A

Published 5/17/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

نحن تصف أساليب لدراسة جوانب amylopathies في الدودة

Cite this Article

Copy Citation

Duan, Z., Sesti, F. A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study. J. Vis. Exp. (75), e50435, doi:10.3791/50435 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Amylopathy هو المصطلح الذي يصف تركيب غير طبيعي وتراكم اميلويد بيتا (Aβ) في الأنسجة مع مرور الوقت. Aβ هو السمة المميزة لمرض الزهايمر (AD)، ويوجد في الجسم ليوي الخرف، إدراج التهاب العضل في الجسم واعتلال الأوعية الدماغية اميلويد 1-4. Amylopathies تطوير تدريجيا مع مرور الوقت. لهذا السبب الكائنات بسيطة مع أعمار قصيرة قد يساعد في توضيح الجوانب الجزيئية لهذه الشروط. هنا، نحن تصف البروتوكولات التجريبية لدراسة تنكس عصبي Aβ بوساطة استخدام انواع معينة ايليجانس دودة. وهكذا، ونحن بناء الديدان المعدلة وراثيا عن طريق حقن الحمض النووي الترميز Aβ الإنسان 42 إلى الغدد التناسلية المخلوي من المنحرفين الكبار. واستقرت خطوط المحولة من قبل التكامل الطفرات التي يسببها. الديدان الخيطية هي سن متزامنة من خلال جمع وبذر بيضها. يتم اختبار وظيفة الخلايا العصبية معربا عن Aβ 42 في المقايسات السلوكية المناسب (الكيميائي مقايسةق). وتستخدم الثقافات العصبية الأولية التي تم الحصول عليها من الأجنة لاستكمال البيانات السلوكية واختبار آثار اعصاب من المركبات المضادة للأفكارك.

Introduction

بيتا اميلويد (Aβ) هي الببتيد من 36-43 الأحماض الأمينية التي يتم تشكيلها بعد انشقاق متتابعة من البروتين اميلويد السلائف (APP) بواسطة β γ وsecretases 1. يعالج secretase γ نهاية C-محطة من الببتيد Aβ، وهي مسؤولة عن أطوال متغير ل 5. الأشكال الأكثر شيوعا من Aβ هي Aβ 40 و 42 Aβ، وهذا الأخير مرتبطا أكثر شيوعا لظروف مرضية مثل 5 م. بتركيزات عالية Aβ شكل β-الأوراق التي تتجمع لتشكيل الألياف اميلويد 6. الودائع الألياف هي المكون الرئيسي لويحات خرف المحيطة الخلايا العصبية. ويعتقد أن كلا ويحات وإنتشاري، الأوليغومرات Aβ غير لوحة، لتشكل أشكال المسببة للأمراض الكامنة وراء Aβ.

معقد دراسة مختبرية من amylopathies العصبية من حقيقة أن هذه الشروط التقدم مع مرور الوقت. وبالتالي، فمن مهمر لتطوير الحيوانية لين العريكة وراثيا نماذج تكميلية لالفئران مع قصيرة العمر. هذه النماذج يمكن استخدامها لتوضيح جوانب محددة من amylopathies-عادة الخلوية والجزيئية وبحكم بساطتها، وتساعد على التقاط جوهر المشكلة. الدودة انواع معينة ايليجانس السقوط هو هذه الفئة. لديها فترة حياة قصيرة، ~ 20 يوما وبالإضافة العمليات الخلوية الأساسية بما في ذلك تنظيم التعبير الجيني، والاتجار البروتين، والربط العصبية synaptogenesis، و، إشارة الخلية، والموت تشبه الثدييات 7. ميزات فريدة من الدودة تشمل الوراثة قوية وعدم وجود نظام السفينة، والتي تمكن لدراسة الأضرار العصبية بشكل مستقل عن تلف الأوعية الدموية. من ناحية أخرى، فإن عدم وجود الدماغ يحد من استخدام C. ايليجانس لدراسة جوانب كثيرة من التنكس العصبي. وبالإضافة إلى ذلك، لا يمكن استنساخ وتحديد التوزيعات التشريحية للآفات أن يؤديها في هذا الحي. الحد الأخرىوتشمل ations صعوبة تقييم كل الاختلافات في ملامح التعبير الجيني وضعف السلوك معقدة وظيفة الذاكرة. نحن هنا وصف الطرق لتوليد C. ايليجانس نماذج من amylopathies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. بناء الديدان المعدلة وراثيا

  1. التحول.
    1. إعداد منصات حقن. وضع قطرة من الملفات الساخنة، 2٪ الاغاروز المذاب في الماء، على ساترة الزجاج. وضع بسرعة ساترة الثاني على انخفاض وبخفة ذلك. بعد عززت agarose، coverslips على الشرائح على حدة، وخبز وسادة ساترة في فرن فراغ في 80 درجة CO / N.
    2. سحب الماصات. نستخدم سوتر P-97 ساحبة لسحب 1/0.5 مم OD / ID البورسليكات الشعيرات الدموية مع خيوط. هي مزورة ماصات مع طرف المغلقة التي مكسورة مفتوحة في مرحلة لاحقة.
    3. إعداد حقن المزيج. جعل الخليط الحقن التي تحتوي على الحمض النووي من الفائدة (20 نانوغرام / ميكرولتر لكل بناء)، بالإضافة إلى الحمض النووي البلازميد فارغة إلى تركيز النهائي من 150 نانوغرام / ميكرولتر. أجهزة الطرد المركزي الخليط الحقن لإزالة أي ملوثات. هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية لأن الملوثات تقليل كفاءة التحول. نقل أعلى 5 ميكرولتر (الحطام وغيرها من الملوثات تتجمع في الجزء السفلي) إلى أنبوب جديد لبه المستخدمة في الحقن.
    4. تحميل حقن مزيج من قبل الشعرية. هي مغمورة الجزء السفلي من ماصة في مزيج الحقن. عادة 0.5 ميكرولتر كافية لحقن 100 الديدان.
    5. تحميل حقن ماصة. إدراج ماصة على حامل من مياداة مجهرية وكسرها مفتوحة عن طريق فرك طرفها ضد حافة الانزلاق الغطاء شنت على شريحة زجاجية أو بدلا من الحطام على لوحة الاغاروز. هذا هو خطوة حاسمة عن نصائح كبيرة من الضرر الدودة وانسداد بسهولة نصائح صغيرة جدا. نوعية من طرف مكسورة يمكن الحكم عليها من خلال الشكل والأهم من ذلك وفقا لمعدل التدفق. ويمكن تقييم معدل التدفق حسب حجم الفقاعات التي تتدفق من طرف المفتوحة مغمورة في قطرة من النفط 700 الهالوكربون استجابة لضغط الحقن.
    6. نقل الديدان لوحة الحقن. وضع قطرة من النفط 700 الهالوكربون على وسادة الحقن ونقل العديد من (1 أو 2 للمبتدئين) الديدان للزيت. استخدام دودة اختيار لدفع الديدان أسفل على وسادة حتىY التمسك الاغاروز. يجب أن تكون الديدان الموجهة في الصفوف مع الجانبين بطني تواجه نفس الاتجاه. تجنب لمس رأس الدودة. إذا بعد عدة محاولات يفشل الديدان على الانضمام إلى وسادة، مع استبدال لوحة جديدة أو زيادة سماكة الاغاروز و / أو تركيز.
    7. إدراج ماصة في دودة. عن طريق تحريك المرحلة، وضع دودة تحت ماصة. ضع ماصة في نواة مركزية من الغدد التناسلية بسبب السيتوبلازم لها يتم مشاركتها من قبل العديد من نوى الخلايا الجرثومية. وهذا يزيد من احتمال لتسليم الحمض النووي حقن لكثير من ذرية. ماصة يجب أن تقع موازية تقريبا لدودة (~ 15 درجة -25 درجة زاوية). دفع عموديا غيض من ماصة أسفل جسم الدودة حتى يتم الاكتئاب الجلد. ثم اضغط بلطف على مناور للحث على الإدراج غيض من. للحصول على أفضل النتائج على حد سواء حقن الغدد التناسلية.
    8. حقن محلول الحمض النووي. ممارسة الضغط على لماصة حتى تتضخم الغدد التناسلية. وقف تدفق وسحب دودة قبالة ماصة. اختبار إبرة لتدفق ومن ثم الانتقالإلى دودة المقبلة والخطوات حقن تكرار.
    9. استرداد الديدان: إضافة قطرة (~ 10 ميكرولتر) من العازلة الاسترداد على الديدان واحتضان حتى تبدأ الديدان السباحة. إضافة حجم مساو من M9، انتظر حتى الديدان استئناف السباحة وكرر عدة مرات حتى الحل هو في الغالب M9. نقل فردي الديدان لوحات المصنف.
  2. التكامل.
    1. ضع 40 صحي، تغذية جيدة، L4 الديدان في لوحة جديدة
    2. أشرق مع γ-ray مع 4،000 راد لمدة 40 دقيقة. نقل الديدان المشع (P0) في الطازجة، OP50 لوحات المصنف (4 الديدان / لوحة). ويمكن بدلا من ذلك للإشعاع الديدان مع جرعة من 300 ج / م 2 UVs و.
    3. نقل 10-20 transformants F1 من كل لوحة لوحات الفردية، وتسمية لوحات مع المقابلة P0 المنشأ.
    4. واحد من 2-4 transformants F2 لكل F1 لوحات منفصلة. تحقق من ذرية F3 لنقل 100٪ من علامة التحول. عادة، 1-3٪ من ذرية من فيل دودة المشعl له حدثا التكامل.
    5. جعل الأسهم من ثلاثة أو أكثر من الخطوط المحولة مستقلة.

2. فحوصات السلوكية

  1. العمر التزامن.
    1. تنمو الديدان في معيار 10 سم لوحات NGM + OP50 E. يتم التوصل حتى القولونية عدد كبير من السكان البالغين حامل (3-5 أيام).
    2. جمع الديدان في 50 مل أنابيب فالكون من قبل تعليقها في 1 مل M9 العازلة.
    3. إضافة 5 مل M9 العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 3 دقائق. تجاهل طاف. كرر 3-4X.
    4. في نهاية الطرد المركزي الماضي، إزالة طاف وإضافة 10 مجلدا من محلول هيبوكلوريت الأساسية (0.5 M هيدروكسيد الصوديوم، هيبوكلوريت 1٪ مختلطة طازجة) إلى مكعبات الديدان. في احتضان RT ل~ 10 دقيقة. رد فعل تحلل يمكن رصدها عن طريق وضع قطرة من رد فعل تحلل على ساترة ودراسة الديدان تحت المجهر. عندما يتم تقسيم حوالي 80٪ من الديدان يجب أن تتوقف على رد الفعل.
    5. وقف رد فعل تحلل من قبل الدينز نفس الحجم من العازلة بيضة معقمة.
    6. جمع البيض (والذبائح) بواسطة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 5 دقائق.
    7. غسل البيض مع العازلة بيضة معقمة 2-3X.
    8. احتضان البيض O / N في المخزن M9 والبذور منهم على لوحات NGM القياسية.
  2. الكيميائي الفحص.
    1. إعداد عدة قطع من أجار تقريبا 0.5x0.5x0.5 سم. نحن إيداع أجار في لوحة 10 سم ونقطع قطع أجار من هناك.
    2. نقع قطعة أجار في محلول يحتوي على جاذبة المطلوب (في تشبع، تركيزات شبه تشبع) لمدة 2 ساعة. جاذبة النموذجية هي يسين (0.5 M)، البيوتين (0.2 M).
    3. إيداع صك قطعة أجار في 10 سم لوحة الاختبار الذي تم وضع علامة على مكان وجود بقعة وبقعة اختبار التحكم (الشكل 1A). تسمح موازنة وتشكيل التدرج O / N (الشكل 1B). إعداد 5 لوحات لتجربة واحدة.
    4. قبل التجربة إضافة 10 ميكرولتر من 20 ملي نان 3 (anesthetic) إلى كل بقعة.
    5. وضع 20 الديدان متزامنة العمر في وسط اللوحة. وضع لوحة في الحاضنة عند 20 درجة مئوية.
    6. بعد 1 ساعة، والاعتماد على الحيوانات في الاختبار / مراقبة اماكن وحساب مؤشر الكيميائي، (CI) على النحو التالي: المعادلة 1 حيث N، N و N اختبار المركز الوطني للاستشعار.، تشير إلى العدد الكلي للحيوانات، وعدد من الحيوانات في بقعة الاختبار وعدد من الحيوانات في بقعة السيطرة.

3. زراعة الخلايا الأولية الجنينية

  1. ليز الديدان كما هو موضح في سن التزامن.
  2. وقف رد فعل تحلل وذلك بإضافة نفس الحجم من العازلة بيضة معقمة وأجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل بلطف طاف والحرص على عدم فقدان البيض مكعبات. كرر 2-3X أو حتى طاف هو واضح.
  3. Resuspend مكعبات البيض (والذبائح) في 2 مل العازلة بيضة معقمة وإضافة 2 مل من العقيمة السكروز 60٪ في المخزن البيض. خلط هذا الحل حتى يتم معلق البيض تماما (لأنها تميل إلى تشكيل كتل تحت الطرد المركزي) باليد أو قبل vortexing.
  4. الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 15 دقيقة.
  5. نقل بعناية طاف (يحتوي على بيض) إلى أنبوب العقيمة. تجاهل بيليه الذي يحتوي على الذبائح وغيرها من المنتجات من تحلل.
  6. إزالة السكروز المتبقية عن طريق إعادة التعليق على البيض في المخزن البيض والطرد المركزي في 450 x ج لمدة 5 دقائق. جمع بلطف وتجاهل طاف. كرر 3X.
  7. تحت غطاء محرك السيارة الصفحي resuspend البيض مكعبات في المخزن العقيمة التي تحتوي على البيض 1 U / مل كيتيناز في RT لهضم قشر البيض. بعد 30 دقيقة تبدأ في رصد رد فعل (تحت المجهر مقلوب خلية ثقافة). كل دفعة من كيتيناز لديه نشاط مختلفة قليلا. اكتمال عادة الهضم في 1 ساعة.
  8. عندما يتم هضم ما يقرب من 70-80٪ قشر البيض بواسطة كيتيناز إضافة CM-15 (L-15 خلية ثقافة ميدالبوتاسيوم التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني، 50 U / مل البنسلين، و 50 ميكروغرام / مل الستربتوميسين). فصل الخلايا باستخدام حقنة مع مقياس 27. تعليق تصفية الخلية مع 5.0 ميكرون فلتر لإزالة الأجنة سليمة، وكتل من الخلايا واليرقات.
  9. بيليه تعليق خلية فصلها بواسطة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 15 دقيقة. إزالة طاف و resuspend بيليه في CM-15 خلية ثقافة المتوسط.
  10. فصل الخلايا لوحة على غطاء زجاجي زلات المغلفة سابقا مع كتين الفول السوداني (0.1 ملغ / مل) الذائب في الماء ملاحظة: الخلايا يجب أن تلتزم الركيزة من أجل التفريق.
  11. يمكن الحفاظ على الخلايا في RT (16-20 درجة مئوية) في الهواء لمدة أكثر من 2 اسابيع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مع بروتوكولات لدينا دراسة آثار الإنسان Aβ 42 قليل وحدات في وظيفة الخلايا العصبية 8. وتتسع دائرة أي جزء ترميز Aβ الإنسان (42) وإشارة الببتيد الاصطناعي تسلسل الترميز من النار ناقلات pPD50.52 من بناء PCL12 9 باستخدام بادئات التي ادخلت سما 1 موقع نوكلياز داخلية التقييد في نهايات. ثم تم إدراج جزء في بناء تحتوي على 2،481-BP-6 FLP تسلسل المروج في ناقلات النار pPD95.75 بين فريد سما 1 موقع 10. باستخدام تقنيات التحول هو موضح في البروتوكول 1 اقمنا دودة المعدلة وراثيا معربا عن Aβ 42 في الخلايا العصبية ASE (FDX (ses25) سلالة) 8. بمناسبة transformants إيجابية استخدمنا GFP مراسل P-5 :: gcy الذي يحرك تحديدا التعبير GFP في حق ASE (ASER) الخلايا العصبية 11. الديدان العصا إلى لوحة لأن الاغاروز الجافة تمتص المياه. ولذلك فمن CRUاالجتماعية أن الحيوانات يتم وضعها على لوحة الحقن وحقن بسرعة نسبيا، وذلك لأن وإلا فإنها سوف تيبس وتموت. قد تختلف النسبة المئوية من ذرية F1 الذي يحمل مجموعة وخارج الصبغي تنتقل. القيم النموذجية هي في حدود 3-7٪. فمن المهم أن هذا المزيج حقن (1.1.3) يحتوي على غير ترميز تقاسم تسلسل الحمض النووي التماثل مع الحمض النووي المعدلة وراثيا (عادة ناقلات الفارغة) لأن السلطات الوطنية المعينة الخضوع مثلي إعادة التركيب مع بعضها البعض. ومع ذلك، إذا overexpression من التحوير مشكلة وينبغي أن يستكمل هذا المزيج مع حقن 50-100 نانوغرام / ميكرولتر من الحمض النووي الجيني يتفاعل مع هيئة السلع التموينية 1. الخلايا العصبية ASE كشف جاذبة للذوبان في الماء مثل البيوتين وبالتالي يمكن تقييم وظيفتها في المقايسات السلوكية (الكيميائي فحص، والبروتوكول 2 وأرقام 1A و 1B) 12. في تجربة نموذجية، ونحن اختبار الديدان سبعة ايام العمر معربا عن gcy P-5 :: GFP وحده (DA1262 سلالة) أو مع Aβ 42 (FDX (ses25)) للالكيميائي لالبيوتين. في الديدان الصغيرة (3-4 يوم من العمر) آثار Aβ 42 التعبير متواضعة ولكن يمكن اكتشافها بالفعل (~ 10٪ انخفاض في مؤشر الكيميائي، انظر المرجع 8). وتظهر نتائج هذه التجربة ممثلة في أرقام 1C 1D و. تم العثور على معظم DA1262 الديدان في، أو قريب، وبقعة جاذبة (الشكل 1C). على النقيض من ذلك سوى عدد قليل من الديدان معربا عن Aβ 42 يمكن العثور على بقعة جاذبة (1D الشكل). نحن اختبار 100 حيوانات / النمط الجيني وزعت في 5 لوحات اختبار / التركيب الوراثي الحصول على مؤشر الكيميائي للالبيوتين 0.68 ± 0.09 و 0.12 ± 0.04 لDA1262 وFDX (ses25)، على التوالي. تم الديدان بالموقع التقطت بشكل فردي ونقل إلى مركز لوحة اختبار. فمن المهم أن لا بسرعة فقط، ولكن أيضا نقل بلطف الديدان لأن وإلا فإنها قد تبقى غير نشطة لعدة دقائق، وفشل في تعقب الجاذب. في نهاية التجربة نقترح الديدان مراقبةctivity من خلال النظر في مساراتها. إذا سوى عدد قليل من مسارات واضحة ونحن عادة تجاهل لوحة.

GFP مضان في الخلايا العصبية ASER من FDX (ses25) الديدان يختفي داخل أحد عشر يوما الأولى من الحياة (لا يظهر). وهذا يشير إلى أن هذه الخلايا يخضع موت الخلايا المبرمج بسبب وجود Aβ 42. لذلك قررنا ما إذا كان المانع واسعة الطيف من موت الخلايا المبرمج مثل كاسباس المانع N-(2-Quinolyl) valyl-aspartyl-(2،6-difluorophenoxy) كيتون الميثيل (Q-VD-OPH) 13 أستطع التوقف عن فقدان الخلايا ASER . ولهذه الغاية قمنا بتوظيف الخلايا العصبية مثقف ASER الأولية من أجنة 14، والتي تم إعدادها كما هو موضح في البروتوكول 3. وتظهر الصور ممثل من الخلايا العصبية ASER في الشباب (4 أيام من العمر) FDX (ses25) دودة جنبا إلى جنب مع صور من الخلايا العصبية في الثقافة في أرقام 2A-C. كانت خلايا ASER مثقف قصيرة الأجل (الشكل 2D). كما حضانة المتوقع مع 0.3 ميكروغرام / مل Q-VD-OPH تستكمل طازجة يوميا، ج توقفت ompletely فقدان الخلايا العصبية ASER الفلورسنت. عند العمل مع الخلايا العصبية الأولية في الثقافة فمن المهم للحفاظ على كثافة الخلية المناسب. هذه المعلمة يعتمد بشكل رئيسي على عدد من الديدان المستخدمة لاستخراج البيض. نقيس كثافة الخلايا مع عدادة الكريات القياسية وتولي عناية خاصة للحفاظ على كثافة الخلية مستمر من ثقافة الخلية إلى خلية ثقافة. للتجارب الدوائية مثل تلك الموصوفة هنا عملنا مع ~ 200،000 خلية / سم 2 والتي تم الحصول عليها عن طريق حصاد أربع لوحات متكدسة 10 سم. كانت مطلية الخلايا في 12 بئرا من 24 لوحة جيدا. لأفضل النتائج من المهم أيضا لفصل الخلايا الجنينية قبل البذر لأنها تميل إلى تشكيل كتل. نحن نستخدم المحاقن مع إبرة قياس 27 و نبلاء نضح تعليق ذهابا وإيابا عدة مرات. هذا هو عموما كافية لفصل معظم الخلايا (وخاصة في بداية نقترح للتحقق من تعليق تحت المجهر).

ر "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" دائما "> الشكل 1
الشكل 1. الكيميائي الفحص. A. الممثل الكيميائي لوحة. يتم وضع علامة جاذبة (البيوتين) ومراقبة اماكن مع جوفاء ودائرة شغلها. B. صفيحة الكيميائي محملة 0.5 سم، وقطرها قطعة من أجار المستخدمة لإنشاء التدرج من البيوتين. تم قطع قطعة من آغار من لوحة 10 سم باستخدام الجانب العلوي من الزجاج ماصة باستير. C. توزيع الممثل من الديدان حول بقعة جاذبة. في هذا المثال كانت غالبية DA1262 الديدان قادرة على توطين مصدر جاذب (البيوتين). D. كما هو الحال في C. لFDX (ses25) الديدان. عرضت هذه الديدان البيوتين الأحرف توزيع منتشرة في كل أنحاء لوحة وتم العثور على عدد قليل فقط بالقرب من بقعة جاذبة.

tp_upload/50435/50435fig2.jpg "/>
الشكل 2. ثقافة C. الخلايا الجنينية ايليجانس. A. الإسفار صورة مجهرية (صورة اليسار) والضوء الساطع (صورة الحق) التي اتخذت من FDX (ses25) المعدلة وراثيا رئيس دودة. هذه الدودة عن GFP في الخلايا العصبية ASER مدفوعا gcy-5 المروج. B. صورة الضوء الساطع ثقافة FDX (ses25) الخلايا الجنينية. شريط المقياس 5 ميكرون. C. الإسفار صورة مجهرية من FDX مثقف (ses25) ASER الخلايا العصبية. وقد أخذت صور مع أوليمبوس BX61 المجهر مجهزة بكاميرا رقمية. D. تجربة الممثل اختبار جدوى مثقف، متزامنة العمر، الخلايا العصبية ASER. تم الحصول على الخلايا من الأجنة DA1262 (دوائر أجوف) أو FDX (ses25) الأجنة الاحتفاظ بها في غياب / حضور 300 نانوغرام / مل Q-VD-OPH (المربعات جوفاء ومليئة، على التوالي). تم استخدام اختفاء GFP مضان كمقياس للبقاء الخلايا العصبية لل. السابقينالتي ملصقة مع ~ 300 الخلايا العصبية ASER الفلورسنت. تم حساب الجدوى و100 * (عدد الخلايا الفلورسنت في يوم X مقسوما على عدد من الخلايا فلوري في يوم 1). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نحن هنا وصف نهج موحد، لدراسة الجوانب الخلوية والجزيئية من amylopathies باستخدام C. ايليجانس. مزايا هذا النهج ما يلي: 1) يتم الاحتفاظ منخفضة التكلفة C.elegans في طبق بتري العادية المصنف مع البكتيريا، في درجة حرارة الغرفة. 2) علم الوراثة قوية. ويمكن الحصول على الحيوانات المعدلة وراثيا في بضعة أشهر، ومجموعة واسعة من متواليات المروج هو متاح لدفع التعبير عن الجينات المرغوب في الخلايا العصبية المحددة. 3) بسيطة، وتتميز بشكل جيد، والجهاز العصبي. C. ايليجانس يمتلك الجهاز العصبي بسيطة بشكل ملحوظ (302 الخلايا العصبية). هذه البساطة وقد أتاحت توصيف واسعة من الجهاز العصبي الدودة بما في ذلك نسب الخلية، وظيفة محددة / دور كل عصبون وصلاتها متشابك. القيود المفروضة على C. وتشمل ايليجانس صغر حجم الخلايا، مما يعوق تطبيق التقنيات الحيوية القياسية مثل المناعية والجلد السميك (بشرة) الذي يعزل نويالخلايا العصبية تشكل البيئة الخارجية. لذلك، قد يكون النهج الدوائية ذات فعالية محدودة في C. ايليجانس. الثقافات من الخلايا الأولية تمثل استراتيجية صالحة لتخفيف هذه المشكلة جزئيا.

وتشمل الخطوات الحاسمة في هذه البروتوكولات التجريبية بدءا كميات كبيرة من الديدان ورصد الاستعدادات لكي لا يفقد البيض والأجنة وغيرها. ومن الضروري أيضا أن تتعلم كيفية التعامل مع الحيوانات خلال الحقن. يمكن حفظ الديدان في لوحة agarose فترة طويلة جدا، واللكم لهم مع ماصة كبيرة أو عن طريق الحقن كثيرا مزيج تدمير الحامض النووي لا رجعة منها. قد تختلف كفاءة التحول، واستنساخ والتحوير التعبير. ويرتبط الكفاءة لنقاء مزيج الحقن وتكوينه (وجود ال DNA غير المشفرة). صفائف خارج الصبغي تختلف من حيوان إلى حيوان ولذلك فمن الأهمية بمكان أن إنشاء ما لا يقل عن 2-3، وخطوط مستقلة في التحوير. من ناحية أخرى، إضافة هضمهاالحمض النووي الجيني لهذا المزيج يمثل استراتيجية صالحة للحد من الإفراط في التعبير المعدلة وراثيا. المقايسات الكيميائي هي نسبيا خالية من المتاعب. ومع ذلك فمن الأهمية بمكان للحفاظ على التناسق في الانحدار تركيز من أجل تجنب نتائج خاطئة. استخدام قطعة من آغار من نفس الحجم، على سبيل المثال قطع منها مع ماصة باستير والمحافظة على الوقت موازنة ثابتة. إن وجدت، وإزالة حل الزائدة مع مسحة القطن.

في الختام، هنا نقدم مثالا للكيفية التي يمكن أن تستغل بسيطة، كائن لين العريكة وراثيا للتحقيق في الجوانب الجزيئية من amylopathies. ويمكن تطبيق نفس الأساليب التجريبية لدراسة البروتينات العصبية الأخرى، وإلى جيل من نماذج حيوانية جديدة من المرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. NGM
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 3 g
Bacteriological agar AMRESCO J637 17 g
Bacto-peptone AMRESCO J636 2.5 g
Distilled Water Bring to 975 ml
Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 1 ml of 1 M stock
Cholesterol Sigma-Aldrich C3045 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol)
Potassium phosphate buffer 25 ml of 1M stock
2. Potassium phosphate buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 108.3 g
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786 35.6 g
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
3. M9 buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 3 g
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S5136 6 g
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 5 g
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm)
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 118 mM
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 48 mM
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 2 mM
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M4880 2 mM
HEPES Fisher Scientific BP310 25 mM
Distilled Water Bring to 1 L
Sterilized by autoclaving
5. CM-15
L-15 culture medium Gibco 11415 450 ml
Fetal Bovine Serum Gibco 10437-028 50 ml
Penicillin Gibco 15140 50 units/ml
Streptomycin Gibco 15140 50 g/ml
Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C
6. Other Reagents
Halocarbon 700 oil Halocarbon Products 9002-83-9
5 μm Acrodisc Syringe Filter PALL Co. 4199
Chitinase Sigma-Aldrich C6137-5UN
Lectin (peanut) Sigma-Aldrich L0881-10MG
Sodium hydroxide Fisher Scientific S320
Lysine Sigma-Aldrich L5501
Biotin Sigma-Aldrich B4639
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sucrose Sigma-Aldrich S0389

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12, (10), 383-388 (1991).
  2. Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. Lewy body pathology in Alzheimer's disease. Journal of Molecular Neuroscience. 17, (2), 225-232 (2001).
  3. Greenberg, S. A. Inclusion body myositis: review of recent literature. Current Neurology and Neuroscience Reports. 9, (1), 83-89 (2009).
  4. Revesz, T., et al. Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies. Brain Pathology. 12, (3), 343-357 (2002).
  5. Hartmann, T., et al. Distinct sites of intracellular production for Alzheimer's disease A beta40/42 amyloid peptides. Nature Medicine. 3, (9), 1016-1020 (1997).
  6. Ohnishi, S., Takano, K. Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding. Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61, (5), 511-524 (2004).
  7. C. elegans II. Cold Spring Harbor Monograph. DL, R. iddle, et al. 1, M. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1222 (1997).
  8. Cotella, D., et al. Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32, (12), 4133-4144 (2012).
  9. Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, (20), 9368-9372 (1995).
  10. Cai, S. Q., Sesti, F. Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging. Nature Neuroscience. 12, (5), 611-617 (2009).
  11. Yu, S., et al. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).
  12. Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7, (5), 729-742 (1991).
  13. Caserta, T. M., et al. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8, (4), 345-352 (2003).
  14. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, (4), 503-514 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats