כינונה מחדש של ערוץ Kv לממברנות שומנים בדם למבני ותפקודיים ללימודים

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

הליכים לכינון מחדש של אב טיפוס ערוץ אשלגן מתח מגודרת לממברנות שומנים בדם מלא מתוארים. הערוצים המשוחזרים מתאימים למבחנים ביוכימיים, הקלטות חשמל, הקרנת יגנד ומחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים. שיטות אלה עשויות להיות יישומים כלליים למחקרים המבניים ותפקודיים של חלבוני קרום אחרים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. J. Vis. Exp. (77), e50436, doi:10.3791/50436 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

כדי לחקור את האינטראקציה שומנים החלבון באופן מצמצם, יש צורך לשלב את החלבונים בממברנה לקרומים של הרכב שומנים מוגדר היטב. אנו לומדים את השפעות gating שומנים בדם תלויות באשלגן ערוץ מתח מגודרת אב טיפוס (KV), ועבדנו את נהלים מפורטים כדי לשקם את הערוצים למערכות שונות בממברנה. הליכי הכינון מחדש שלנו לקחת שיקול של שניהם היתוך המושרה בחומרי ניקוי משלפוחית ​​והאיחוי של מיצלות חלבון / חומר ניקוי עם מיצלות מעורבת שומנים / חומר ניקוי, כמו גם את החשיבות של להגיע לחלוקת שיווי משקל של שומנים בין החלבון / חומר הניקוי / שומנים וחומרי הניקוי מיצלות מעורבת / שומנים בדם. הנתונים שלנו הציעו שההכנסה של הערוצים בשלפוחית ​​השומנים היא אקראית יחסית באורינטציות, ואת יעילות הכינון מחדש היא כל כך גבוהה שאין אגרגטים חלבון גילוי נראו בניסויים חלוקים. יש לנו מנוצלים מחדשערוצי D כדי לקבוע את מצבי קונפורמציה של הערוצים בשומנים שונים, להקליט את הפעילות חשמלית של מספר קטן של ערוצים ששולבו בbilayers שומנים מישוריים, מסך לligands קונפורמציה ספציפי מהפאג-מוצגת ספריית פפטיד, ולתמוך בצמיחה של גבישי 2D מהערוצים בקרום. הכינון מחדש את הנהלים שתוארו כאן עשויים להיות מותאמים ללימוד חלבוני קרום אחרים בbilayers שומנים, במיוחד עבור החקירה של השפעות השומנים על תעלות היונים מתח מגודרת אוקריוטים.

Introduction

חומרי חליפין תאים ומידע עם הסביבה שלהם באמצעות הפונקציות של חלבונים בממברנה ספציפיים 1. חלבוני קרום בקרום תא מתפקדים כמשאבות, תעלות, קולטנים, אנזימים, intramembrane linkers ותומכים מבניים על פני ממברנות. מוטציות המשפיעות על החלבונים בממברנה היו קשורות למחלות בבני אדם רבים. למעשה, חלבונים בממברנה רבים כבר את מטרות התרופה העיקריות כי הם חשובים ונגישים בקלות בקרום תא. לכן זה מאוד חשוב להבין את המבנה והתפקוד של חלבונים בממברנה שונים בקרום, ולהפוך אותו אפשר להמציא שיטות חדשות כדי להקל על ההשפעות מזיקות מהחלבונים שעברו מוטציה במחלות אנושיות.

שומנים להקיף את כל חלבונים בממברנה משולבים ב2 bilayers, 3. בממברנות אוקריוטים, הסוגים השונים של שומנים ידועים להיות מאורגנים microdomains 4, 5.חלבונים בממברנה רבים הוצגו לחלוקה בין microdomains אלה, כמו גם בשלב הנוזל המגושם של 3 קרומים, 6. המנגנון הבסיסי של ארגון microdomains והאספקה ​​של חלבונים בממברנה לתוכם והמשמעות הפיזיולוגית של הפצות כאלה הם חשובים באופן ברור, אך נשאר הבין היטב. קושי טכני גדול באחד לומד את ההשפעות על שומני חלבונים בממברנה הוא הכינון מחדש אמין של יוכימית מטוהר חלבונים בממברנה לקרומים של הרכב שומנים מבוקר היטב, כך שכמעט בכל חלבונים מחדש הם 7 פונקציונליים. בשנים האחרונות, פיתחנו שיטות כדי לשקם את ערוץ אשלגן מתח מגודרת אב הטיפוס מא pernix (KvAP) לתוך מערכות שונות לממברנה 8-10 מחקרים המבניים ותפקודי. את הנתונים מאחרים ואותנו יחד הראו כי השומנים הם סביר הקובע בשינויי קונפורמציה של מתח החישהתחומים של ערוץ יון מתח מגודרת ועשויים לעצב את המבנים של חלק מערוצים אלה 11. בעולם הבא, נספק תיאור מפורט של השיטות שלנו ואציע טיפים טכניים קריטיים שצפויים להבטיח רבייה המוצלחת של התוצאות שלנו, כמו גם הרחבה של השיטות שלנו למחקרים של חלבונים בממברנה אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ביטוי וטיהור של KvAP ערוץ (איור 1)

  1. עבודה הכנה - יום 0
    1. שוטפים את צלוחיות הזכוכית לתרבות חיידקים במי deionized (diH 2 O) וMilliQ H 2 O (MQH 2 O) כדי להסיר עקבות של חומרי ניקוי משטיפת כלים כלליות.
    2. בינוני חיטוי 1,000 מ"ל LB ב2.8 ליטר Erlenmeyer צלוחיות (כוללת של שני ליטר תרבות כדוגמה כאן). קשיחות נמוכה של המים נמצא להיות חשוב לתרבות המוצלחת של החיידקים מותמרים.
    3. מדיום LB 100 מ"ל בחיטוי 500 מ"ל צלוחיות
    4. להפוך 60 μl של תאים מוסמכים-XL1 כחולים עם 200 ng של pQE60 פלסמיד המכיל את הגן לKvAP עם אתר תרומבין חיתוך ו6 תגו בC-הסופית שלו, צלחת החיידקים על שתי צלחות LB-אגר המכילות 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין, ו דגירה אותם 14-16 שעות ב37 ° C חממה.
  2. ביטוי של KvAP - יום 1
    1. בדקו את היישוםearance של מושבות חיידקים על הצלחות לאחר דגירה הלילה. המושבות היו בדרך כלל רק כ 0.2-0.5 מ"מ בקוטר, והיו הרבה מהם. אנחנו לא רוצים את הצלחות כי נמל מושבות גדולות מוקפות הרבה מושבות לווין.
    2. הוסף 5.0 מיליליטר מדיום LB לכל צלחת LB-אגר מודגרות לילה וגרוטאות את המושבות. מעבירים את ההשעיה החיידקים לתוך מדיום LB 100 מ"ל autoclaved בבקבוק 500 מ"ל. הוסף אמפיצילין לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל, דגירה התרבות הקטנה ל~ שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס או עד שמגיע OD600 0.60.
    3. בינתיים, המקום שתי צלוחיות עם מדיום 1.0 ליטר ל37 מעלות צלזיוס החממה רועד כדי להתחמם בינונית, ולהכין 20 מ"ל של BaCl 2 (1.0 M; ריכוז סופי 10 מ"מ בכל תרבות L 1.0), 2.0 מ"ל 0.4 מ ' IPTG (איזופרופיל-β-thio-galactoside), ו2.0 מ"ל של מניית אמפיצילין מ"ג / 100 מ"ל במים.
    4. ברגע שהתרבות הקטנה מוכנה, להוסיף 10 מ"ל של BaCl 2, 1.0 מ"ל של ampiciמניית llin, ו50 מ"ל של התרבות הקטנה מצעד 1.2.2 לתקשורת LB המחוממת מראש. OD600 צריך להיות סביב 0.05. צפו לממטרים אפשרי בשל קשיות גבוהה של המים והיונים הנגדיים בתקשורת LB. Ba 2 + ידוע להיקשר לתחום הנקבובית של הערוץ וחוסם הנוכחיים היוני אשלגן, ובכך מפחית את הרעילות של הביטוי ברמה הגבוהה של הערוצים לחיידקים.
    5. קח OD600 כל שעה עד שהוא מגיע 0.70, וכל רבע שעה עד שהוא מגיע 0.8-0.9. בהגדרה שלנו, זה בדרך כלל לוקח ~ 5 שעות כדי להגיע ל0.8.
    6. הוסף 0.40 מ"מ IPTG כדי להתחיל את הביטוי המושרה של חלבון ערוץ, ודגירת התרבות לעוד 4.0 שעות ב 37 ° C עם 225 סל"ד רועד.
    7. חיידקי קציר בבקבוקי צנטריפוגות 1.0 ליטר על ידי ספינינג ב 4000 XG, 4.0 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. למזוג supernatant ככל האפשר לתוך כוס פסולת, להוסיף למאגר 10 מ"ל 1.0 M Na-פוספט כדי לזרז את כל Ba 2 +, ולאחר מכן להוסיףנפח קטן של אקונומיקה כדי להרוג את החיידקים. לשמור על החיידקים שנקטפו בבקבוקים צנטריפוגות הקבורים בקרח ב4.0 ° C חדר קר למשך הלילה.
  3. טיהור של חלבון KvAP (יום 2 ו -3; איור 1)
    1. Resuspend גלולה החיידקים ב15 מ"ל של חיץ תמוגה IMAC לתרבות L 1.0. הוסף ~ 1.0 U DNase אני, ושלושה מעכבי הפרוטאז של leupeptin, aprotinin וpepstatin ב1.0 מיקרוגרם / מ"ל. הנפח הכולל לתרבות של שני ליטר היה ~ 35 מ"ל.
    2. Sonicate את חיידקי resuspended בכוס מתכת קבור בקרח במשך 10 דקות בסך הכל של עמידה בזמנים. Sonicator microprobe הוקם ב5 שניות ON / OFF 10 שניות מחזור עם 40% תפוקת חשמל במעלות צלזיוס חדר קר 4.0. פלט הגדרת כוחו באופן אמפירי נקבעה כך שרוב החיידקים היו lysed בלי הרבה חימום בפתרון.
    3. הוסף 0.50 גרם של N-β-Decyl-D-Maltoside (DM; סול-Grade מAnatrace) באבקה יבשה לlysate תא sonicated ו דגירה את התערובת במשך 30.5 שעות בטמפרטורת חדר (RT) עם רעד אופקי קבוע (~ 100 סל"ד) על מנת לחלץ חלבוני ערוץ ככל האפשר. חשוב לוודא כי אבקת הכביסה היא מומס באופן מלא על פני תקופה של 30-50 דקות.
    4. לאחר מיצוי חומרי ניקוי, להסיר את הפסולת מתא lysate על ידי צנטריפוגה XG ב 20,000 במשך 30 דקות ב RT. בזמן ההמתנה לצנטריפוגה כדי לסיים, להכין עמודת LC מבוססת התג שלו (כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ נמוך), כמפורט בתיבה 1.
    5. טען את supernatant משלב 1.3.4 על ה-iMac הארוז מראש (אני mmobilized מ 'אח' יון ffinity ג hromatography) הטור בקצב זרימה של 1-2 דקות מ"ל / כי הוא מונע על ידי משאבת peristaltic. לחלופין חלבון חילוצו מתויג ניתן מודגרות עם שרף IMAC לbatchwise מחייב.
    6. שטוף את שרף IMAC על ידי הפעלת 5 כרכי מיטה של ​​חיץ לשטוף iMac, ו10 כרכי מיטה של ​​חובב לשטוף IMACאה ועוד 20 מ"מ imidazole. צג UV באונליין משמש כדי לוודא שהכביסה נקיה.
    7. Elute חלבון KvAP ידי החלת מאגר elution IMAC המכיל 300 מ"מ imidazole. רוב KvAP המאוגד הוא eluted בתוך 6 מ"ל של חיץ elution דרך העמודה. הוסף תרומבין (1.0 U ל2-3 מ"ג של חלבון) לתוך השברים elution אספו ודגירת חלבון הלילה על הספסל לדבוק 6 התג שלו.
    8. ביום למחרת, לרכז את פתרון חלבון תרומבין-מתעכל בCentricon (MWCO = 30K) עד 600 μl לFPLC גודל הדרה (כרומטוגרפיה נוזלי חלבון מהיר). במהלך צנטריפוגה, לערבב מדגם כל חמש דקות כדי למזער את הצטברות חלבון. כחלבון מרוכז, הריכוז המקומי במסנן הקרום הופך גבוה יותר, ולפעמים יש משקעים לבנים ברורה שאפשר אחרת לסתום את קרום המסנן. כמו כן הריכוז הגבוה של חלבונים (~ מ"ג / מ"ל ​​5-10) בחלק התחתון של הרכז מוביל למצחצבע וערבוב Nish באמת עוזר כדי להקטין את איבוד מדגם.
    9. הפעל את KvAP המרוכז דרך 200 עמודת Superdex שהוא מראש equilibrated עם חיץ איזון FPLC. בדרך כלל השיא של ערוץ KvAP tetrameric בelutes DM עם נפח אצירה של 12.3 מ"ל. יש זנב נגרר קטן בסביבות 13.6 מ"ל, שבו יש כמות קטנה של KvAP monomeric. החלל של הטור הוא שנהגנו ב7.0 מ"ל, ובדרך כלל המדגם מעורר שיא קטן בחלל, אשר מכיל חלבון KvAP מעט מאוד. Imidazole מגיע בסוף elution (~ 24 מ"ל). בריכת שברים המכילים tetramers KvAP ביחד ולהתרכז עד 0.5 מיליליטר פתרון החלבון. קבע את הריכוז של המדגם באמצעות מקדם הכחדה המשוערת (~ 1.2E-5.0 M -1 cm -1, שחושב על בסיס מספר השאריות ארומטיים) של KvAP ב 280 ננומטר [12 נ"צ, כתובת אתר: http:// web.expasy.org / protparam /].
      בטמפרטורת חדר, KvAP המטוהרים בDM הוא יציב במשך לפחות שבוע ללא איבוד משמעותי של חלבון. ב 4 ° C, זה יכול להימשך זמן רב עוד יותר. לעולם אל תקפיא את החלבון בחומרי ניקוי. מומלץ לאחסן את החלבון בDM על 4 מעלות צלזיוס, והחלבון בβ-OG בטמפרטורת חדר. אבל אנחנו בדרך כלל לא לחכות, ולהמשיך לשלב הכינון מחדש מייד לאחר החלבונים מוכנים.
    10. Assay הדגימות בהפחתת 12% ג'ל-SDS.
      הדגימות מכל צעד שתואר לעיל נערכו על ידי ערבוב של 20 מיקרוליטר של דגימות עם חיץ SDS-מדגם 5x (לוח 3 למאגרים) בתוספת 1.0% β-ME. הדגימות לא היו מבושלת. לאחר ג'לי היה מוכן, הדגימות בדרך כלל היו בSDS-החיץ במשך יותר מ -10 דקות בטמפרטורת חדר. לאחר ג'ל נדרס ומוכתם בCoomassie הכחול, KvAP פראי הסוג הופיע כלהקה יחידה בסביבות 26 kDa (איור 1 ב

2. הכינון ערוץ יון

2.1. הכנת liposome והיתוך מושרה בחומרי ניקוי משלפוחית

לפני הכנת השומנים בדם, לשטוף 14 מיליליטר כוס חד פעמי מבחנה, שפופרת זכוכית הכתיר בורג, ומזרק 250 μl זכוכית עם כלורופורם. שפוך ~ 10 מיליליטר כלורופורם לTestTube.

  1. הכנת Palmitoyl-oleoyl-phosphatidyl-ethanolamine (אפיפיור) ויפוזומים Palmitoyl-oleoyl-phosphatidyl-גליצרול (POPG).
    1. העבר 3.75 מ"ג של אפיפיור ו1.25 מ"ג של POPG (אפיפיור: POPG = יחס משקל 3:1) בכלורופורם לתוך צינור הזכוכית הכתיר בורג ניקה מראש ולייבש את השומנים בזרם רציף של גז ארגון. כאשר אין כלורופורם גלוי הוא שמאל, לייבש את השומנים נוספים תחת ואקום חדר במשך שעה אחת.
    2. הוסף 440 μl של מלח חיץ נמוך (10 HEPES מ"מ, pH 7.4) או מים לשומנים בדם מיובשים ומערבולת צינור למימה את השומנים. ההשעיה השומנים נראית לבנבן ועכור.
    3. Sonicate ההשעיה השומנים בsonicator אמבטיה קר כקרח עד לפתרון השלפוחית ​​הופך להיות שקוף (OD410 <0.2).
      בדרך כלל לפתרון 10 מ"ג / מיליליטר האפיפיור / POPG במים או במאגר מלח נמוך, שבו פעל sonicator עם 30 שניות על 30 שניות וכיבוי (על קרח) עבור סכום כולל של 15-20 דקות. בגלל החום שנוצר במהלך sonication, רצוי להוסיף DTT מ"מ 1.0 בפתרון השומנים על מנת למזער חמצון שומנים בדם, ולהתקרר במים האמבט של sonicator עד 10 מעלות צלזיוס או מתחת. OD410 הסופי הוא שומנים תלוי. לשומנים מסוימים זה עלול להיות קשה מאוד כדי להגיע לקוטר חיצוני נמוך כזה. אם זה יקרה, אנחנו בדרך כלל להשתמש בחומרי ניקוי לsolubilize לחלוטין את השומנים ולאפשר לזמן דגירה להגיע הפצה טובה של שומנים סביב מיצלות המכילה חלבון (ראה בסמוך).
      Sonicator אמבטיה בקיבולת גבוהה הוא חשוב בORDאה להגיע OD410 <0.2. אנחנו כבר משתמשים במערכת שנעשתה על ידי מעבדה ציוד ושות, Inc (דגם # G112SPIG, Hicksville, ניו יורק). המפתח לsonication התקין של שלפוחית ​​הוא לוודא שיש לו את המרכז המהדהד באמצע צינור רטט חזק. הרטט משתנה בהתאם לנפח מים ולכן יכול להיות מותאם. גם הוא נמצא באופן אמפירי שצמיגות מוגברת של המים על ידי הוספת כמות קטנה של גליצרול יכולה לשפר את היעילות של sonication.
      לחלופין מצאנו כי שימוש בsonicator microprobe במגע עם ההשעיה השומנים בפלסטיק או צינור מתכת יכול לייצר את אותן תוצאות. Microprobe צריך לנקות ורק הקצה הוא לטבול בתמיסת השומנים בדם. מכיוון שחלקיקי השומנים שבורים לחתיכות קטנות על פני השטח של microprobe, זה מאוד חשוב לשמור על המדגם התקרר, ויש לי כמה סוכני הפחתה סביב למנוע חמצון של שומנים בלתי רוויים.
      תחת האלקטרונים cryo-MICRoscopy, הרוב המכריע של שלפוחית ​​unilamellar sonicated הוא 30-50 ננומטר בקוטר (מידע לא מוצג). העקמומיות של רכבי השטח הקטנים היא כל כך גבוהה שהפרעות קטנות מספיק כדי לגרום להיתוך התוסס של שלפוחית ​​אלה לאלה גדולים יותר, כי הם 80-200 ננומטר בקוטר (ראה הבא).
    4. הוסף 50 μl של 3.0 M KCl ו10 μl של 0.50 מ 'DM לתערובת, כך שהשעית השומנים הסופית יש KCl 300 מ"מ ו -10 מ"מ DM. דגירה הפתרון עם סיבוב אופקי לשעה 2 ב RT ליצירת שומנים / חומר ניקוי מיצלות מעורבת. לאחר הדגירה, ההשעיה צריכה להיות עכורות קצת (איור 2 א), שנובע מההיתוך המושרה חומר ניקוי של שלפוחית ​​unilamellar קטנה.
    5. כאשר החלבון מרוכז ליותר מ 2.0 מ"ג / מ"ל, להוסיף 0.50 מ"ג חלבון KvAP, 50 μl של 3.0 M KCl, 16 μl של 0.50 מניית DM M במים, ו10 HEPES מ"מ, pH 7.4 לתערובת שומנים / חומר ניקוי ל להפוך 1 מ"ל של נפח סופי. השומנים סופי: יחס משקל חלבון הוא 10:01והריכוז הסופי של DM הוא 18 מ"מ (איור 2 א). דגירה את תערובת חלבונים / שומנים / חומר ניקוי בשפופרת הזכוכית עם סיבוב אופקי במשך שעה 2 אחרת.
      הבחירה של ריכוז חומר הניקוי הוא מונחה על ידי איחוי השלפוחית ​​המושרה חומר ניקוי והשלפוחית ​​solubilization 13. כאשר שלפוחית ​​נוצרות על ידי sonication החזק, הקוטר הממוצע שלהם הוא בטווח של 30-50 ננומטר תחת EM. יש בועיות אלו פיזור נמוך מאוד ב410 ננומטר. בריכוזים נמוכים, חומרי ניקוי מוכנסים תחילה לתוך שלפוחית, לערער את שלפוחית, ולגרום לשילוב של שלפוחית ​​חומר ניקוי רוויה (OD410 עולה, ראה איור 2 א). איחוי שלפוחית ​​מוביל לעלייה של OD410 ננומטר. במשך 10 שלפוחית ​​מ"ג / מיליליטר אפיפיור / POPG, את OD410 פסגות בכ -15 מ"מ DM. כאשר יותר חומרי ניקוי הם הציגו, שלפוחית ​​להתחיל לשבור לחתיכות והופכים את השומנים מחולקים לחומרי ניקוי / שומנים מיצלות מעורבת. התהליך אחרון זה מלווה על ידיירידה של OD410 עד לרמה נמוכה סופית (<0.1).
      בשל אירועי ההיתוך הפעילים בשלב העולה של הצפיפות האופטית עקב ההיתוך המושרה בחומרי ניקוי משלפוחית ​​קטנה, יש סיכוי גבוה מאוד שמיצלות החלבון / חומר ניקוי תהיה התמזגה באופן פעיל עם חומר ניקוי שלפוחית ​​השומנים הרווי. זו הסיבה מאחורי הבחירה של 18 מ"מ DM בזמן הכנת החלבונים / שומנים / תערובת חומר ניקוי. אם חומר הניקוי הופך להיות מרוכז על ידי יותר מ 4 קפלים, את כמות הצרכים DM להיות מותאמת כך שהריכוז הסופי הוא עדיין סביב 18-20 מ"מ. כאשר תשואת החלבון היא נמוכה מאוד, קשה להעריך כמה חומרי ניקוי מרוכזים הם במדגם, היינו במקום לערבב את החלבון עם שומני solubilized במלואו, ולהשתמש בתערובת מלאה equilibrated לכינון מחדש. בידיים שלנו, אם לא מספיק זמן הורשה להגיע לשיווי משקל טוב הפצה של השומנים בין המכיל חלבון ומיצלות ללא חלבון, reconstitutיעילות יון ירד באופן משמעותי. אנחנו בדרך כלל לבחון את יעילות הכינון מחדש על ידי שני ניסויים: 1) לבחון את שיתוף ההגירה של החלבון עם שבר בשלפוחית ​​ultracentrifugation שיפוע סוכרוז צפיפות, 2) לחלץ את החלבונים מחוץ לשלפוחית ​​מחדש, וfractionate בג'ל עמודת סינון למצוא כמה חלבון (KvAP במקרה שלנו) נשאר להיות tetrameric. מינימום זמן של דגירה של החלבון / שומנים / חומרי הניקוי הוא כמה שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 מעלות.
      לחלבון קרום חדש, כי הוא יציב בחומרי ניקוי שונים, הצעד הראשון הוא לברר את נכס solubilization של שומנים על ידי חומר ניקוי כזה, דומה למה שהראה באיור 2 א. בשלב הבא, מומלץ להתחיל עם תמציות המחשב, כגון א ' מחשב coli קוטב תמצית, וכו 'תמצית סויה המחשב, כך שאם חלבון מסוים צריך פוספוליפידים מסוימים לתפקידו, ייתכן שהוא כבר כלול בextracתערובת שומנים טד.
  2. הכנת KvAP בתערובת עם חומר ניקוי-solubilized 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-פרופאן (DOTAP) או 1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-succinate (כלבים) --- דוגמה לsolubilization שומנים המלא לכינון מחדש
    1. הכנת השומנים זהה לשלפוחית ​​אפיפיור / POPG. Sonication של שומני התייבשות לתוך שלפוחית ​​unilamellar קטנה זקוק לזמן ארוך יותר (בדרך כלל 45-60 דקות), בהשוואה לשומני אפיפיור / POPG (בדרך כלל 5-10 דקות). שלפוחית ​​הכלבים יכול למזג לאט אחד עם השני ויוצרת טיפות שמן קטנות.
      בשל הקושי בקבלת רכבי השטח באיכות גבוהה ומכלבי DOTAP reproducibly, אנחנו בדרך כלל solubilize שני השומנים הללו לחלוטין לפני הערבוב עם החלבונים.
    2. לsolubilize DOTAP או כלבים לחלוטין, שלפוחית ​​sonicated מעורבבות עם 10 מ"מ DM ו40 מ"מ N-β-octyl-D-glucoside (β-OG). תערובת השומנים / חומר ניקוי היא מודגרות לילה (> 15 שעות)בטמפרטורת חדר, ואת התערובת לא צריכה שום חלקיקים קטנים או טיפות. אבל במקום זה הוא ברור למדי. כישלון להגיע לשיווי משקל מלא בשלב זה יוביל להיווצרות של חלק משמעותי של שלפוחית ​​multilamellar.
    3. מערבבים את חלבון KvAP עם חומר ניקוי DOTAP-solubilized או כלבים בחלבון: יחס שומנים שהוא פחות או שווה ל 1:10. תערובת חלבונים / חומר הניקוי / שומנים מותר דגירה בטמפרטורת חדר למשך 2-3 שעות עם סיבוב מקצה על קצה.

2.2. להסרת של חומרי הניקוי כדי ליצור proteoliposomes

  1. דיאליזה --- ההסרה איטית של חומרי הניקוי, כגון DM וβ-OG, שיש ריכוזי micelle קריטיים גבוהים יחסית (CMC ≥ מ"מ 1.0)
    הכן את חיץ דיאליזה 2 ליטר (לוח 3) לכל תערובת מיליליטר 1.0.
    גזור את האורך מתאים של צינורות דיאליזה (MWCO = 10K; 0.70 ס"מ רוחב), ולשטוף אותו עם מים די. זה חשוב לבדוק ולעשותבטוח שאין דליפה בצינור. לדגימות רגישות, הצינור יכול להיות המטופל ראשון עם חיץ של 10 מ"מ טריס-HCl pH8.0 ו2.0 מ"מ EDTA, ולאחר מכן יש לנקות במים רותחים במשך 3-5 דקות. צינורות הוא הידק אז בקצה אחד ולשטוף עם חיץ הדיאליזה.
    טען את תערובת חלבונים, שומנים, חומר הניקוי לצינורות דיאליזה. הצמד את שני הקצוות של צינורות עם שטח מינימאלי השאיר לעיל הפתרון. שים את הצינור שנטען לתוך מאגר הדיאליזה, ולהשתמש בצלחת ערבוב כך שהצינורות מסתובבים באיטיות בפתרון. לשנות את חיץ הדיאליזה פעם אחת בכל 8 שעות. לאחר שינוי החיץ הראשון, הפתרון צריך להיות מעונן אם תערובת חלבונים, שומנים, חומר הניקוי הייתה ברורה לחלוטין. אם הדיאליזה היא מהירה מדי, ייתכן שיש לבן מוצקה משקעים בתחתית צינורות הדיאליזה. מומלץ כי בעת שינוי החיץ, צריך להיות שפשף את הצינור, והתהפך מספר פעמים. לאחר חמישה שינויים של חיץ דיאליזה, שלפוחית ​​הן בדרך כלל מוכנה.
    אנחנו בודק את סכום השייר של חומרי ניקוי על ידי ירי על שלפוחית ​​bilayer השומנים. כאשר יש כמות משמעותית של חומרי ניקוי עדיין נותרו, bilayer הופך נשבר באופן כמעט מיידי. אפשר גם למדוד את חומר הניקוי שיורית על ידי שימוש בשיטת colorimetric או מדידת מתח הפנים של ההשעיה השלפוחית.
  2. שימוש בחרוזי פוליסטירן כדי לסייע להסיר חומרי ניקוי שיש לי CMC הנמוך
    במקרים רבים, אנחנו צריכים להשתמש בחומרי ניקוי CMC נמוכים, כגון DDM (CMC ~ 0.17 מ"מ במים). חרוזים עם נקבוביות הידרופובי זעירות המשמשים להסרת חומרי ניקוי אלה 14.
    1. הכנה של החרוזים. משקל מתוך 0.5 גרם של חרוזים יבשים ולשים אותם לתוך שפופרת 50 מיליליטר קורנינג, להוסיף 20 מ"ל מתנול, sonicate הפתרון בsonicator אמבטיה במשך 5 דקות כדי להסיר בועות לכודות, ספין למטה החרוזים ב 5000 סל"ד במשך 5 דקות, ולאחר מכן רוב מתנול למזוג. חזור על לשטוף עם אתנול ומים MilliQ. את חרוזי שטף הם מאוחסנים ב20% אתנול על 4 מעלות צלזיוס, וצריך להיות שונה לחיץ ללא חומר ניקוי לפני השימוש.
    2. להעריך את כמות חומרי הניקוי בתערובת חלבונים / שומנים / חומר ניקוי שיתייחסו אליו, ולחשב את כמות חרוזים הדרושים כדי להסיר את חומרי הניקוי. לDDM וDM, יכולת הקשירה היא כ -100 מ"ג לחרוזי 10 מ"ג חומרי ניקוי. את החרוזים הרטובים ללא מים עודפים הם שקלו החוצה, והוסיפו ישירות לתערובת החלבונים. לפחות 15-20 דקות נדרש לחרוזים כדי להיות אפקטיבי באופן מלא והירידה של ריכוז חומר ניקוי מגיעה לרמה יציבה 14-16. כדי להסיר 8.7 מ"ג של DDM (dodecyl-maltoside) בתמיסת 1.0 מ"ל, שווה ערך ל ~ 18 מ"מ, בסך של 87 מ"ג של חרוזי פוליסטירן, כמו ביו חרוזים SM2, משמש בחמישה חלקים שווים. מערבבים את תערובת חלבונים / שומנים / חומר ניקוי עם כל שבריר במשך 20-30 דקות עם סיבוב מקצה על קצה מתמיד בטמפרטורת חדר, ספין למטה החרוזים, להעביר את supernatant לשבריר הבא של חרוזים, וחזור עד הסוף.
      כאשר concentr חומר הניקויation מגיע CMC שלה, אנחנו במכוון להאריך את תקופת זמן לזה לשעה אחת, כך שהכמות הקטנה של חומרי ניקוי בפתרון תאפשר שילוב של שלפוחית ​​קטנה לגדולה.
    3. כדי להסיר את כמות העקבות של חומרי ניקוי לאחר השלב האחרון, להוסיף 35 מ"ג חרוזים ביו רד SM2 ודגירה עם שלפוחית ​​ל4 שעות.
      כאשר ההליכים להסרת חומר ניקוי שתוארו לעיל הם שיש להחיל חלבון חדש, זה בדרך כלל מומלץ להתחיל עם יחס החלבון / שומנים בדם (WT / WT) של ~ 1:10. תערובת השומנים / חומר ניקוי צריך להיות מוכנה בזהירות, כך שמספיק חומרי ניקוי נוספים לsolubilize את השומנים (איור 2 א) לחלוטין. חשוב דגירה את תערובת שומנים חומר הניקוי ליותר מ 2 שעות בטמפרטורת חדר (עם 1-2 מ"מ DTT) עם רעד קבוע (400 סל"ד) או סיבוב מקצה על קצה. כאשר החלבון מעורבב עם שומנים, תערובת חלבונים / שומנים / חומר ניקוי צריכה להיות מודגרות מספיק זמן (לילה אם החלבון הוא Stablה) בשתי טמפרטורת חדר או בחדר קר, כך שההפצה של חומרי ניקוי ושומנים בין מיצלות המכילה חלבון וmicelles ללא חלבון היא גם יחסית. בנוסף, אם במהירות הסרת חומרי הניקוי באמצעות BioBeads היא מועסק, חשוב לברר את יכולת חומר ניקוי מחייבת של החרוזים. ההסרה האיטית של חומרי ניקוי צפוי מבטיחה שיהיו מספיק חלבוני שומנים כדי לשמור על שלמותם ולהיות מוכנסים לתוך שלפוחית ​​ניכרות יחסית.

2.3. אחסון של proteoliposome ובקרת האיכות

  1. ברגע שאת שלפוחית ​​מוכנה, להכין אותם ל50 aliquots μl ופלאש להקפיא את aliquots מתעוזה ישירה לתוך חנקן נוזלי. שלפוחית ​​קפואה אז מאוחסנת במקפיא -80 מעלות צלזיוס. עבור מבחני ביוכימיים, אנחנו לא משתמשים בשלפוחית ​​קפואה בגלל מחזור הקפאת ההפשרה לפעמים נמצא להציג את הממצאים לתגובת Cys הספציפית שלנו. להקלטה חשמליתים, אנו משתמשים בשלפוחית ​​המאוחסנות ב-80 מעלות צלזיוס במשך פחות מ -6 חודשים בלבד.
  2. ציפה של שלפוחית ​​בשיפוע צפיפות (איור 2)
    1. טען 50 μl של ההשעיה השלפוחית ​​על גבי שכבות של צבע המכילות סוכרוז 0.3 מ"ל כל אחת של 10, 35 ו 55% סוכרוז נעשה ב10 HEPES וספין מ"מ ב200,000 גרם במשך 4 שעות ב 4 ° C. להאיץ ולהאט לאט, כדי למנוע השיבוש של הממשק בין שכבות.
    2. לאסוף 100 שברי μl מלמעלה עד למטה ולהפעיל אותם ב- SDS ללא הפחתה (איור 2). KvAP מוכתם היטב עם כחול Coomassie כך שלהקה של חלבון 0.5-1.0 מיקרוגרם נראית בבירור. צריך להימצא חלבון KvAP בממשק שבין 10 ו 35% סוכרוז. אין מצרפים כבדים של חלבונים נראים בטווח הצפיפות הגבוה, מצביעים על כך שכמעט בכל החלבונים בקרום.
  3. בדקו קונפורמציה הנכונה של ערוץ KvAP בשלפוחית. <br /> הנתונים הקודמים שלנו קבעו כי המוטציה ציסטאין (L125C/C247S) KvAP אחד, כאשר משולבים כראוי בbilayers, הוא קבור באופן מלא בממברנות, ולא ניתן להגיע על ידי חומרים כימיים ציסטאין ספציפי 8. הליכי הכינון מחדש נבדקו עם ערוץ מוטציה זו, וטופלו על ידי מגיב Cys ספציפי, MTS-PEG5000. השינוי בL125C עם 1.0 מיקרומטר MTS מגיב בטמפרטורת החדר מציג משמרת 5kDa ללהקת KvAP בג'ל-SDS nonreducing. יישום מוצלח של נהלי הכינון מחדש שלנו צריך להוביל לשום תגובה לגילוי עבור ערוצי מוטציה L125C בממברנות פוספוליפידים, דבר המצביע כניסה של כל הערוצים בbilayers כמעט מלאה. כביקורת חיובית של התגובה, 5.0 מ"מ DM הוא הציג לעיבוד כמעט בכל שאריות L125C בערוצי מוטציה הנגישים למגיב MTS.
    לחלופין, רעל נקבובית מחייב, כגון chrybdotoxin, ניתן להשתמש בו כדי לספור את ערוצי tetrameric. מחייב המבוסס על הנוגדן כאומרים (ראה תיבה 2, שם Fv הוא מוכן כמו ליגנד קונפורמציה ספציפי לKvAP) עשוי לשמש כדי לכמת את אתרי הקישור הזמינים בשלפוחית ​​המשוחזרת. לאחר מכן ניתן להשוות מבחני אלה מחייבים עם assay כמותית מדידת חלבון סך הכל כדי להבין איזה חלק מהערוצים המשוחזרים הוא tetramers ומה חלק של החלבון יש ההנעה מתח החיישן (S3/S4 של חיישן המתח) כראוי מקופל.
    לחלבונים אחרים כדי לבנות מחדש, מומלץ להציג את שיטה הכמותית להעריך איזה חלק של החלבונים המשוחזרים מקופל כמו שצריך. בדיקה פונקציונלית זהירה היא אפוא תנאי הכרחי לפיתוח בקרת איכות טובה לכינון מחדש מוצלח.

3. יישומים של שלפוחית ​​המכילה ערוץ מחדש

3.1. מחקר פונקציונלי של פעילות ערוץ יון בממברנות שומנים בדם שחורה.

הכנת nחומרי eeded.

  1. הכנת שומנים בדם
    1. יש לנקות את זכוכית מבחנה, בקבוקון ענבר עם כובע בורג טפלון על פני השטח, וקבוצה של מזרקים זכוכית עם כלורופורם. ייבש את בקבוקון הענבר תחת זרם של גז ארגון.
    2. העברת 0.75 מ"ג אפיפיור ו0.25 מ"ג POPG בכלורופורם לתוך בקבוקון הענבר ולהתאדות כלורופורם עם גז ארגון.
    3. שטוף את השומנים המיובשים עם 0.20 פנטן מ"ל, ויבש לחלוטין כדי להסיר כלורופורם שיורית. לבסוף לפזר את השומנים ב50 decane μl. את השומנים בdecane (20 מ"ג / מ"ל) ישמשו לציור bilayer שומנים על פני חור מיקרון 150-250 (איור 3) נקדח בחלק דליל בצד אחד של כוס bilayer ניסיונית (איור 3 א).
  2. הכנת פתרון
    1. פתרון תאי (טראנס): 10 HEPES / Koh, pH 7.4, 15 מ"מ KCl מ"מ
    2. פתרון תאי (CIS): 10 HEPES / Koh, pH 7.4, 150 מ"מ KCl מ"מ
    3. מלח גשר: נד זכוכית נימיםלגשרים בצורת U, ולמלא אותם עם 1.0% אגר מותך מומס בתמיסת חוץ תאית.
      השיפוע האוסמוטי הוקם בין פתרונות טרנס ומדינות חבר העמים נמצא להיות כוח המניע העיקרי לאיחוי שלפוחית ​​על bilayer השומנים 17. לשומנים טעונים שלילי, 15 מ"מ CaCl 2 או פפטידים פולי-ארגינין מטען חשמלי חיובי שנמצאו כדי להיות מסוגל לגרום לאירועי היתוך. שומני Fusogenic, כגון DOTAP וכלבים, וכו ', יכולים להיות מוחדרים לשלפוחית ​​השומנים בדם, כך שהסיכוי של אירועי היתוך הוא גבוה יותר.

הקלטות חשמל מערוצי KvAP בbilayers השומנים

  1. טרום לצבוע את החור העגול (קוטר 0.25 מ"מ ~) שקדח בשטח הגלילי בגביע bilayer (איור 3). השומנים מועברים עם העלי נימים שהוא עשה במעבדה. הראש העגול של העלי הנימים הוא מלוטש ולא לגרד את פני השטח של הכוס. הכמות קטנה של שומני דואר הנישאים על ידי את העלי הנימים היא התפשטה סביב החור בכוס bilayer, ואוויר יבש.
  2. חכה ל1-2 דקות, כך שdecane יתאדה לחלוטין. יש להקפיד להימנע מפתרון השומנים מלהיכנס לחור.
  3. הכנס את הכוס לתוך תא ההקלטה, ולשים בגשרי מלח ולחבר את האלקטרודות לשני הצדדים של כוס ההקלטה (איור 4 א). הוסף פתרון טרנס לשני הצדדים של החור והסיס. שיפוע האוסמוטי הוא הוקם כדי להקל על שילוב של שלפוחית ​​לbilayer השומנים.
  4. התאם את הפוטנציאל לקזז בין שני צדדים של הכוס ל~ 0 (בדרך כלל <2 מיליוולט). השתמש את העלי הנימים להעביר כמות קטנה של תערובת שומנים בdecane, ולצייר את השומנים על פני החור עד לקבלת קרום bilayer. היווצרות bilayer הוא זוהה על ידי ההקלטה הנוכחית הקיבול במהלך הלידה של דופק רמפה.
  5. חכה עד שהקרוםמדלל החוצה והופך להיות יציב יחסית. אנחנו מחכים עד שאין יותר שינוי בקיבול הקרום ל3-5 דקות.
    החשיבה הכללית על פני bilayer מישוריים יצר חור גדול היא שהחלק מאוד אמצע הקרום קרוב ללהיות ~ 4.0 ננומטר עבה כbilayer רגיל, והקרום הפך עבה יותר כאשר הוא מקבל קרוב לקצו של החור, שבו יש סביב annulus ורוב ממס decane הוא 18, 19. זה בלתי נמנע שיש decane שיורי השאירו בחלק bilayer המרכזי של הממברנה. ההערכה האחרונה של יחס הנפח של N-decane מול מחשב הייתה 0.35-0.45 לאחר הדילול של bilayer 18, 20-22. EM בחינת bilayer דליל הראתה כי היו עדשות decane הדחוקות בין שני העלונים של bilayer 22. נתונים אלה הציעו שהחלבונים בממברנה הוכנסו בקרום bilayer השומנים לדור בכפיפה אחת עם איים זעירים (עד 50 ננומטר בקוטר) של decane. Decane שיורייn bilayer גם מקטין את קיבולת החשמל הקבועה ל0.4-0.5 μF / 2 ס"מ, שניתן להשתמש בו כדי לקבל הערכה גסה של גודל bilayer דליל המבוסס על הקיבול שנמדד. Bilayer של קיבול pF 100 מגיע מקרום bilayer מעגלי של ~ 180 מיקרומטר בקוטר.
    לKvAP, decane שיורי לא לפגוע gating מתח התלוי שלו, למרות שתפקוד הערוץ לא נבחן בקפידה בbilayer חופשי ממס. אותו הופיע להיות אמיתי עבור ערוצי NaChBac וKv1.2 הערוצים מוכנסים לתוך BLMs 23. זה עדיין לא ברור אם שמאל השינוי המשמעותי של עקומת GV נמדדה מKv1.2 ערוצים בביחס bilayer decane השומנים לערוצים בביציות יש משהו לעשות עם decane שיורי 23. בהתאם לשומנים המשמשים בגיבוש bilayers, כמות decane השייר בbilayer עשויה להשתנות. לדוגמה נמסר כי היווצרות של membr שומנים מישורייםanes של MGDG (מונו galactosyl-diacylglycerol) דורש decane, ככל הנראה בשל הסדקים בין MGDG חרוטי להיות מלא עם מולקולות decane. בין אם decane שיורי יש השפעות על החלבונים כדי להיחקר הוא אך ורק אמפירי, ויש צורך בבדיקה הניסיונית לדעת אם ההשפעה היא משמעותית או לא.
  6. ברגע שהופך את הקרום יציב, לירות 0.5-1.0 ערוץ המכיל שלפוחית ​​על ידי מיצוב בסדר סוף קצה P2 פיפטה-ממש מעל חור μl. שלפוחית ​​לנפול מעבר לחור בתחתית הכוס.
    במהלך תהליך זה, שלפוחית ​​מרובות נקשרה אל הקרום על פני החור. בהינתן מספיק זמן, חלקם התמזגו לתוך חלק bilayer, כך שמספר קטן של ערוצי KvAP מוכנסים כראוי לתוך bilayer מישוריים בחלק המרכזי של הממברנה. גם שיפוע האוסמוטי ואינטראקציה אלקטרוסטטית הם חשובים באיחוי של שלפוחית ​​ל17 bilayers השומנים בדם, 24.
  7. כדי לבדוקערוצי KvAP בbilayer, דופק של 80 mV קצר מועבר מפוטנציאל החזקת -80 mV. בשל איון המהיר והתאוששות איטית מאיון, הפסקה ארוכה (~ 120 שניות לערוצים בממברנות PE / PG) הוא נתון בין שתי פעימות. הקלטה נוכחית טיפוסית מן הערוצים בקרום אפיפיור / POPG הוא הראה באיור 3 ג. אם הנוכחי הוא קטן, לירות שלפוחית ​​יותר. ברגע הנוכחי נראה טוב בגודלו, לאזן את ריכוזי יונים בפתרונים משני צידי הממברנה. הערוצים מוכנים לניסויי אלקטרו.

3.2. הקרנה עבור ligands קונפורמציה ספציפי נגד ערוצים בשלפוחית

  1. מבוא של ספריית הפאג-מוצגת.
    הפאג-מוצג ספריית פפטיד 20-mer היא נוכחת בN-הסופית של של חמישה עותקים של חלבוני PIII בקצה אחד של bacteriophage פילמנטיות FD-ט 25. הספרייה מציגה כ. 1 X 10 8 שוניםסוגי ent של רצפי פפטיד 20-mer אקראיים, וחביבות שנמסרה לנו ע"י מעבדתו של ד"ר בראון Kathlynn ב UT Southwestern Medical Center 26. זיהום הפאג לתוך E. coli K91 הופך את החיידקים עמידים עד 12 מיקרוגרם / מיליליטר טטרציקלין.
    נוהל מפורט לתרבות החיידקים, ההגברה וTitering של phages והרצף של מושבות הפאג כבר תוארו על ידי מקגווייר, et al. 26 אנו נותנים תיאור של פעולות הבסיסיות שבסעיף הבא קצר. הקוראים יכולים למצוא פרטים נוספים בנייר מקגווייר. אנחנו יהיו במקום להתמקד בבידוד של שיבוטים ספציפיים שקושרים בחוזקה לתעלות היונים מחדש בשלפוחית ​​(איור 4 א).
    הרעיון הבסיסי מאחורי המסך שלנו הוא שניתן משך מטה את phages מאוגד הערוצים המשוחזרים במיוחד עם שלפוחית. הפאג המאוגד יכול להיות מוגבר ונבדק נגד הערוצים בממברנות שומנים בדם. המחקר שלנושינויי קונפורמציה של חיישני מתח KvAP בממברנות שומנים בדם שונים 8 הראו שזה אפשרי כדי לשמור על המתח בחיישנים או "פעיל" או מדינות "מנוחה" על ידי מעבר השומנים מפוספוליפידים רגילים לאלה שאינם מכילים פוספטים באזורי headgroup (DOTAP וכלבים בניסויים שלנו). שתי תצורות שומנים שנקבעו אלה מנוצלות בהקרנה של ligands קונפורמציה הספציפי שלנו. ספריית הפאג הראשונה תהיה רוויה בערוצים בשלפוחית ​​פוספוליפידים (סלקציה שלילית) לפני שנבחרה לקלסרים הדוקים לערוצים בממברנות כלבים (סלקציה חיובית) DOTAP ו.
  2. נהלים בסיסיים העומדים מאחורי בחירת הפאג
    צמיחה של חיידקי K91 במדיום LB: זמן ההכפלה של החיידקים היא בערך 20 דקות בשעה 37 ° C עם 200 סל"ד רועד.
    הגברה של הספרייה: מערבבים את פתרון הפאג עם חיידקי K91 בOD0.4. לאחר הדגירה 15 דקות בשעה 37מעלות צלזיוס, התערובות מפוזרות באופן שווה על גבי -9.5 9.5 2 צלחות אגר אינץ' המכילות 12 מיקרוגרם / מיליליטר טטרציקלין, השימוש בצלחות גדולות מונעת את הדומיננטיות של התרבות על ידי חיידקים שיש להם גידול בשיעור גבוה יותר. ברגע שהגיוון של הספרייה קטן, צלחות פטרי של 10 ס"מ המשמשות לבחירה והגברה בקנה מידה קטנה.
    הגברה בקנה מידה גדולה של שיבוטים בודדים: לחסן aliquot קטן של phages (~ 100 מיליון) לתוך LB 250 מ"ל בתוספת 5 מ"מ MgSO 4 ו -12 מיקרוגרם / מיליליטר טטרציקלין, לגדול לילה בשעה 37 ° C. איסוף תאים על ידי ספין סל"ד 6000 למשך 10 דקות. לאסוף את supernatant ולהוסיף לתוכו 0.2 כרך / כרך חיץ הממטרים (2.5 M NaCl, 20% PEG8000). לאחר דגירה על קרח למשך 1.0 שעות, צנטריפוגה הפתרון ב17,000 XG למשך 30 דקות לכל גלולה phages. הסר את כל supernatant, להוסיף 1.0 מיליליטר PBS, דגירה על קרח למשך 30 דקות, בעדינות resuspend את הכדור (לא vortexing). מעבירים את ההשעיה לצינור טרי, ו צנטריפוגות ב 14,000 סל"ד במשך 2 דקות. מעבירים את supernatant לצינור אחר, ודגירה ב65 ° C אמבט מים במשך 15 דקות כדי להרוג את כל החיידקים. צנטריפוגה הצינור למשך 2 דקות ב13,000 סל"ד. זורק את הכדור, aliquot ולאחסן את פתרון הפאג ב -80 ° C.
  3. צילום פנורמי של phages נגד ערוצי KvAP בשלפוחית ​​שומנים.
    1. לפאגים מוצגות-פפטיד צריכים להיות מוגבר וtitered לפני הניסויים שלנו, כך שמספר phages ליחידת נפח ידוע. KvAP הורכב מחדש לאפיפיור / POPG (3:1) בתוספת שלפוחית ​​ביוטין-סמים 0.50% כביקורת שלילית, ולכלבים: ביוטין-DOPE (199:1; אותו נעשה לDOTAP שלפוחית) משמש כמטרה הבחירה. הריכוז הסופי של KvAP בשלפוחית ​​הוא 0.50 מ"ג / מ"ל, והשומנים הם 5.0 מ"ג / מ"ל. חיץ פנורמי הכיל 500 מ"מ KCl, 100 HEPES מ"מ / KOH pH 7.4, ו0.10 מ"ג / מיליליטר BSA.
      לריצה הראשונה, 10 ~ 10 phages (לכל סוג 100 עותקים) היו מדולל ל0.050 מדיום LB מ"ל. לשלבים הבאים צילום פנורמי, רחובהפאג arting הותאם להיות במרחק של 10 יוני - 10 אוגוסט.
    2. סלקציה שלילית:
      דגירה phages המדולל ב50 LB μl עם 100 חרוזים agarose μl NeutrAvidin (מסוגל מחייב מ"ג BSA 1-2 biotinylated לכל מ"ל של שרף; פירס) ב 1.0 חיץ פנורמי מ"ל. לאחר הדגירה 10 דקות, להפריד את החרוזים על ידי ספינינג אותם ב 100 XG במשך דקות 1.0. חזור על פעולה זו פעמיים כדי להסיר כל phages אשר נקלטות ישירות לחרוזים.
      מערבבים את phages שמאל למעלה מהשלב הקודם עם 50 שלפוחית ​​ריקה μl (אפיפיור / POPG בתוספת של 0.5% ביוטין, סמים) שאינו מכיל חלבונים. הוסף 100 חרוזים NeutrAvidin μl שנשטפו עם חיץ פנורמי לתערובת הפאג-השלפוחית. לאחר הסיבוב את התערובת בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות, הסר את החרוזים על ידי ספין XG 100 במשך 30 שניות. צעד זה חוזר על עצמו לשלפוחית ​​ריקה של כלבים: ביוטין, סמים (199:1), כמו גם לערוצי KvAP בשלפוחית ​​אפיפיור / POPG (עם 0.5% ביוטין, סמים). Supernatant לאחר טיפולים אלה contaiNS-פינה מלא phages. אחרי שני מחזורי המסך הראשונים, preclearance יכול להתבצע אך ורק כנגד KvAP בשלפוחית ​​אפיפיור / POPG.
    3. סלקציה חיובית
      דגירה phages מלוא פינה עם ערוצי KvAP בכלבים: ביוטין, סמים (199:1) שלפוחית ​​(זהה לשלפוחית ​​DOTAP) בנוכחותם של 100 חרוזים NeutrAvidin μl בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. תביא את הנפח של התערובת עד 15 מ"ל באמצעות חיץ צילום פנורמי לפני צנטריפוגה XG ב 100 במשך 10 דקות. לאסוף את החרוזים, ולשטוף אותם שלוש פעמים עם חיץ 45 מיליליטר צילום פנורמי.
    4. Resuspend את חרוזי 500 מדיום LB μl המכיל 5.0 מיקרוגרם / מיליליטר ביוטין, ו דגירה את התערובת בטמפרטורת חדר למשך שעתיים על מנת לשחרר חלק מphages הכפות מNeutrAvidin, שבו יש זיקה נמוכה יותר מאשר ביוטין הילידים. הפרד את החרוזים על ידי ספין XG 100 במשך דקה אחת. לאסוף את supernatant ואת החרוזים לשני צינורות שונים לTitering.
    5. כדי להגביר את phages הנבחר, מ 'μl 200 IX של supernatant או חרוזי resuspended בשלב האחרון עם 500 תרבות חיידקי μl K91 (OD600 ~ 0.4-0.6, תרבותי ~ 4 שעות לפני שימוש בה). לאחר דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, צלחת μl 50 של כל על צלחות טטרציקלין לתרבות הלילה.
      במהלך שני מחזורי המסך הראשונים (איור 4 א), לאסוף את כל supernatant μl 500 ואת החרוזים מהשלב האחרון, לערבב אותם עם תרבות חיידקי 5 מ"ל, וצלחת אותם בצלחות מרובעות 9.5 אינץ כדי להתאושש ולהגביר את כל מושבות phage . שלב זה חשוב לשחזור אלה phages שהופכים את החיידקים לגדול לאט יותר מאחרים.
    6. המושבות מהצלחות הם מוגבר וtitered לפני המחזור של צילום פנורמי ובחירה (ראה מקגווייר, et al., 26) הבא.
    7. לבחון את פעילותם של phages חיובי שנבחר בערוצים.
      אחרי 10-12 מחזורים של בחירה, לבדוק את phages המוגבר המוחלט על ערוצי KvAP בBila שומנים בדםyers עשוי מאפיפיור / POPG. אם יש חלק משמעותי של שיבוטים חיוביים, phages הנבחר ב100-500 ננומטר צריך לחסום חלק משמעותי של ערוצים בbilayer (איור 4) כפי שהיינו בחירה נגד ערוצי התייצבות במצב המנוחה. הנתונים החיוביים מצביעים על כך שיש שיבוטים כי יראו חזק מחייבת לערוצים במצב המנוחה. אחרי 16 מחזורים של בחירה, לבחור 50 מושבות חיוביות עבור סידור חד מושבה. השיבוטים phage שולטים המזוהים נבחרים מהשוואת הרצפים, והם מוגבר ונבדקו נגד ערוצים בbilayers. ברגע שהשיבוטים החיוביים הם אישר, לסנתז את הפפטידים שבוצעו על ידי השיבוטים החיוביים החזקים ולבדוק אותם בערוצים כמו גם לאישור פעילות קונפורמציה הספציפיות שלהם.

3.3. התגבשות של ערוצי KvAP בממברנות לקביעת מבנה 27-29

  1. כדי לייצב את הקונפורמציה שלערוץ, קלסר קונפורמציה ספציפי של הערוץ, חלבון Fv 33H1, משמש ליצירת מורכבת KvAP / FV. ההכנה של חלבון Fv היא מפורטת בתיבה 2. לטהר את המתחם בעמודת 200 Superdex. את elutes המורכבים בסביבות 11.4 מ"ל במערכת שלנו.
  2. למסך הראשוני, מערבב את החלבון עם DMPC או POPC שsolubilized לחלוטין בDM או β-OG. תערובת חלבונים / שומנים / חומר ניקוי היא מעורבת במשך יותר מ 15 שעות כדי להגיע לשיווי משקל תרמודינמי בהפצה של שלושת המרכיבים בקרב מיצלות המעורבות. בדרך כלל אנחנו ראשון לבדוק שלושה יחסי שומנים / חלבון שונים (LPR = 0.5, 1.5, 2.5) ושלוש רמות חומציות שונות (6.0, 7.0, ו -8.0). חיץ הדיאליזה מכיל 20 מ"מ חיץ K-פוספט, KCl 100 מ"מ, ו3.0 מ"מ NaN3. חיץ הדיאליזה משתנה כל 2-3 ימים. Aliquot קטן של הגבישים נלקחים החוצה כל 2-3 ימים כדי לבחון את היווצרות שלפוחיות והופעה האפשרית של סריג הגבישי.
    רשימת צהובוןשל LPR משמש לעומת pH כדי לקבוע את אופן הפעולה של החלבון בשני הסוגים השונים של שומנים. אנחנו רוצים להשיג שלפוחית ​​גדולה יחסית בגודל (יותר מ 150 ננומטר) או גיליונות בממברנה כאשר דגימות הדיאליזה נבחנות על ידי שלילי הכתם EM. דפוס קבוע קטן בקרום מרמז ללהיט ולשמש מדריך אופטימיזציה נוספת.
    EM-כתם שלילי: רשתות נחושת מצופות בסרטי פחמן (~ 3-5 ננומטר עובי) הן זוהר השתחרר באוויר כדי להפוך את פני השטח הפחם הידרופילי. נפח קטן (2-3 מיקרוליטר) של ההשעיה הגבישים נטען על גבי משטח הפחם, וטופחו במשך 0.5-1.0 דקות. למחוק את הרשתות מהצד עם קצה קרוע של פיסת נייר סינון # 4 Whatman. להעיף את הרשת ודגירה אותו ל~ 15 שניות על החלק העליון של ירידה של פתרון מכתים microliter 150 (2.0% עד הורים / KOH, pH 8.0 במים בתוספת של 0.5% trehalose, או 6.0% אמוניום molybdate / KOH, pH6.3-6.5 , במים בתוספת 0.5-1.0% trehalose). כתם ככל האפשר מהפתרון לאהוא משטח רשת, ויאפשר לרשת לייבוש לפני הכנסתו לTEM לבדיקה. תמונות של שלפוחית ​​נלקחות בתנאי במינון נמוך, כדי למנוע את נזק מכל אריזת גבישים על ידי האלקטרונים.
  3. המסך לאחר מכן התרחב לבחינת צעדים קטנים יותר של LPR כדי להגיע LPR נכון. אם את החלבונים מתאימים להתגבשות, סריג קטן של חלבונים בקרום עשוי להיות גלוי. סביב תנאים ראשוניים אלה, להמשיך לייעל את ההתגבשות על ידי שינוי סוגי מלח וריכוזים, הטמפרטורה, מהירות ושיטות של הסרת חומרי ניקוי, קטיונים דו ערכיים, חומרי ניקוי המשמשים להכנת החלבונים, מזרזים, הרכב שומנים וכו '
    את גבישי 2D אופטימיזציה של KvAPΔ36/Fv מורכב לגדול לתוך גיליונות גדולים שנעים בין כמה מיקרונים ל20-30 מיקרון (איור 5 א). בתנאי cryoEM, הגבישים להראות סריג כיכר ברור עם סימטריה פי ארבע ברורה כפי שמצופים מהסימטרי צ'אן פי ארבעהnels (איור 5 ו-C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הזרימה הכללית של הניסויים לטיהור ערוץ KvAP להומוגניות ביוכימי מתוארת באיור 1 א. דוגמאות טיפוסיות במהלך הביטוי והטיהור של החלבון הראתה בג'ל-SDS באיור 1. החלבון לאחר טיהור iMac הוא טהור יחסית. התשואה של ערוץ KvAP היא מ"ג על 1.0 / תרבות ליטר.

Solubilization של שלפוחית ​​שומנים עם חומרי ניקוי צריך להיות עבד לכל זוג של שומנים בדם לעומת חומר ניקוי. Solubilization של שלפוחית ​​unilamellar קטנה של אפיפיור / אפיפיור על ידי DM מוצג באיור 2 א, את התוצאות משלפוחית ​​הציפה הן בדרך כלל פשוטים למדי. תוצאות אופייניות בassay-SDS של שברים מההדרגות הראו באיור 2. בשיפוע צפיפות סוכרוז, שלפוחית ​​האפיפיור / POPG המכיל ערוצים בדרך כלל מרוכזת בממשק שבין שכבת 10%ד 35% שכבה. שלפוחית ​​DOTAP או כלבים המכילה KvAP הם קלים יותר, ובדרך כלל ב% ממשק Tween 5 ו -10% (מעט חדר לתוך שכבת 10%). אם יש חלק משמעותי של שלפוחית ​​multilamellar, הם בדרך כלל הם לבנבן ומרוכזים מתחת לממשק 10-35%. מצאנו שזה קורה בדרך כלל כאשר תערובת חלבונים חומר ניקוי השומנים לא טופחה מספיק זמן כדי להגיע לחלוקה טובה של השומנים.

הקלטות חשמל מערוצי KvAP שולבו בbilayers שומנים מישוריים מוצגות באיור 3. העקבות טיפוסי הנוכחית מראה כי ב -80 mV, הערוצים הם שקטים. מעבר ל80 mV מוביל לשיא קיבול מהיר (החד אחד בזמן של מתח מיתוג). שלב עלייה איטי של נוכחי מצביע על כך שהערוצים להיות פעילים ומסוגלים להוליך זרם אשלגן החוצה. לאחר שיאו של השלב עולה, הזרם מתחיל לרדת, צעד בשם איון. Inactivatiבלוקח כמה מאה אלפיות שנייה כדי להשלים. ברגע שהמתח עבר חזרה ל-80 mV, יש שלב חוזר אחרי שיא הקיבול כלפי מטה, המשקף את סגירת הערוצים הפתוחים והוא נקרא שחרור משרות (איור 3 ג).

באמצע מסך הפאג, בדקנו את הפעילות של phages המוגבר בערוצי KvAP בbilayers של אפיפיור / POPG. לאחר 12 מחזורי בחירה, phages המוגבר עכבות פעילות הערוץ (איור 4, הפאג נבחר). אבל-מוצגת הפאג הספרייה מתחילה לא הראתה כל השפעה על הערוצים (איור 4, בקרת הפאג). למרות שהפעילות של phages הנבחר לא היו גבוהה מאוד, משום שרק ריכוז נמוך של phages החיוביים היו בסביבה, ההשפעות ברורות, לשחזור הציעו כי יש שיבוטים פעילים, חיוביים שמפגינים זיקה גבוהה מחייב, צריך להיות מועשר באופן סלקטיבי CY הקרנה שנותרcles והעשיר פעם אחת, סביר להניח שיש לי פעילות המעכבת חזקה בערוצים בקרום.

בשלב המוקדם של הקרנת גבישי 2D, ראינו סריגים קטנים בשלפוחית ​​קטנה רבות. עם אופטימיזציה, כמה גיליונות גדולים הופיעו עם הרבה שלפוחיות קטנות סביב (איור 5 א). את תמונות cryoEM של גבישים אלה תמיד הראו הרבה פגמים מקומיים (איור 5), המצביעים על כך אופטימיזציה נוספת נדרש כדי להשיג גבישים טובים יותר. ברגע שאת הגבישים היו מותאמים היטב, הם הציגו קצוות חדים, והופיעו כגיליונות בודדים. בהגדלה גבוהה, היחידות הבודדות באופן ברור הרבה יותר טוב הורה (איור 5 ג).

שם מגיב / חומרים חברה מספר קטלוגי תגובות
Tryptone RPI קורפ T60060
תמצית שמרים RPI קורפ Y20020
NaCl דיג S271-3
טריס בסיס RPI קורפ T60040
אשלגן כלורי דיג BP366-500
N-β-dodecyl-D-Maltoside Affymetrix D322S סול בדרגה
N-β-octyl-D-glucoside Affymetrix O311 אנה בדרגה
Aprotinin RPI קורפ A20550-0.05
Leupeptin RPI קורפ L22035-0.025
Pepstatin RPI קורפ P30100-0.025
PMSF P7626
אני DNase רוש 13407000
יו חרוז SM-2 ביו רד 152-3920
HEPES RPI קורפ H75030
אפיפיור יפידים אוואנטי פולאר 850757C
POPG יפידים אוואנטי פולאר 840457C
כלבים יפידים אוואנטי פולאר 870314C
DMPC יפידים אוואנטי פולאר 850345C
ביוטין-DOPE יפידים אוואנטי פולאר 870282C
DOTAP יפידים אוואנטי פולאר 890890C
NeutrAvidin אגאחרוזים ורדים Piercenet 29200
צינורות דיאליזה ספקטרום מעבדות, Inc 132-570
פנטן דיג R399-1
Decane TCI אמריקה D0011
MTS-PEG5000 כימיקלים מחקר טורונטו M266501

טבלת מס '1. רשימה של חומרים כימיים וחומרים.

  • תרבות חיידקים רועדת חממה
  • ספקטרופוטומטר
  • sonicator מיקרו חללית
  • כסא נדנדה
  • צנטריפוגות רצפת מודל לאיסוף תרבות חיידקים ועבור דגימות ריכוז
  • עמודות ריקות
  • טור Superdex 200 מחובר למערכת FPLC

טבלת 2. ציוד דרוש.

שם חיץ תוכן
מאגר תמוגה IMAC 50 מ"מ טריס (pH 8.0), 100 מ"מ KCl
חיץ לשטוף IMAC 50 מ"מ טריס (pH 8.0), KCl 100 מ"מ, ו5.0 מ"מ DM
מאגר elution IMAC 50 מ"מ טריס (pH 8.0), 100 מ"מ KCl, 5.0 מ"מ DM, ו300 מ"מ imidazole
חיץ SDS-מדגם (5X) (nonreducing) 60 גליצרול מ"מ טריס-HCl (pH 6.8), 25%, 2.0% SDS, 0.10% כחול bromophenol. (1.0% 2-mercaptoethanol הוסיף לעשות חיץ הפחתה).
לערום חיץ ג'ל ל- SDS (4X) 0.50 מ 'טריס-HCl (pH 6.8), 0.40% SDS
חיץ הרזולוציה ג'ל ל- SDS (4X) 1.5 מ 'טריס-HCl (pH 8.8), 0.40% SDS
FPLC equilibמנה 20 מ"מ טריס pH 8.0, KCl 100 מ"מ, ו5.0 מ"מ DM
הדיאליזה liposome 10 HEPES מ"מ, 100 מ"מ KCl

לוח 3. שם המאגר ותכולתו.

איור 1
איור 1. הכנת KvAP לכינון מחדש. זרימה. כללית עבודה של חלבון ביטוי, טיהור וכינון מחדש. טיהור ביוכימית ב 'של החלבון. תרבות מושרה של א ' KvAP להביע כחול XL1 coli היה מעובד וKvAP מטוהר. עשרים מיקרוליטר של תרביות תאים לפני (מסלול 1) או אחרי (מסלול 2) אינדוקציה, תמצית חומר הניקוי (מסלול 3), זרימה דרך מכרומטוגרפיה IMAC (מסלול 4), שתי שטיפת מדרגות (נתיבים 5.6), ו5.0 מיקרוגרם בסך הכל חלבון לאחר300 מ"מ imidazole elution (מסלול 7) ו5.0 מיקרוגרם של KvAP tetramer מתוך הרחקת הגודל FPLC (מסלול 8) היו נתונים לאי הפחתה-12%-SDS וכתמי כחולי Coomassie.

איור 2
איור 2. כינונה מחדש של KvAP בשלפוחית ​​אפיפיור / POPG. היתוך. שלפוחיות וsolubilization כפונקציה של ריכוזי חומרי ניקוי. הספיגה ב 410 ננומטר שימש כדי לפקח על פיזור האור של שלפוחית ​​(בסיס מופחת לשום שבריר חומר ניקוי). שומנים (אפיפיור / POPG 3:1) היו 10 מ"ג / מ"ל. שלפוחית ​​unilamellar קטנה לאחר sonication החזק, ויש לו monodispersed פיזור חלש בשל הגדלים של 30-50 ננומטר בקוטר שלהם. כאשר הוכנסו חומרי הניקוי, הם חילקה בין שלב ושלב פתרון הקרום השומני. בשל העקמומיות החזקה בקטן שלפוחית ​​unilamellar, איחוי שלפוחית ​​הדק חומרי ניקוי והציג את שחרורו של העקמומיות (ובכך האנרגיה פוטנציאלי משטח הנמוך). שלפוחית ​​התמזגו גדולה יותר בגודלו ולהראות פיזור חזק יותר ב410 ננומטר. השלב העולה של השיא (אזור בצבע אפור) ולכן משקף את ההיתוך-Induced חומרי ניקוי, משטר טוב לחלבון היתוך micelle אל שלפוחית. הריכוז של חומר הניקוי (DM כדוגמה כאן) ממש בשיא הספיגה נבחר אכן לתהליך הכינון מחדש שלנו. ב חמישים מיקרוליטר של שלפוחית ​​KvAP המשוחזרת (KvAP 0.5 מ"ג / מ"ל) היה מופרד על ידי שיפוע צפיפות סוכרוז. דוגמאות של השברים μl 100 מלמעלה למטה (1 ~ 9) של שיפוע סוכרוז היו assayed ב12% הפחתה-SDS. ג'ל היה מוכתם כחול Coomassie. ליין 3 הכיל ~ KvAP מיקרוגרם 2.

/ Files/ftp_upload/50436/50436fig3.jpg "/>
איור 3. פעילות חשמלית של ערוץ KvAP בbilayers המשוחזר. א הקלטת הגדרה בתוך כלוב פאראדיי, 1; שתי אלקטרודות, 2; לוואי טרנס, 3; לוואי cis, 4; גשר מלח. ב 'סעיף של החלק דליל מוגדל בצד אחד של כוס bilayer מראה חור 5 , המשמש להכנת ממברנות. פעילות חשמלי ג של ערוצי KvAP שהתמזגו לתוך הקרום השומני השחור נרשמה. בזמן שהוא החזיק ב -80 mV, פוטנציאל הקרום היה פעמה עד 80 mV עבור 150 אלפית שנייה, ולאחר מכן שינה בחזרה לפוטנציאל ההחזקה. הנוכחי היוני נרשם במצב מתח המהדק באמצעות מגבר 200B Axopatch.

איור 4
איור 4. הקרנה עבור conformatiligands בספציפי מספרייה הפאג-מוצגת. . תכנית מאחורי ההקרנה נגד תעלות יונים מחדש בשלפוחית. שלפוחית ​​היא מסוממת עם יוטין, סמים, והם יכולים להיות שלף של פתרון על ידי חרוזים NeutrAvidin. קונפורמציה של ערוץ KvAP נשלטת על ידי שומנים מסוימים. בחירות שליליות נגד חרוזים, שלפוחית ​​ריקה ושלפוחית ​​עם ערוצים בקונפורמציה שונה נעשות לפני phages מודגרת עם הערוצים במדינת היעד (קונפורמציה בDOTAP או כלבים כדוגמה כאן). יכולים להיות מוגבר לפאגים שנבחרו ונבדקו נגד ערוצים בbilayers. בדיקה ב 'של phages הנבחר באמצע המסך. פעילות חשמלית של KvAP בbilayer בנקודות זמן שונים לאחר התוספת של phages הנבחר: הקורט שחור - לפני התוספת; עקבות צהובה - 2 דקות לאחר; עקבות אדומות - 10 דקות לאחר התוספת למעלה: ספריית הפאג מתחיל (סה"כ. ~ 10 10 phages הוסיףלbilayer) נבדק על ערוצים בbilayer, ונמצא כי אין פעילות לזיהוי, כי יש כל שיבוט הפאג תחתון רק כ -100 עותקים:. לאחר 12 מחזורי בחירה, phages עדיין היה תערובת של שיבוטים שונים. הוספה כ 10 10 phages לערוצים בbilayer להוביל לעיכוב ברור של פעילות ערוץ, מה שמרמז שיש שיבוטים חיוביים שיש להם זיקה גבוהה. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 5
איור 5. התגבשות דו ממדים של KvAP בממברנות. תמונת א 'של לרעה גבישי 2D מוכתמים שכבה אחת באמצע הגביש אופטימיזציה. את הגבישים הוכתמו 6.0% אמוניוםmolybdate, pH 6.4 בתוספת 0.50% trehalose. בשל הסוכר, לפעמים הם נערמים אחד עם השני. תיבת הריבוע השחורה מייעדת שטח שמעורר דפוס העקיפה שמוצג בצד ימין עם כתמי עקיפה הולכים ~ 20 א. תמונה ב CryoEM של גביש 2D ממדגם דומה לזה המשמש ב(). הדגימה הייתה מעורבב עם 3% trehalose והוקפאה על ידי צולל ישיר, וצלמה מתחת cryoEM. התמונה הושגה ב50,000 x. היה ברור כי נפלו פגמים מקומיים באריזת הגביש. תמונת ג CryoEM של גביש נוסף מותאם. הדגימה הייתה מוטבעת בטאנין% 0.75 ו 10% trehalose והתמונה צולמה ב50,000 X. הקווים הישרים והאריזה ההדוקה הציעו כי הערוצים נצטוו גם בסוג זה של גבישים זה. שני החיצים השחורים לסמן את הסריג המרובע.

תיבות:

תיבת 1. הכנת עמודת IMAC

  1. Resuspend שרף IMAC ביסודיות.
  2. מייד להעביר את הכמות הנדרשת של שרף בהשעיה לצינור 50 מ"ל. אנו משתמשים בנפח 2 מיליליטר מיטה של ​​שרף לטיהור של KvAP מתרבות L 2.
  3. צנטריפוגה את הצינור ב XG 700 במשך שתי דקות עד גלולה למטה השרף.
  4. להסיר ולסלק את supernatant.
  5. הוסף 10 כרכי מיטה של MQH 2 O ולערבב בקצרה לשטוף את השרף.
  6. Recentrifuge ב700 XG במשך 2 דקות לגלולה את השרף. בטל supernatant.
  7. הוסף 10 כרכי מיטה של MQH 2 O ויוצקים לתוך עמודה ריקה.
  8. חכה עד שהשרף נרגע, ולסגור את הטור עם מתאם זרימה לכרומטוגרפיה נוזלית בלחץ נמוך.
  9. לרוץ 5 כרכי מיטה של MQH 2 O ו 5 כרכי מיטה של חיץ איזון דרך העמודה.

תיבת 2. טיהור Fv

טרנספורמציה FV - יום 1

  1. לשנות את100 ng של פלסמיד המכיל FV-6-60 μl של JM83 תאים מוסמכים, צלחת החיידקים על ארבע צלחות LB-אגר המכילות 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין, ו דגירה לילה 37 מעלות צלזיוס חממה.
  2. הכן LB L 6 X 1 לתרבות חיידקים.

ביטוי של Fv - יום 2

  1. גרוטאות כל המושבות מהצלחות אל מדיום LB. הוסף השעיה זו של חיידקים ל6 X LB 1 ליטר בנוכחות אמפיצילין (100 מ"ג / ליטר) ו דגירה עד OD600 מגיע 0.5.
  2. כשמגיע לקוטר חיצוני 0.5, להקטין את הטמפרטורה עד 20 מעלות צלזיוס ועד 115 סל"ד. כאשר הירידה בטמפרטורה ל ~ 20 ° C, להוסיף anhydrotetracycline (100 μl של 1mg/ml בDMF ל1 ליטר) שיזם את האינדוקציה של ביטוי חלבון ולדגור שעות נוספת 5 ב 20 ° C עם רעד נורמלי.
  3. חיידקי קציר בבקבוק 1 ליטר צנטריפוגות XG ב 4000 במשך 15 דקות. יוצקים את supernatant ככל האפשר. לשמור על החיידקים שנקטפו על קרח ב4 ° חדר קר C במשך לילה.

משחרר את מולקולות FV מהחיידקים - יום 3

  1. Resuspend חיידקים ב150 מ"ל של FV-שחרור חיץ (50 מ"מ טריס pH 8.0, 20% סוכרוז, 1.0 mM EDTA).
  2. תוך ערבוב עם בר בחישה מגנטי, להוסיף ליזוזים ל0.1 מ"ג / מ"ל ​​ולשמור על החיידקים על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, להוסיף MgCl 2-2.0 מ"מ ולשמור על קרח דק 'אחר 10-15.
  3. צנטריפוגה את החיידקים שטופלו ב20,000 XG למשך 30 דקות ב 4 ° C. את spheroblasts החיידקים צריך לרדת לכל גלולה, ורוב מולקולות FV משתחררים בsupernatant.
  4. Dialyze supernatant נגד 4.0 ליטר של חיץ לשטוף (20 מ"מ טריס pH 8.0, 100 מ"מ NaCl) בחדר קר במשך לפחות 4 שעות. בסופו של היום, לשינוי חיץ דיאליזה טרי וdialyze בן לילה. בשל סוכרוז בתמיסה, נפח dialysate יגדיל בכ -50%. יש להשתמש בעודף צינורות דיאליזה.

טיהור iMac ו FPLC - יום 4

  1. לאזן נפח 10 מיליליטר מיטה של ​​שרף טיהור IMAC (ראה תיבה 1) עם חיץ הדיאליזה בצינור 50 מ"ל.
  2. העבר dialysate מהצינורות, להוסיף MgCl 2 עד 10 מ"מ ולהגדיל את הנפח ל -200 מ"ל. לערבב עם השרף והדגירה מראש equilibrated למשך 30 דקות ב 4 ° C.
  3. לארוז את העמודה הריקה עם שרף מודגרות, ולשטוף את השרף עם 5 כרכי מיטה של ​​חיץ כביסה, ואחרי 5 כרכי מיטה של ​​כביסה חיץ עם 10 מ"מ imidazole ו30 מ"מ imidazole כל אחד.
  4. Elute החלבון המאוגד עם 20 מ"ל של חיץ כביסה בתוספת 300 מ"מ imidazole.
  5. הפעל את Fv המרוכז דרך Superdex עמודת 200 מראש equilibrated עם הכביסה חיץ. בריכת שברים המכילים FV (פסגות טיפוסיות מופיעה ב17.6 נפח אצירת מ"ל) ביחד ולהתרכז בו. קבע את הריכוז של המדגם באמצעות מקדם ההכחדה של Fv ב 280 ננומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הכינון מחדש של ערוצי KvAP לתוך ממברנות שונות כבר בשימוש בכמה מחקרים 8-10. בעקבות הרעיון של הבטחת ההפצה של שומנים בין חומרי ניקוי / שומנים מיצלות המעורבות ואת micelles מעורב החלבון / חומר ניקוי / שומנים בדם, אנו מסוגלים להגיע לכינון מחדש של KvAP כמעט מלא לממברנות עשויות משומנים שונים מאוד. כל ערוץ KvAP tetrameric צריך ~ 100 מולקולות שומנים כדי לכסות תחום שלו הטרנסממברני באופן מלא. התנאים ההכרחיים הוא לאפשר למולקולות שומנים מספיק כדי למזג לתוך מיצלות חלבון / שומנים / חומר ניקוי לפני דטרגנטים יוסרו. התנאים הסטנדרטיים שלנו (0.5 מ"ג חלבון ושומני 5.0 מ"ג) להבטיח כי יש בממוצע 1,000 ~ שומני מולקולות למולקולת חלבון. הניסוי שלנו הציפה וניסויים ביוכימיים אישר כי הכינון מחדש הוא כמעט מוחלט. הקלטות חשמל מערוצים מוכנסות לתוך ממברנות שומנים בדם שחורות, הקרנה של הערוצים המשוחזרים שלנגדי הפאג-מוצג ספריית פפטיד, והצמיחה של גבישי 2D של הערוצים בממברנות כל להדגים את היישומים המוצלחים של הכינון מחדש קרום למטרות שונות.

שינויי קונפורמציה שומנים התלויים של הערוצים KvAP וההקרנה נגד הפאג-מוצגת ספריית פפטיד להציג דרך חדשה למסך לחוסמי תעלות או ירכיים ערוץ על ידי שיטות ביוכימיות במקום להסתמך על electrophysiology כדי לשמור את הערוצים בתצורות ספציפיות 8. ההצלחה במסך שלנו לקלסרים קונפורמציה ספציפיים מצביעה על כך שיכולה להיות מיושמת באותה אסטרטגיה כדי למצוא קלסרים ספציפיים לקונפורמציה פעילה. זה הנראה לעין כי הערוצים מחדש בשלפוחית ​​יכולים לשמש נגד ספריות בודדות שרשרת FV, ספריות Fab, וכו 'כמו כן, חלבונים בממברנה אחרים יכולים להפעיל באמצעות פעולות אלה ולאבטח קלסרים חזק שלהם שעשויה להיות שימושיות למטרות שונות. אנחנו מאמינים שזה neשיטת w תראה יישומים כלליים יותר בעתיד.

מערכות קרום מחדש תאפשר הבהרה של הפרטים הכימיים מאחורי ההשפעות על שומני 11 חלבונים בממברנה. אינטראקציה שומנים חלבון כבר ידועה להיות חשובה לחלבונים בממברנה רבים, והייתה נתון למחקרים רבים בעבר 3. במחקרים מבוססי תאים, יכולות להיות מיושם במניפולציות כדי לשנות את הרכיבים הספציפיים בקרום ולאחר מכן את השינויים התפקודיים בחלבונים בממברנה קשורים לשינויים המבניים והלחנה בקרום. קשרים כאלה הם עקיפים ועלולים לנבוע מגורמים רבים בקרום התא שאינם מאופיינים היטב. בקרום הומוגנית משוחזר, זה יותר סופי ביצירת קשרים בין השינויים המבניים והתפקודיים של החלבונים בממברנה ואת השינויים בהרכב שומנים בדם ומאפיינים בממברנה. סופו של דבר, כדי להבין tהוא עקרונות כימיים מאחורי האינטראקציה שומנים החלבון, אנחנו צריכים להתוות את חלוקת שומנים סביב תחום הטרנסממברני, וכדי להבין את השינויים הדינמיים של שומנים אלה ממש בסמוך לחלבונים. מערכת משוחזרת נראית דרך אמינה לכיוון הבנה כזו.

כינונה מחדש של חלבונים בממברנה דורש ההסרה המבוקרת של חומרי ניקוי ממיצלות המעורבות חלבון / שומנים / חומר ניקוי, והיתוך של מיצלות המעורבות לתוך גדולים אלה שסופו של דבר הופכים לשלפוחית ​​30. שלוש שיטות שונות נמצאים בשימוש להסרת חומרי ניקוי, דיאליזה, חרוזים, ו14 cyclodextrin, 31, 32. אבל זה עדיין קשה להשיג הסרת מבוקרת היטב, הדרגתית של חומרי ניקוי מנפח קטן 33, 34. שיטה אידיאלית להסרת חומר ניקוי הייתה לוקחת את חומרי ניקוי מהשלב המימית באופן שווה על פני כל הנפח בקצב לשליטה, ולא צריך להפעיל חזק הפרעות On הכינון מחדש של קרום bilayer. שיטה כזאת יכולה להיות מסוגלת לשנות את המהירות ויעילות של הכינון מחדש, וסביר להניח שתאפשר הכינון מחדש בנפח קטן. שילוב של דילול איטי וכל אחת משלוש שיטות מקובלות להסרת חומר ניקוי עשוי להתקרב למטרה זו. איטי דילול על ידי החדרת כמות קטנה של מים לתוך תערובת חלבון / חומר הניקוי / שומנים הוא דרך לשליטה באופן שווה כדי להקטין את ריכוז חומר הניקוי עד CMC שלה. הסרת חומר הניקוי אחר כך היא פחות קריטית להיווצרות השלפוחית, אם כי עדיין חשוב לשילוב של שלפוחית ​​קטנה לגדולים. דרכים אחרות להשיג חומר ניקוי להסרת מבוקרת עדיין צריכים להיות הגה ופיתח.

הליך הכינון מחדש שלנו לוקח בחשבון חלוקת שומנים בדם בקרב מיצלות מעורבת וההיתוך מושרה חומר ניקוי של שלפוחית, כמו גם את micelles המעורבים. הצלחתו סוללת את הדרך שמוביל לספקטרום רחב יותר של יישומים של ה-Rשלפוחית ​​econstituted, הרבה יותר משלושת הכיוונים שהצגנו. העיבוד של הליכנו לחלבונים בממברנה אחרים לא צריך להיתקל במגבלה טכנית עיקרית. למרות שכבר מחדש חלבונים בממברנה רבים בדרך זו או אחרת, זה כבר קשה להשיג ליד הכינון מחדש מלא וכדי להעריך את התפקוד של החלבונים מנקודתי מבט שונים מרובות. המאמצים שלנו בכינון מחדש KvAP מראים כי השיטות שלנו יכולה לאפשר הכינון מחדש מלא ותהיה מתאים למטרות אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחקרים על KvAP במעבדה ג'יאנג קיבלו עזרה משמעותית ממעבדתו של ד"ר רודריק מקינון באוניברסיטת רוקפלר. תודה מיוחדת לד"ר בראון ומייקל Kathlynn McQuire לעצתם ולעזור בניסויי הפאג המסך שלנו. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-NIH (GM088745 וGM093271 כדי ש-XJ) וAHA (12IRG9400019 כדי ש-XJ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone RPI Corp. T60060
Yeast Extract RPI Corp. Y20020
NaCl Fisher S271-3
Tris Base RPI Corp. T60040
Potassium Chloride Fisher BP366-500
n-Dodecyl-β-D-Maltoside Affymetrix D322S Sol-grade
n-Octyl-β-D-Glucoside Affymetrix O311 Ana-grade
Aprotinin RPI Corp. A20550-0.05
Leupeptin RPI Corp. L22035-0.025
Pepstatin A RPI Corp. P30100-0.025
PMSF SIGMA P7626
Dnase I Roche 13407000
Bio-Bead SM-2 Bio-Rad 152-3920
HEPES RPI Corp. H75030
POPE Avanti Polar Lipids 850757C
POPG Avanti Polar Lipids 840457C
DOGS Avanti Polar Lipids 870314C
DMPC Avanti Polar Lipids 850345C
Biotin-DOPE Avanti Polar Lipids 870282C
DOTAP Avanti Polar Lipids 890890C
NeutrAvidin agarose beads Piercenet 29200
Dialysis Tubing Spectrum Laboratories, Inc 132-570
Pentane Fisher R399-1
Decane TCI America D0011
MTS-PEG5000 Toronto Research Cemicals M266501

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. 5th edition, Galand Science. New York. (2007).
  2. Lee, A. G. How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach. Mol. Biosyst. 1, 203 (2005).
  3. Lee, A. G. How lipids affect the activities of integral membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta. 1666, 62 (2004).
  4. Anderson, R. G. The caveolae membrane system. Annu. Rev. Biochem. 67, 199 (1998).
  5. Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 269 (2004).
  6. Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 257 (2003).
  7. Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S. Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. J. Vis. Exp. (20), e1033 (2008).
  8. Zheng, H., Liu, W., Anderson, L. Y., Jiang, Q. X. Lipid-dependent gating of a voltage-gated potassium channel. Nat. Commun. 2, 250 (2011).
  9. Schmidt, D., Jiang, Q. X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444, 775 (2006).
  10. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422, 180 (2003).
  11. Jiang, Q. X., Gonen, T. The influence of lipids on voltage-gated ion channels. Curr. Opin. Struct. Biol. 3408884 (2012).
  12. Artimo, P., et al. ExPASy: SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40, W597 (2012).
  13. Cladera, J., Rigaud, J. L., Villaverde, J., Dunach, M. Liposome solubilization and membrane protein reconstitution using Chaps and Chapso. Eur. J. Biochem. 243, 798 (1997).
  14. Levy, D., Bluzat, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. A systematic study of liposome and proteoliposome reconstitution involving Bio-Bead-mediated Triton X-100 removal. Biochim. Biophys. Acta. 1025, 179 (1990).
  15. Young, H. S., Rigaud, J. L., Lacapere, J. J., Reddy, L. G., Stokes, D. L. How to make tubular crystals by reconstitution of detergent-solubilized Ca2(+)-ATPase. Biophys. J. 72, 2545 (1997).
  16. Levy, D., Gulik, A., Bluzat, A., Rigaud, J. L. Reconstitution of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase: mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1107, 283 (1992).
  17. Cohen, F. S., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Fusion of phospholipid vesicles with planar phospholipid bilayer membranes. II. Incorporation of a vesicular membrane marker into the planar membrane. The Journal of General Physiology. 75, 251 (1980).
  18. Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66, 1404 (1994).
  19. Hanke, W., Schlue, W. -R. Planar Lipid Bilayers. Methods and Applications. Biological Techniques. Sattelle, D. B. Academic Press, Inc. San Diego. 133 (1993).
  20. Tien, H. T. Bilayer lipid membranes (BLM). Theory and Practice. Marcel Dekker, Inc. New York. 655-65 (1974).
  21. Pagano, R. E., Ruysschaert, J. M., Miller, I. R. The molecular composition of some lipid bilayer membranes in aqueous solution. The Journal of Membrane Biology. 10, 11 (1972).
  22. Henn, F. A., Thompson, T. E. Properties of lipid bilayer membranes separating two aqueous phases: composition studies. Journal of Molecular Biology. 31, 227 (1968).
  23. Tao, X., MacKinnon, R. Functional analysis of Kv1.2 and paddle chimera Kv channels in planar lipid bilayers. J. Mol. Biol. 382, 24 (2008).
  24. Cohen, F. S., Akabas, M. H., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Parameters affecting the fusion of unilamellar phospholipid vesicles with planar bilayer membranes. The Journal of Cell Biology. 98, 1054 (1984).
  25. Smith, G. P., Petrenko, V. A. Phage Display. Chem. Rev. 97, 391-39 (1997).
  26. McGuire, M. J., Li, S., Brown, K. C. Biopanning of phage displayed peptide libraries for the isolation of cell-specific ligands. Methods Mol. Biol. 504, 291 (2009).
  27. Rigaud, J. L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Braz. J. Med. Biol. Res. 35, 753 (2002).
  28. Chami, M., et al. Use of octyl beta-thioglucopyranoside in two-dimensional crystallization of membrane proteins. J. Struct. Biol. 133, 64 (2001).
  29. Kuhlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of membrane proteins. Q. Rev. Biophys. 25, 1 (1992).
  30. Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65 (2003).
  31. Walz, T., Grigorieff, N. Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins. J. Struct. Biol. 121, (2), 142 (1998).
  32. Signorell, G. A., Kaufmann, T. C., Kukulski, W., Engel, A., Remigy, H. W. Controlled 2D crystallization of membrane proteins using methyl-beta-cyclodextrin. J. Struct. Biol. 157, 321 (2007).
  33. Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J. Struct. Biol. 160, 295 (2007).
  34. Iacovache, I., et al. The 2DX robot: a membrane protein 2D crystallization Swiss Army knife. J. Struct. Biol. 169, 370 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics