (100 μl) 1 मिलीलीटर TRIzol में सीधे resuspended किया जा सकता है.
  4. आरएनए seq के लिए उपयुक्त transcriptome पुस्तकालयों की तैयारी के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट अब कर रहे हैं. इन के माध्यम से खरीदा जा सकता है http://www.illumina.com/ और http://www.454.com/ .

Representative Results

एक्स की पहचान करने के लिए सूक्ष्मनलिकाएं साथ जुड़े tropicalis टेप, हम अर्धसूत्रीविभाजन II (सीएसएफ) के मेटाफ़ेज़ में गिरफ्तार unfertilized अंडे से एक साइटोसोलिक निकालने को तैयार है. Taxol के साथ इस निकालने का उपचार एक ग्लिसरॉल तकिया (चित्रा 1 ए) के माध्यम से अवसादन द्वारा शुद्ध किया जा सकता है कि स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं के गठन की अनुमति देता है. Coomassie जेल विश्लेषण α / β-ट्यूबिलिन एक taxol पर निर्भर ढंग से अवसादों, और प्रमुख प्रोटीन प्रजातियों का प्रतिनिधित्व करता है इन तैयारियों (चित्रा 1 बी) में बरामद पुष्टि की है कि. अन्य प्रोटीन के निचले स्तर को दर्शाता है, दवा nocodazole depolymerizing microtubule के साथ इलाज की तैयारी में भी taxol गोली में मौजूद हैं, लेकिन नहीं है कि सूक्ष्मनलिकाएं (एमएपीएस) के साथ विशेष रूप से सहयोगी taxol अंश में प्रोटीन.

एक Agilent Bioanalyzer सभी एक्स में सामान्य शाही सेना संरचना की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है tropicalis निकालने भिन्न (चित्रा 1C एक्स में सूक्ष्मनलिकाएं और स्पिंडल पर होता है कि पिछले निष्कर्षों के साथ संगत, सीएसएफ निकालने और microtubule युक्त taxol गोली में मौजूद हैं laevis अंडे 5,21 निकाल सकते हैं. जेल प्रक्षेपण का एक लाइन का पता लगाने mRNA के संकेत में स्पष्ट रूप से कम है का पता चलता है सूक्ष्मनलिका युक्त, यह दर्शाता 28S rRNA के ऊपर क्षेत्र पलायन में सबसे विशेष रूप से taxol गोली, कि एक्स में सूक्ष्मनलिकाएं साथ mRNAs cosediment की एक सबसेट tropicalis. इस तरह से अलग शाही सेना व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग आरएनए seq के प्रयोगों के लिए उपयुक्त है.

चित्रा 1
चित्रा 1. आरएनए seq के लिए मीट्रिक टन शाही सेना के शोधन. मीट्रिक टन शाही सेना को अलग करने के लिए (ए) शुद्धीकरण योजना. अंडे महिला एक्स से काटा जाता है tropicalis मेंढ़कों. एक cytoplasmic निकालने की तैयारी के बाद, taxol सूक्ष्मनलिका polymerization के प्रेरित करने के लिए जोड़ा गया है. सूक्ष्मनलिकाएं और मीट्रिक टन शाही सेना के एक ग्लिसरॉल तकिया के माध्यम से अवसादन द्वारा शुद्ध कर रहे हैं. (ए) में वर्णित योजना का उपयोग कर अलग प्रोटीन का (बी) Coomassie जेल विश्लेषण. कुल सीएसएफ taxol या nocodazole की उपस्थिति में sedimented प्रोटीन की तुलना निकालने. (सी) शाही सेना के Bioanalyzer जेल विश्लेषण (ए) में वर्णित योजना का उपयोग कर अलग किया. सीएसएफ से शाही सेना पृथक taxol या nocodazole की उपस्थिति में sedimented शाही सेना की तुलना में निकाल सकते हैं. जेल प्रक्षेपण और लाइन निशान दोनों दिखाए जाते हैं. तीव्र, एट अल., (2011) से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Discussion

इस रिपोर्ट में हम एक्स से सीएसएफ से गिरफ्तार अंडा अर्क का उत्पादन करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन किया है tropicalis 19 और microtubule जुड़े RNAs के 7 अध्ययन करने के लिए इस उद्धरण का उपयोग करें. एक्स से सीएसएफ से गिरफ्तार अंडा अर्क के उत्पादन के लिए बुनियादी प्रक्रिया एक्स के लिए उपयोग के रूप में tropicalis एक ही है कुछ महत्वपूर्ण अंतर के साथ laevis. एक्स के साथ काम करने के लिए सबसे चुनौतीपूर्ण पहलुओं में से एक tropicalis मेंढ़क एक्स के लिए तुलनीय सूक्ष्मनलिका न्यूक्लिएशन या धुरा विधानसभा गतिविधि के साथ एक उद्धरण बनाने के लिए पर्याप्त उच्च गुणवत्ता वाले अंडे प्राप्त है laevis अंडे निकालता है. अर्धसूत्रीविभाजन II सेल चक्र गिरफ्तारी, एक्स के लिए हार्मोन इंजेक्शन के बीच अंतराल से फिसलन को रोकने जबकि इष्टतम अंडा बिछाने की स्थिति को प्राप्त करने के लिए tropicalis एक्स के लिए प्रयोग किया जाता है कि तुलना में कम है laevis, और अंडे बिछाने की शुरुआत करने के लिए तीसरे एचसीजी इंजेक्शन से समय भी बहुत कम है. एक्स के साथ एचसीजी इंजेक्शन से टी के लिए समय laevisवह अंडा बिछाने की शुरुआत यह बफर में रात भर रखे जाने वाले अंडे के लिए सुविधाजनक और कुशल है कि इस तरह की है. हालांकि, क्योंकि एचसीजी इंजेक्शन और अंडे के बीच कम समय की एक्स के साथ बिछाने यह अक्सर मैन्युअल मेंढ़क से अंडे व्यक्त करने के लिए आवश्यक है tropicalis. दो अलग मेंढ़क से अंडे निकालने बनाने के बीच एक और महत्वपूर्ण अंतर dejellying कदम है. एक्स के साथ अंडे laevis यह जेली कोट अंडे बीकर में स्थान दिया गया है कि कैसे बारीकी से देख द्वारा भंग कर दिया है जब यह निर्धारित करने के लिए आसान है कि इतने बड़े हैं. Dejellying प्रतिक्रिया शुरू के रूप में, अंडे और अधिक घनी पैक करने के लिए शुरू करते हैं. हालांकि, एक्स tropicalis अंडे बहुत छोटे होते हैं और यह जेली कोट अकेले घनत्व पैकिंग अंडे से भंग कर दिया है जब यह निर्धारित करने के लिए काफी मुश्किल हो सकता है. हम जेली कोट भंग कर दिया है जब यह निर्धारित करने के लिए सबसे विश्वसनीय तरीका जानवर (काला) और वनस्पति (सफेद) के डंडे के उन्मुखीकरण पर नजर रखने के लिए है कि मिल गया है. जब सभी वनस्पति डंडे मूलबीकर के नीचे की ओर ईएनटी जेली कोट निकालने के साथ आगे बढ़ने के लिए पर्याप्त हटा दिया गया है. अंत में, जबकि एक्स laevis अंडे निकालने ठंडे तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है (4-12 डिग्री सेल्सियस) हम यह एक्स बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है कि मनाया तैयारी और प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के दौरान कमरे के तापमान पर tropicalis अंडा निकालने (20-25 डिग्री सेल्सियस) जैव रासायनिक गतिविधि को बनाए रखने के लिए. क्योंकि उपयोग में आसानी में मतभेद की हम एक्स का उपयोग करना पसंद करते हैं अंडा निकालने के उत्पादन के लिए laevis मेंढ़कों. हालांकि, की आवश्यकता होती है या एक अनुक्रम जीनोम, एक्स के साथ एक जीव से मदद कर रहे हैं कि प्रयोगों के लिए tropicalis एक उत्कृष्ट वैकल्पिक व्यवस्था है.

हम इस रिपोर्ट में वर्णित है कि विधि सूक्ष्मनलिका polymerization के प्रेरित करने के लिए एक microtubule स्थिर एजेंट के रूप में taxol का उपयोग करता है. Taxol सूक्ष्मनलिकाएं शुद्ध के बड़े पैमाने पर अलगाव की सुविधा है कि एक मजबूत सूक्ष्मनलिका स्थिर एजेंट है क्योंकि हम यह तरीका चुना. विधि वेंहम वर्णित में संभावना वैकल्पिक सूक्ष्मनलिका polymerization के तरीकों का उपयोग कर सूक्ष्मनलिकाएं के साथ जुड़े प्रोटीन और आरएनए की तुलना द्वारा सुधार किया जा सकता है. वैकल्पिक जीटीपी प्रेरित polymerization (एक क्लासिक तकनीक), 22 या क्रोमेटिन संचालित धुरा विधानसभा 23 से प्रेरित सूक्ष्मनलिकाएं की नकल के लिए एक microtubule polymerizer रूप भागा जीटीपी का उपयोग कर का उपयोग कर polymerization के शामिल हो सकते हैं. अंत में, microtubule polymerization के करीबी बँटवारा (तारककाय, क्रोमेटिन, और kinetochore मध्यस्थता) के दौरान nucleated रहे हैं कि सूक्ष्मनलिकाएं के प्रकार के लिए नकल होगा प्रेरित करने के लिए शुक्राणु नाभिक शुद्ध का उपयोग करें. सूक्ष्मनलिका न्यूक्लिएशन के इन वैकल्पिक स्रोतों को कमियां nucleating एजेंट taxol के रूप में के रूप में आसानी से उपलब्ध नहीं हो रहे हैं और वे नाभिक या नहीं के रूप में कुशलतापूर्वक taxol के रूप में सूक्ष्मनलिकाएं को स्थिर. इसलिए, इन तरीकों में से प्रत्येक बड़े पैमाने पर purifications के लिए उपयोग करने के लिए और अधिक कठिन हो जाएगा. सूक्ष्मनलिका nucleators के कई अलग अलग प्रकार की तुलना का लाभयह प्रोटीन और / या सूक्ष्मनलिका न्यूक्लिएशन के प्रत्येक मार्ग के लिए विशिष्ट हैं RNAs कि पहचान संभव हो सकता है.

हम यहाँ वर्णन किया है कि विधि उभयचर के cytoplasmic अर्क का फायदा उठाते हैं. हालांकि, इस दृष्टिकोण अन्य जीवों से निकालने प्रणाली का उपयोग करने के लिए बढ़ाया जा सकता है. Mitotic अर्क ईमानदारी सूक्ष्मनलिका विधानसभा के कई पहलुओं पुनरावृत्ति कि सिंक्रनाइज़ मानव ऊतक संस्कृति कोशिकाओं 24 से वर्णित किया गया है. हम सफलतापूर्वक HELA कोशिकाओं 5 से microtubule जुड़े RNAs की पहचान करने के लिए इन निष्कर्षों का इस्तेमाल किया है. सूक्ष्मनलिका जुड़े RNAs जांच नहीं किया गया है, हालांकि इसी तरह के सूक्ष्मनलिका शुद्धि योजनाओं, कई अलग अलग जीवों 25,26 के लिए वर्णित किया गया है. यहाँ वर्णित दृष्टिकोण सूक्ष्मनलिकाएं nucleating में सक्षम एक केंद्रित साइटोप्लाज्मिक निकालने का निर्माण कर सकते हैं कि किसी भी जीव के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.

अंत में, यद्यपि कि हम डी दृष्टिकोणयहां मुंशी सूक्ष्मनलिकाएं और जुड़े प्रोटीन और RNAs के शुद्धिकरण की चर्चा है, इस दृष्टिकोण अन्य subcellular संरचनाओं का सामान्यीकरण नहीं किया जा सकता है. सबसे स्थानीयकृत mRNAs के जैव रासायनिक तरीकों का उपयोग पहचान नहीं किया गया जबकि डीएनए और आरएनए अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों में हाल के अग्रिमों के इस दृष्टिकोण स्थानीयकृत RNAs की पहचान करने के लिए एक आकर्षक विधि बनाते हैं. इस दृष्टिकोण में रुचि के किसी भी subcellular या उप भ्रूण संरचना अलग या शुद्ध किया जा सकता है. फिर जुड़े प्रोटीन और आरएनए एक जीनोम व्यापक पैमाने पर पहचाना जा सकता है. RNAs तो कुल सेल या समृद्ध स्थानीय RNAs की पहचान करने के लिए भ्रूण की शाही सेना सामग्री की तुलना में किया जा सकता है. यह दृष्टिकोण पूरी (Xenopus 27 में पहली बार स्थानीय RNAs के पहचान की है कि दृष्टिकोण के लिए इसी तरह के पशु और वनस्पति जुदाई), अंडे, एक्टिन जुड़े RNAs, ईआर जुड़े RNAs, माइटोकॉन्ड्रिया जुड़े RNAs के साथ या कर सकते हैं कि किसी भी subcellular संरचना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है बरकरार जुड़े RNAs के साथ शुद्ध हो. के आधार परmicrotubule जुड़े शाही सेना पर हमारे काम हम इस किसी स्थान पर नए प्रोटीन है कि समारोह की खोज के लिए एक शानदार तरीका होगा कि अनुमान है. इसके अलावा, सभी स्थानीय RNAs के स्थान और सीमा की पहचान कोशिकाओं और भ्रूण जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए mRNA के स्थानीयकरण उपयोग में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Xenopus tropicalis NASCO LM00823MX
human Chorionic Gonadotropin Sigma-Aldrich CG10
HEPES Sigma-Aldrich H4034
EDTA Sigma-Aldrich E5134
NaCl Sigma-Aldrich S3014
KCl Sigma-Aldrich P9541
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
CaCl2 Sigma-Aldrich C8106
sucrose Sigma-Aldrich S0389
NaOH Sigma-Aldrich S5881
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Leupeptin Sigma-Aldrich L9783
Pepstatin Sigma-Aldrich P5318
Chymostatin Sigma-Aldrich C7268
Cytochalasin D Sigma-Aldrich C8273
Gelatin, porcine skin Sigma-Aldrich G1890
PIPES Sigma-Aldrich P6757
Taxol Sigma-Aldrich T7191
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404
Trizol Invitrogen 15596-026
L-Cysteine, free base USB Corporation 14030
Cichlid Lake Salt Seachem 47894
Marine salt Seachem SC7111
NaHCO3 Sigma-Aldrich S6014
EQUIPMENT
1 ml syringes BD Biosciences 309659
18 gauge needles BD Biosciences 305195
30 gauge needles BD Biosciences 305106
Rubbermaid Plastic bucket Amazon 6306
Beckman Polyallomer 2 x ½ inch Ultracentrifuge tubes Beckman 326819
15 ml round-bottomed glass centrifuge tubes Fisher Scientific 45500-15
Rubber adapter sleeves for 15 ml tubes Kimble-Chase 45550-15
5 ¾ inch glass Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20A
14 ml polypropylene round-bottom tube BD Biosciences 352059
Sorvall HB-6 rotor Thermo Scientific 11860
Sorvall RC-6 centrifuge Thermo Scientific 46910

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References

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