重组脂膜的结构和功能研究的钾离子通道

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Biology

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Summary

完整的原型脂膜的电压门控钾离子通道进入重组程序中描述的。重组的渠道都适合生化检测,电气录音,配体筛选和电子晶体学研究。这些方法可以有其它膜蛋白的结构和功能研究的一般应用。

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Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. J. Vis. Exp. (77), e50436, doi:10.3791/50436 (2013).

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Abstract

若要研究的脂质在一个还原论的的时尚的 - 蛋白相互作用,它是必要的,,以纳入成定义良好-的的脂质组合物的膜的的的膜蛋白。我们正在研究在了一个原型电压-门控性钾(Kv值)信道中的脂质-依赖的的的门控效果,,,,并已摸索出到不同的膜系统中的的详细程序,以重新组建的渠道。我们的的复溶程序也须花上代价为两个的囊泡的以的洗涤剂-诱导的的的融合菜式,和的融合菜式的与的脂质/界面活性剂的混合胶束的的蛋白质/去污剂微胶束中,以及作为在的重要性的的脂类达成一项平衡态分布产生的蛋白质/清洁剂/脂质和的洗涤剂/脂质的混合的胶束。我们的的数据所表示的,在的油脂泡囊中中的信道的插入的是相对地在取向中随机抽出的,,,并,没有可检测到的蛋白质聚集体被在分馏实验中看到的,了复溶效率是如此之高的。我们已动用了重新组建,,以确定在不同的脂类中的的渠道的构象状态的d个频道,请记录一个小的数目间在平面脂双层膜的中注册成立之的信道,屏幕为从一个噬菌体-显示的的的的肽库的构象-特定的的配体的电活动的,,并支持的增长的二维晶体的:在膜的中的信道。可适于在脂质双层中,特别是对于真核电压门控离子通道的脂质的影响的调查研究其他膜蛋白的重组此处描述的步骤。

Introduction

的细胞交换与他们的的环境中的材料和信息通过特定的的膜蛋白1的职能,。在细胞膜上的膜蛋白的功能作为泵,渠道,受体,膜内内切酶器,连接器和跨膜的的的结构性支持者。影响的膜蛋白的的的基因突变,已一直与到许多的人类疾病的有关。事实上,有很多的的膜蛋白已经一直的首要的的的的药物靶标,,,因为他们顷重要的的,和很容易在单元格膜的访问的。因此,很重要的是了解膜不同的膜蛋白的结构和功能,并使得有可能设计新颖的方法,以减轻从突变蛋白在人类疾病中的不利影响。

脂质环绕所有集成在双层膜2,3的膜蛋白。在为真核细胞膜中,的各种的脂类的不同类型的顷公知,以被组织成的微区4,5。的许多的膜蛋白被示出将予分派产生这些的微区,以及作为了笨重的的的的膜心情,6的流体相为。该机制,背后的组织的的膜蛋白的的的的微区和的交付融入其中,的生理意义该等分派之的的是显然是重要的,,,,但仍然不佳理解的。的一个主要的在研究膜蛋白的的上的血脂特效时的的技术难度是生物化学上纯化的膜的成有良好对照的的的脂质组合物的膜的的蛋白质其他,以便,几乎所有的重新配制的蛋白质顷功能性的7的的可靠的复溶的。在的过去的的的几年里中,我们开发的方法的去重构一个从A.的“电压-门控性”原型钾离子通道pernix的 (KvAP)成各种膜系统的结构和功能研究8-10。其他人的数据,我们一起显示,脂类可能是一个决定因素中的构象变化的电压检测的一个电压门控离子信道和的网域可能会塑造的这些信道11中的的一些的的的结构。在未来,我们将提供我们的方法的详细说明,并提供关键技术的提示,可能会确保我们的研究结果,以及我们的方法扩展到其他膜蛋白的研究成功再现。

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Protocol

1。的KvAP信道下的的中的表达及纯化(图1)

  1. 准备工作 - 0天
    1. 用去离子水(DIH 2 O)的MilliQ H 2 O(MQH 2 O)冲洗玻璃烧瓶细菌培养,除去微量的洗涤剂一般洗碗。
    2. 高压灭菌器1,000毫升在2.8升锥形烧瓶中(总两个-作为一个例子在这里的公升的文化)中的的LB培养基中。中发现的水的时间被的低硬度的日期是重要对的成功的的的转化的细菌的文化的。
    3. 高压灭菌100毫升LB培养基在500毫升的烧瓶
    4. 用200 ng的,变换的的XL1孔自下而上蓝的感受态细胞中的60μl的的pQE60,一个对的凝血酶切割网站和在一个祂的,的它的的C-末端,板的的的细菌的的6的标签上面含有该基因的的为KvAP与,两个LB-琼脂的的]含有100微克/的板块上的质粒毫升氨苄青霉素,,,和孵化他们为在一个37个°C培养箱中培养的14-16小时。
  2. KvAP表达 - 第1天
    1. 请检查的应用程序的细菌的上的板块后,孵育过夜一些板块的殖民地的earance。菌落呈通常直径只有大约0.2-0.5毫米,其中有很多。我们不希望怀有大菌落周围很多卫星菌落板。
    2. 添加5.0分毫升的LB培养基中到每个min摇床过夜培养的:LB-琼脂板,,,和报废关闭的殖民地的。将细菌转移悬浮液到100ml LB培养基中,在500ml烧瓶中高压灭菌。加入氨苄青霉素至终浓度为100微克/毫升,在37℃下进行大约一小时孵育小文化或直到OD 600达到0.60。
    3. 在此期间,的地方两个与1.0成一台37的L培养基中的烧瓶中°C摇动孵化器地暖最多的介质中信息,并和拟备氯化钡2“(1.0最后M;的10mM在每个1.0 L培养液中的终浓度),的的20毫升的2.0毫升0.4M的IPTG(异丙基-硫代-β-半乳糖苷),和::2.0毫升的100 mg / ml时在水中的的氨苄青霉素的股票的JOURNAL。
    4. 小文化一旦准备就绪,氯化钡2加10毫升,1.0毫升ampici长效杀虫剂蚊帐库存中,和50毫升的小文化的,从步骤1.2.2开始,以的预温的的的LB培养基的。 OD600值应该是在0.05左右。注意可能由于高硬度的水,并在LB培养基中的抗衡离子的沉淀。和Ba 2 +是已知的要系结至的细孔的结构域的的钾离子通道和块的离子性的电流,,并从而会降低的高电平的的表达的关系,的的细菌的渠道,,以的的的毒性中。
    5. 径OD600值每隔一小时,,直到它到达0.70,和每十五分钟的,直到它到达0.8到第0.9。在我们的集中-高达,它通常要花〜5小时到达到0.8。
    6. 添加IPTG至启动蛋白的诱导表达的信道蛋白的,,并孵育的文化为另一个4.0-HR在37°C与225的RPM在颤抖的0.40 mM的。
    7. 收获细菌离心瓶1.0升,4.0°C在4000 XG旋转15分钟。尽可能地倾倒出上清液导入废液烧杯中,加入10毫升1.0M的钠磷酸盐缓冲液,以沉淀所有的Ba 2 +,然后添加的漂白剂来杀死细菌的体积小,。请妥善保存被收获的的的的细菌,在一个4.0°“C冷”间客房计算过夜在冰中埋地的在离心机中瓶的。
  3. 纯化的KvAP蛋白(日2和图3, 图1B)
    1. 重悬细菌沉淀15 IMAC裂解缓冲液中每毫升1.0升文化。添加~~ 1.0 U的DNase [Î]为防止抖动,和亮肽素的三个蛋白酶抑制剂的的,抑肽酶和1.0μg/ ml的的的胃酶抑素A在。的总体积为2升的培养〜35毫升。
    2. 超声,将重新悬浮的的细菌,,一个总共有10个ON-的时间的min的在冰中埋地的在一个金属的烧杯中的。探针超声波仪,40%的输出功率在4.0℃冷室中设置了5秒/ 10秒OFF周期。的输出功率值,以便根据经验确定的细菌裂解没有太多的解决方案中的加热。
    3. 添加0.50克正癸基-β-D-麦芽糖苷(DM;溶胶 - 从Anatrace年级)在干燥的粉末,超声处理的细胞裂解液,并温育该混合物3.5 hr在室温温度(RT)与在为了来提取尽可能多的的的信道蛋白质作为可能的的恒定的水平的晃动(~~ 100转)。重要的是要确保,过了一段30-50分钟,充分溶解的洗涤剂粉末。
    4. 洗涤剂提取后,除去细胞碎片通过离心从裂解物在20000×g离心30分钟,在RT。在等待离心完成,准备His标签的低压液相色谱(LC)列( 专栏1)。
    5. 从步骤1.3.4上清液加载到预先包装的IMAC(离子等人mmobilized: 一个香港富缘Çhromatography)列在1-2毫升/分钟,是由蠕动泵的流速。另外,的提取的的的His-标签为的蛋白质可以被孵育与的IMAC的树脂,用于间歇式约束力的。
    6. 的IMAC树脂洗净通过运行的5个柱床体积的的IMAC的洗涤缓冲液主要的,和10个柱床体积的的IMAC的洗涤的buff主要的的呃加20 mM的咪唑的。一个串联的紫外线监测仪是用来确保洗干净。
    7. 洗脱KvAP的蛋白应用IMAC洗脱缓冲液含有300 mM咪唑。被绑定的KvAP的其中大多数是被,在6毫升的洗脱缓冲液中之内洗脱,通过该柱。加入凝血酶(1.0 U每2-3毫克的蛋白质)汇集洗脱组分和孵化在板凳上劈开他的6个标签的蛋白质过夜。
    8. 在接通下一个的天,集中精力的凝血酶-消化的的的的蛋白的的解决方案,在一个的Centricon(的截留分子量= 30K),向下到第600微升为的size-排斥经FPLC(快速蛋白液相色谱)。在离心过程中中,拌匀的样品每隔五分钟,,以尽量减少蛋白质的多体聚集有关。由于蛋白质浓缩,在膜过滤器的局部浓度变高,并且有时是清晰的白色沉淀物,否则可能会阻塞过滤膜。另外,高浓度的蛋白质(约5-10毫克/毫升)在集中器的底部导致眉光洁度的颜色和混合的真的有助于,以尽量减少样品的损失。
    9. 运行浓缩KvAP通过于Superdex 200柱的FPLC纯化的平衡缓冲液预平衡。通常情况下,在DM洗脱出来中,得到保留磁碟区应为12.3毫升的四聚体的KvAP信道的高峰期。有一个小的拖尾在约13.6毫升,有一个小的单体KvAP量。虚空的列的我们使用的的是在7.0毫升,,,并通常样品中扩增产生崛起到一个小的峰值在虚空中,,其中包含非常的小的KvAP蛋白。的咪唑结束时的洗脱(〜24毫升)。池的零碎含有KvAP四聚体的的在一起,,并向下集中的蛋白质的解决方案至0.5毫升。确定使用消光系数估计(1.2E-5.0 M -1厘米-1,这是基于芳香族残基的数量计算)的KvAP浓度的样品在280 nm处[参考12网址: 包含http:// web.expasy域名的.org /序列的物理性质/ - ]。
      在室温下,的纯化的KvAP在DM中是稳定的的的,为在的至少一个星期没有蛋白质的大幅损失的。在4℃下,它可能会持续更长的时间。不要冻结在洗涤剂中的蛋白质。的事是推荐在DM中中存储的蛋白质在4℃下中,和β-OG上面间客房计算温度中的蛋白质均。但是,我们通常会不等待,,并后,立即的蛋白质是准备就绪的,请继续到的重构步骤。
    10. 含量降低了12%的样品在SDS-PAGE凝胶。
      样品从上文所描述的的每个步骤中制备了,通过混合与的5倍的SDS-上样缓冲液(详表3(为的缓冲区))并辅以用1.0%的的β-ME的的20家微升的标本。对样品进行了没有煮沸。后凝胶准备,样品通常一直的SDS缓冲液中,在室温下超过10分钟时。运行,并用考马斯蓝染色后凝胶,野生型KvAP的显示为单一条带,在26 kDa的( 图1B

2。离子通道的重构

2.1。脂质体的的与编制及洗涤剂-诱导的的囊泡的融合

在此之前,以的脂质的准备,洗一个14毫升的的可支配的玻璃的测试-管,一个螺丝-封端的的的玻璃管中,和一个250微升,用氯仿的的玻璃注射器。拿出,倒掉~~ 10毫升氯仿到使用TestTube中。

  1. 棕榈油酰磷脂酰乙醇胺( 教皇 )和棕榈油酰磷脂酰甘油(POPG)脂质体的制备。
    1. POPE转移3.75毫克和1.25毫克POPG到预清洗的螺旋盖的玻璃管(POPE:POPG = 3:1重量比)的氯仿和下一个连续的流的氩气,干燥的脂质。当没有留下可见的氯仿,脂质一小时在室温下真空干燥。
    2. ...添加440μl的上低的的盐-缓冲液(10个毫米的HEPES,pH值7.4)或水进入干燥的脂质和涡管水合物血脂。的脂质悬液看起来发白的的和浑浊的的的。
    3. 在用冰 - 冷浴,超声波破碎仪中中超声的脂质悬浮液中,,直到供小泡囊品溶液正变成半透明的的(OD410 <0.2)时。
      在典型地用于的10个在水中的或低的的盐缓冲液中的的mg / ml时布培/ POPG解决方案外,我们公司经营的超声波破碎仪与sec测试三十日ON和sec测试三十日OFF(在冰上)为合共15-20分钟。由于在超声波处理过程中产生的热量,这是可取的,以尽量减少脂质氧化,降温至10℃或以下的超声波仪水浴脂质溶液中添加1.0mM的DTT。的的是最终的OD410依赖于脂质-的。对于某些脂类,它可能会是非常困难的,,,以达到这样的的低OD。如果发生这种情况,我们通常使用的清洁剂来完全溶解的脂质,,并允许长-孵化,,以达到良好的的分销周围的脂类含的蛋白质-的的的胶束(请参见下一)量。
      高容量浴超声波破碎是很重要的条例呃达到OD410 <0.2。我们一直在使用的系统由实验室用品有限责任公司(型号#G112SPIG,纽约州Hicksville)。囊泡的适当的超声波处理的关键是确保在管中间的谐振中心具有较强的振动。的振动与水的体积变化,因此可以调整。此外,根据经验发现,增加水的粘度通过加入少量甘油超声处理可增强疗效。
      另外,我们已经发现,用探针超声波仪脂质悬浮液在一个塑料或金属管的接触,可以产生相同的结果。微探针需要清洁,只有针尖的脂质溶液中浸泡。由于脂质颗粒破碎成小片的表面上的探针,它是非常重要的,保持样品冷却,并具有一定的还原剂周围,以防止不饱和脂质的氧化。
      根据低温电子MICRoscopy的超声处理的单层脂质体,多数是30-50纳米的直径(数据未示出)。曲率小的SUV是一个小的扰动是如此之高,足以引起这些囊泡的充满活力的融合成较大的是80-200纳米的直径(见下一页)。
    4. 添加50μl的3.0 M氯化钾,0.50米DM向混合物中,使最终的脂质悬浮液300mM的氯化钾和10mM DM和10μl。孵育的解决方案,水平旋转2小时RT形成脂质/洗涤剂混合胶束。温育后,将悬浮液应成为有点浑浊( 图2A),这是由于洗涤剂诱导融合的小单层囊泡。
    5. 当蛋白质浓缩至大于2.0毫克/毫升,添加0.50毫克KvAP蛋白,50μl的3.0 M氯化钾,16微升0.50 M DM库存在水中,和10mM HEPES,pH值7.4脂质/洗涤剂混合物使最终体积的1毫升。最终的脂质:蛋白质的重量比为10:1和DM的最终浓度为18 mM的( 图2A)。孵育另外2小时的水平旋转玻璃管中的蛋白质/脂质/洗涤剂混合物。
      洗涤剂浓度的选择的引导由洗涤剂诱导的囊泡融合和囊泡增溶13。当囊泡形成由强声波处理,其平均直径在30-50纳米的范围内,根据EM。这些囊泡散射在410nm处具有非常低的。在低浓度时,洗涤剂首先插入囊泡,不稳定的小泡,洗涤剂饱和囊泡(OD410上升,参见图2A)和诱导的融合。小泡的融合导致的增加的OD410 nm。对于10毫克/毫升教宗/ POPG的囊泡,OD410峰在15毫米DM。当越来越多的清洁剂的引入,囊泡开始打入件和血脂变得到洗涤剂/血脂混合胶束分区。这后一种方法是伴随着减少的OD410倒到最终的低的水平(<0.1)。
      由于活性的融合事件的光密度由于洗涤剂诱导的融合的小泡的上升阶段中,它是极有可能的是,将积极与洗涤剂饱和的脂囊泡融合蛋白/去污剂微胶粒。这是18毫米DM时间编制蛋白/脂质/洗涤剂混合物的选择背后的原因。如果超过4倍浓缩的洗涤剂正式,DM需要的量进行调整,使最终浓度仍然是约18〜20 mM的。当蛋白质产率是很低的,这是很难评估多少浓缩洗涤剂样品中,而不是混合蛋白质的增溶脂质,配制和使用的完全平衡的混合物。在我们的手中,如果没有足够的时间就可以达到一个很好的平衡分布之间的血脂含蛋白质和蛋白胶束,reconstitut离子的效率明显下降。通常,我们测试了实验的重组效率:1)检查共同迁移的蛋白与囊泡馏分中的蔗糖密度梯度超速离心,2)中提取的蛋白质的重组后的囊泡,分馏在凝胶过滤柱找到多少蛋白质(我们的情况KvAP)仍然是四聚体。蛋白质/脂质/洗涤剂孵化的最小时间是几个小时,在室温或4℃过夜度。
      对于一个新的膜蛋白,在不同的洗涤剂是稳定的,第一步是要找出的脂质成分的增溶特性由这样的洗涤剂,在图2A中表明的相似。接着,最好是与PC的提取物,如大肠杆菌启动大肠杆菌极性提取物的PC机,PC大豆提取物等,因此,在特定的蛋白质,如果需要其功能的某些磷脂,它可能已经被包括在提取TED脂质混合物。
  2. 混合物与溶解在去垢剂中的KvAP制备1,2 -二油酰基-3 -三甲基铵丙烷(DOTAP),或1,2 -二油酰sn-甘油-3-琥珀酸(DOGS)---完整的脂质,例如,增溶重建
    1. 的脂质制剂的相同为POPE / POPG囊泡。成小单层脂质体水合脂质的超声处理需要较长的时间(通常为45-60分钟)比POPE / POPG脂质(通常为5-10分钟)。犬小泡可能慢慢相互融合,形成油性小液滴。
      由于高品质的SUV DOTAP和狗难度重复性,我们通常会溶解这两种脂类之前完全与蛋白质混合。
    2. 完全以溶解DOTAP或DOGS,用10mM DM和40mM的正辛基-β-D-葡糖苷(β-OG)混合,超声处理的囊泡。的脂质/洗涤剂混合物孵育过夜(> 15小时),并将该混合物在室温下不应该有任何小颗粒​​或液滴。但取而代之的则是相当明确的。如果在此步骤中,以达到完全平衡,会导致的多层囊泡形成的一个显着部分。
    3. 混合蛋白KvAP DOTAP溶解在去垢剂或DOGS在蛋白质:类脂比,小于或等于到1:10。蛋白/去污剂/脂质混合物被允许在室温下孵育2-3小时端部上下旋转。

2.2。洗涤剂去除,以形成蛋白脂质体

  1. 透析---缓慢除去洗涤剂,如DM和β-OG,即具有相对高的临界胶束浓度(CMC≥1.0毫)
    准备2升透析缓冲液( 表3),各1.0毫升混合物。
    剪出合适的长度,透析管(截留分子量= 10K; 0.70厘米宽),洗用DI水。重要的是要检查并确保油管,没有任何泄漏。对于敏感的样品,可以在第一处理油管的10mM的Tris-HCl pH值8.0和2.0 mM的EDTA的缓冲液,然后在沸水中3-5分钟进行清洗。然后,该管被夹紧在其一端,用透析缓冲液漂洗。
    加载到透析管中的蛋白 - 脂类 - 去污剂混合物。夹具油管两端用最小的空间留在溶液上方。将加载的油管进入透析缓冲区,并使用搅拌板,使管材在溶液中慢慢旋转。更改透析缓冲液,每8小时一次。经过第一个缓冲区的变化,溶液应变得浑浊,如果是完全清楚的蛋白质 - 脂类 - 去污剂混合物。如果透析太快,有可能是白色固体沉淀物在透析管的底部。建议,在缓冲区变化时,管路应摩擦,并倒多次。五年后改变透析液,通常都愿意囊泡。
    我们检查洗涤剂的残留量,通过拍摄到脂质双层囊泡。当留下洗涤剂量仍然显着,双层变得几乎是在瞬间打破。另外,也可以通过使用比色的方法或测量的小泡悬浮液的表面张力测量的残留洗涤剂。
  2. 使用聚苯乙烯珠,以帮助去除洗涤剂具有低CMC
    在许多情况下,我们不得不使用低CMC洗涤剂,如DDM(CMC〜0.17毫米的水)。微小的疏水孔珠被用来去除这些洗涤剂14。
    1. 的有孔玻璃珠的制备。出0.5克干珠,并把它们成50毫升康宁管的重量,加20毫升甲醇,超声浴超声波破碎解决方案为5分钟,以去除残留的气泡,降速珠在5分钟5000转,然后倒出大部分甲醇。用乙醇和MilliQ水重复洗涤。被存储在20%乙醇洗涤后的有孔玻璃珠在4℃下,并需要改变的洗涤剂的缓冲液在使用前。
    2. 估价待处理的蛋白质/脂质/洗涤剂混合物中的洗涤剂的量,并计算以除去洗涤剂所需要的有孔玻璃珠的量。对于DDM和DM的结合能力大约是100毫克,10毫克洗涤剂珠。没有多余的水将湿的有孔玻璃珠称量,并直接加入到蛋白质的混合​​物。所需的有孔玻璃珠的至少15-20分钟是充分有效的,并减少洗涤剂浓度达到一个稳定的水平14-16。要删除8.7毫克的DDM(十二烷基麦芽糖苷),在1.0 ml的溶液,相当于〜18 mM的,共有87毫克的聚苯乙烯珠,如生物珠SM2,是用来在五个相等的分数。与每个级分的蛋白质/脂质/洗涤剂混合物混合20-30分钟,在室温下恒定最终上下旋转,向下旋转的有孔玻璃珠,有孔玻璃珠,将上清转移至下一个分数,并重复直到结束。
      当洗涤剂concentr的振动性达到其CMC时,我们有意延长的时间段,为一小时,以便在溶液中的少量的清洁剂会促进融合的小囊泡路数。
    3. 最后一个步骤后,要取出微量洗涤剂中添加35毫克Bio-Rad公司SM2珠和孵化的小泡4小时。
      当用于洗涤剂去除上述程序被应用到一个新的蛋白质,所以一般最好从蛋白质/脂质〜1:10的比例(重量/重量)。需要仔细地使足够多的洗涤剂添加到完全溶解的脂质( 图2A)制备的脂质/洗涤剂混合物。重要的是要超过2小时的孵育脂质洗涤剂混合物在室温下(用1-2毫DTT)具有恒定的晃动(每分钟400转)或端部上下旋转。当蛋白质与脂类混合,蛋白质/脂质/洗涤剂混合物孵育足够长的时间(通宵如果蛋白质是stabl的五)在任室温或在冷室中,使含蛋白微胶粒和蛋白胶束之间的清洁剂和脂质的分布相对均匀。此外,如果通过使用BioBeads快速去除洗涤剂时,重要的是找到的有孔玻璃珠的洗涤剂结合能力。缓慢除去洗涤剂可能确保将有足够的蛋白质以维持其完整性,并成为插入相对相当大的囊泡的脂质。

2.3。存储的proteoliposome和质量控制

  1. 囊泡一旦准备好了,他们准备为50微升等分和闪光灯冻结等分直接飞泻到液态氮中。然后储存在​​-80℃的冰箱中冷冻囊泡。生化检测,我们不使用冷冻的小泡,因为冻融循环,有时被发现的文物介绍,到我们半胱氨酸特定的反应。对于电气记录,我们只使用少于6个月,储存在-80°C的囊泡。
  2. 浮选中的密度梯度的囊泡( 图2B)
    1. 蔗糖梯度层,含有0.3毫升的10,35和55%的蔗糖在10mM HEPES和自旋在4小时200000克在4℃下的顶部装入的小泡悬浮液的50微升慢慢地加速和减速,以避免层间的界面的中断。
    2. 收集100微升馏分,从顶部向底部和上运行它们的非还原性SDS-PAGE( 图2B)。的KvAP使得0.5-1.0微克蛋白的带清晰可见用考马斯亮蓝染色。应该被发现的KvAP蛋白,在10和35%的蔗糖之间的界面处。没有沉重的蛋白质的聚集体能够被看见上面的高密度的范围内,表明几乎所有的蛋白质膜。
  3. 检查适当的构象的KvAP通道囊泡。登记/>我们以前的数据建立一个半胱氨酸突变体(L125C/C247S)KvAP,当正确地集成在双层,完全埋在膜,和不能访问的半胱氨酸特异性试剂8。与这种突变通道的重组程序进行了测试,检查由半胱氨酸特定的试剂,MTS-PEG5000。 L125C的改性用1.0μMMTS试剂在室温下在非还原SDS-PAGE凝胶中引入了一种5kDa移位的KvAP带。 L125C突变通道磷脂膜没有检测反应应该引起我们的重组程序的成功实施,表明几乎完全插入双层中的所有通道。作为阳性对照的反应,5.0 mM的DM被引入,以使几乎所有L125C残基的突变的信道访问的MTS试剂。
    另外,一个孔结合的毒素,如chrybdotoxin,可能被用来计数的四聚体的通道。基于抗体的约束力说(见专栏2,FV是准备作为一个特定构象的配体KvAP)可能被用来量化的结合位点重组囊泡。这些绑定可以进行比较分析与定量分析,测量总蛋白,以弄清楚什么分数重组通道四聚体和部分的蛋白质有正确电压传感器焊盘(S3/S4的电压传感器)折叠。
    对于其他蛋白质进行复原,最好是引入定量的方法来评估的哪一部分的重组蛋白正确折叠。仔细的功能检查,从而发展良好的质量控制成功重组的先决条件。

3。重组通道含囊泡的应用

3.1。功能研究黑脂膜离子通道的活动。

制备N材料eeded。

  1. 脂质准备
    1. 清洁的玻璃试管,特富龙表面的螺旋盖的琥珀色小瓶,玻璃注射器,用氯仿和一组。氩气气流下干燥的琥珀色小瓶。
    2. 传输POPE 0.75毫克和0.25毫克POPG到琥珀色小瓶在氯仿中,并用氩气中蒸发氯仿。
    3. 洗净,干燥的脂类,用0.20毫升戊烷,完全干燥以除去残留的氯仿。最后溶解在50μl癸烷的脂质。癸烷(20毫克/毫升)中的脂质,将被用于绘画跨150-250微米的孔( 图3B)在一个实验性的双层杯( 图3A)的一侧钻在薄部的脂质双分子层。
  2. 溶液的制备
    1. 细胞内液(反式):的10mM HEPES / KOH,pH值为7.4,15mM的氯化钾
    2. 细胞外液(顺式)的10mM HEPES / KOH,pH值7.4,150mM的氯化钾
    3. 盐桥:弯玻璃毛细管成U形的桥梁,并填写他们与1.0%的琼脂液溶解在细胞外液。
      渗透梯度之间建立顺式和反式的解决方案被认为是脂质双层17囊泡融合的主要推动力。对于带负电荷的脂质,15mM的CaCl 2的或带正电荷的聚精氨酸肽被认为是能够诱导融合事件。膜融合脂质,例如DOTAP和DOGS,等,可以导入脂质囊泡,使融合事件的机会更高。

电气录音脂质双层KvAP渠道的

  1. 预油漆是钻在双层杯的圆柱形表面( 图3B)的圆孔(直径〜0.25 mm)。在实验室用毛细管杵脂质转移。圆头毛细管杵抛光和杯子表面不划伤。钍ë键少量的通过毛细管杵进行的脂质双层杯孔周围被扩大,并空气干燥。
  2. 等待1-2分钟,使癸将完全蒸发。护理时,应注意避免脂质的解决方案,从进入孔。
  3. 将杯在录音室,并把盐桥和连接电极双方的记录杯( 图4A)。加入顺式 - 和反式解决双方的孔。渗透压梯度的建立,以促进融合到脂质双分子层小泡。
  4. 调整双方的杯〜0(通常<2毫伏)之间的偏移的潜力。使用毛细管杵传输少量的脂质混合物在癸烷中,油漆的两端的孔中,直到形成双层膜的脂质。的双分子层的形成被检测到,通过记录一个斜坡脉冲的传递过程中的电容电流。
  5. 等待,直到膜变薄,并变得相对稳定。我们等待,直到有没有更多的变化在3-5分钟的膜电容。
    的一般思想是,一个大洞上形成的平面双层膜的中间部的距离为〜4.0 nm厚的作为一个经常性的双层,膜变得更厚时,它得到接近孔的边缘,那里是一个的周围环形带和癸烷溶剂为18,19。有残留的癸烷留在膜的的双层中央部的,这是不可避免的。过去估计正癸烷与PC的体积比为0.35-0.45的双分子层18,20〜22后的减薄。 EM减薄双层检查表明,有癸烷镜片夹在两者之间的双层22的单张。这些数据表明,插在磷脂双分子层膜的膜蛋白共存着小岛(最多50纳米的直径)的癸烷。残留的癸我在双分子层也降低至0.4-0.5μF/ cm 2的,它可以被用来获得的粗略估计值的大小,根据所测得的电容减薄双层电容量常数。 100 pF电容双层〜180微米,直径从圆形双层膜。
    残留的癸烷对于KvAP,没有损害其本身的选通电压依赖性,通道功能,即使还没有被仔细检查在无溶剂的双分子层。这同样是真实的NaChBac通道和Kv1.2通道成的BLMS 23的插入。它仍然是显着左移Kv1.2通道在癸脂双层相通道在卵母细胞GV曲线测量目前还不清楚是否有任何残留的癸23。根据用于形成双层的脂质双分子层中的残留的癸烷的量,可能会发生变化。例如据报道,平面脂membr的形成麻醉的单半乳糖基二酰基甘油(MGDG),需要的癸烷,这可能是由于锥形MGDG被充满了正癸烷的分子之间的缝隙。是否有残留的癸烷对要研究的蛋白质,纯粹是经验性的,实验测试是需要判断的效果是显着的或不。
  6. 尽快膜变得稳定,拍摄0.5-1.0微升通道的含泡囊定位的P2孔的上方的移液管尖的细端。囊泡倒下跨孔杯底。
    在此过程中,多个囊泡成为附着在整个孔的膜。给予足够的时间,部分融合成双层的部分,所以,有少数正确地插入的KvAP信道的平面双层膜的中央部分。这两种渗透压梯度和静电相互作用是很重要的小泡融合成的脂质双分子层17,24。
  7. 要测试在双分子层中,一个短脉冲的80 mV的KvAP通道交付从保持电位为-80 mV。由于快速失活和失活恢复缓慢,需要较长的时间(约120秒的通道在PE / PG膜)是给定的两个脉冲之间。一个典型的电流在一个教皇/ POPG的膜通道录音显示在图3C。如果电流小,拍摄更多的囊泡。一旦电流看上去好大小,平衡膜两侧的溶液中的离子浓度。通道电生理实验做好准备。

3.2。对渠道的构象特异性配体在囊泡的筛选

  1. 噬菌体展示库的介绍。
    噬菌体展示肽库出席的五副本pIII的蛋白质的N-末端在丝状噬菌体fd四面体25的一端。图书馆提出了约。 1×10 8个不同不同类型的随机20肽序列,并恳请向我们提供由Kathlynn布朗博士的实验室在得克萨斯大学西南医学中心26。的噬菌体感染到大肠杆菌大肠杆菌 K91使至12微克/毫升四环素的耐药细菌。
    细菌培养,扩增和滴定噬菌体和噬菌体殖民地测序的的详细过程已经被描述的麦圭尔, 26的基本操作在下一节中,我们将给出一个简短的描述。读者可以找到更多的细节在麦圭尔纸。相反,我们将集中在裹紧以囊泡再生的离子通道( 图4A)的特异性克隆的隔离。
    我们的屏幕背后的基本想法是绑定的噬菌体重组的渠道,特别是可以被拉低的囊泡。结合的噬菌体可以被放大并对脂膜中的信道进行测试。我们的研究在不同的脂膜的的电压KvAP传感器8的构象变化表明,有可能通过开关的脂质经常磷脂头基区中不包含磷酸盐的保持电压在任一“活化的”或“静止”状态的传感器(DOTAP狗在我们的实验)。这些两个脂质确定的构利用在我们的筛选特定构象的配体。噬菌体文库将首先被饱和磷脂囊泡中的通道(阴性选择)之前被选择到的信道DOTAP和DOGS膜(阳性选择)中的紧粘合剂。
  2. 背后的噬菌体选择的基本程序
    K91细菌生长的影响:在LB培养基中的细菌的倍增时间为约20分钟,在37℃下用每分钟200转摇动。
    扩增的库:OD0.4混合K91与细菌噬菌体的解决方案。 15分钟后的潜伏期为37℃,混合物均匀地分散到-9.5 X 9.5英寸2琼脂平板含有12微克/毫升四环素,使用较大的板块细菌有较高的增长速度,防止文化的主导地位。一旦库的多样性更小,10厘米的培养皿中用于选择和小规模放大。
    大量扩增单个克隆接种噬菌体的小等分试样(约100百万元)到250毫升LB培养基,加5毫用MgSO 4和12微克/毫升四环素的生长过夜,在37°C。收集细胞10分钟旋转6000转。收集上清液,并添加到0.2体积/体积的沉淀缓冲液(2.5M氯化钠,20%PEG8000)。在冰上孵育1.0小时后,以17,000 xg离心溶液30分钟,以沉淀噬菌体。删除所有上清,加入1.0毫升PBS,在冰上孵育30分钟,轻轻悬浮颗粒(无涡流)。暂停转移到一个新的管,离心14,000转2分钟。将上清转移至另一管,孵育在65℃水浴15分钟,杀灭各种细菌。离心管,以13,000 rpm,持续2分钟。弃沉淀,分装和存储的噬菌体溶液,在-80℃下
  3. 平移噬菌体对脂质囊泡KvAP渠道。
    1. 的肽的噬菌体显示需要被放大,并滴定之前,我们的实验中,使噬菌体每单位体积的数量是已知的。 KvAP改组为POPE / POPG(3:1)加0.50%生物素-DOPE囊泡作为阴性对照,并进入DOGS:生物素-DOPE(199:1;脂质囊泡相同)作为选择目标。在囊泡KvAP的最终浓度为0.50毫克/毫升,和脂类是5.0毫克/毫升。平移缓冲区含有氯化钾500毫米,100毫米肝素钠/ KOH pH值7.4和0.10毫克/毫升BSA。
      对于第一次运行时〜10 10噬菌体(100为每种类型的副本)稀释到0.050毫升LB培养基。对于平移随后的步骤中,第一arting的噬菌体的调整在10 6至10 8。
    2. 负选择:
      孵育50微升LB 100微升NeutrAvidin的琼脂糖珠平移缓冲区在1.0毫升(能够绑定1-2毫克生物素化BSA每毫升树脂;皮尔斯)的摊薄噬菌体。孵育10分钟后,珠分开,经纺丝他们在100 XG 1.0分钟。两次重复此步骤,以消除任何直接珠结合的噬菌体。
      剩余的噬菌体混合,用50μl空囊泡从以前的步骤(POPE / POPG加0.5%生物素DOPE),不含蛋白质。添加已用噬菌体 - 囊泡的混合物的声像缓冲区100微升NeutrAvidin珠。旋转该混合物在室温下5分钟后,取出由100×g离心30秒旋转的有孔玻璃珠。重复该步骤为空的囊泡DOGS:生物素-DOPE(199:1),以及用于KvAP频道在POPE / POPG囊泡(用0.5%的生物素-DOPE)。这些处理后的上清液含有NS完全清除的噬菌体。经过前两个屏幕周期,可以只提供预先对阵KvAP教皇/ POPG的囊泡。
    3. 正选择
      孵育DOGS:生物素-DOPE(199:1)的存在下,在10分钟,在室温下加入100μlNeutrAvidin有孔玻璃珠的囊泡的(相同的DOTAP囊泡)KvAP频道完全清除的噬菌体。把该混合物的体积15毫升,离心分离前的使用平移缓冲液,在100×g离心10分钟。收集珠,洗三次,用45毫升平移缓冲。
    4. 重悬于500μl的LB培养基中含5.0μg/ ml的生物素中的小珠,并在室温下两小时,以释放一些NeutrAvidin,它具有较低的亲和力比原生的生物素结合的噬菌体从孵育混合物。珠分开100 XG自旋一分钟。收集上清液,并在有孔玻璃珠成两个不同的管滴定。
    5. 要放大选择的噬菌体,M㈨将200μl的上清液或重新悬浮的有孔玻璃珠在最后一步用500μlK91细菌培养物(OD 600〜0.4-0.6,培养〜4小时之前使用它)。孵化后在37°C为15分钟,板50微升的每个对四环素板过夜培养。
      两个屏幕在第一周期( 图4A),收集所有500微升上清液和珠的最后一步,它们混合5毫升细菌培养,在9.5英寸的方形板和板,以恢复和扩大所有噬菌体克隆。此步骤是很重要的回收,使细菌的生长速度比其他那些噬菌体。
    6. 从平板的菌落平移和选择(见麦奎尔等人,26)之前的下一个周期的扩增和滴定。
    7. 检查通道上的正选择的噬菌体的活动。
      选择10-12个周期后,测试占总扩增噬菌体脂质比拉上KvAP渠道Y一代作出教皇/ POPG。如果有阳性克隆的一个重要部分,在100-500 nm的选择的噬菌体应该阻止在双层通道的一个重要部分( 图4B),我们选择对渠道稳定在静息状态。利好数据表明,有克隆在静息状态的通道,将显示较强的结合。经过16次的选择,挑选50个阳性克隆的单菌落测序。从比较的序列的确定支配噬菌体克隆选择,对双分子层中的信道的被放大和测试。一旦确认阳性克隆,强阳性克隆进行合成肽和测试他们的渠道,以确认其构象的具体活动。

3.3。膜结构测定27-29 KvAP渠道结晶

  1. 要稳定的构象信道,特定的构象的通道,33H1抗体蛋白粘合剂,用于,以形成KvAP /抗体复合物。编制的抗体蛋白详述盒2。于Superdex 200柱净化复杂。复杂流出约11.4毫升在我们的系统中。
  2. 初始屏幕上,混合蛋白与DMPC或POPC完全溶解在DM或β-OG。蛋白质/脂质/洗涤剂混合物是混合时间为15小时以上,以达到热力学平衡分布的三个组成部分之间的混合胶束。一般我们首先测试三种不同的脂质/蛋白质比(LPR = 0.5,1.5,2.5)和三个不同的pH值(6.0,7.0和8.0)。透析缓冲液含有20毫米K-磷酸盐缓冲液,氯化钾100毫米,3.0毫米叠氮化钠。透析缓冲区改为每2-3天。一个小等份的晶体取出每2-3天检查形成的囊泡和可能出现的晶格。
    小报列表对pH的LPR是用来确定的行为中的蛋白质的两种不同类型的脂质。我们想获得相对大型(超过150纳米)泡或膜表透析时样品均经负染色EM。在膜的一个小的规律表明一击,将用于指导进一步优化。
    负染色EM:涂有碳薄膜(约3-5 nm厚)铜网辉光放电在空气中使碳表面亲水。一个小的体积(2-3微升)被加载到碳表面的晶体悬浮液中,温育0.5〜1.0分钟。有撕裂边缘的一块用Whatman#4滤纸吸干,从侧面的网格。翻转电网和孵化的顶部下跌了150微升染色溶液(2.0%〜15秒PTA / KOH,pH值8.0的水加0.5%的海藻糖,或6.0%钼酸铵/ KOH,PH6.3呈6.5在水中加0.5-1.0%的海藻糖)。尽可能地吸干吨的解决方案,从他网格表面,并允许电网干燥,然后将其插入的TEM考试。囊泡图像在低剂量条件下,以避免损害任何晶电子包装。
  3. 在屏幕上,然后扩大到研究的LPR较小的步骤,以达到正确的LPR。如果蛋白质是适合结晶,一个小的晶格膜中的蛋白质可能变得可见。围绕这些初始条件,不同的盐的种类和浓度,温度,速度和洗涤剂去除,二价阳离子,用于制备蛋白质的清洁剂,沉淀剂,脂质组合物等的方法,以进一步优化的结晶
    优化的二维晶体的复杂KvAPΔ36/Fv增长为大张,范围从几微米到20-30微米( 图5A)。冷冻蚀刻电镜条件下,晶体显示清晰四倍对称陈如预期明显的四倍对称的正方形格子首( 图5B和C)。

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Representative Results

的实验净化KvAP的通道进入生化同质性的一般流程,在图1A中所述。结果显示在图1B中的SDS-PAGE凝胶中的蛋白质的表达和纯化过程中的典型的样品。 IMAC净化后的蛋白质比较纯粹。的KvAP通道的产率是约1.0毫克/升培养。

用清洁剂溶脂囊泡需要制定出每对脂质与洗涤剂。由DM /教皇教皇的小单室脂质体的增溶图2A,小泡浮选的结果通常是相当简单。典型的分数梯度SDS-PAGE分析结果显示在图2B。在蔗糖密度梯度中,含通道的POPE / POPG囊泡通常都集中在10%的层之间的界面d为35%的层。的含KvAP的DOTAP或DOGS囊泡的重量更轻,通常是在接口之间的5%和10%(轻微渗透到10%的层)。如果有一个显着的部分的多层囊泡,它们通常是低于10〜35%接口发白并浓缩。我们发现,这通常发生在蛋白质洗涤剂脂质混合物没有培养足够长的时间,以达到良好的血脂分布。

图3所示的电气录音从KvAP在平面脂双层组成频道。典型的电流跟踪显示,在-80 mV,渠道很安静。切换到80 mV提供满意的电容峰(尖锐的电压切换时)。一个缓慢的上升阶段,目前的渠道变得活跃,并能够进行外向钾电流。的峰值的上升阶段后,电流开始下降,名为失活的步骤。 inactivati需要几百毫秒的时间来完成。一旦电压切换回至-80 mV,向下电容峰值后是返回阶段,这反映了公开渠道的关闭,被称为失活( 图3C)。

噬菌体屏幕的中间,我们测试了放大的噬菌体上KvAP的通道中的双层的POPE / POPG的活性。 12个选择周期后,扩增噬菌体抑制信道活动( 图4B中 ,选择的噬菌体)。但起动噬菌体展示库的通道( 图4B,控制噬菌体),没有发现任何影响。尽管所选择的噬菌体的活动不是很高,因为只有低浓度的阳性噬菌体周围,明确的,可重复的效应,结果表明有活性的阳性克隆表现出高结合亲和力,,应选择性地富集在剩余筛选CYCLES一旦丰富,膜通道上可能有较强的抑制活性。

在筛选的二维晶体的早期阶段,我们看到了小格,在许多小囊泡。有了优化,一些大张显示了很多周围的小囊泡( 图5A)。这些结晶的冷冻蚀刻电镜图像总是显示的特定的局部缺陷( 图5B),这表明需要进一步的优化,以取得更好的晶体。一旦晶体被很好的优化,他们表现出锋利的边缘,并出现单张纸。在高倍率,个别单位显然要更好地下令( 图5C)。

的试剂/材料名称 公司 目录编号 评论
蛋白胨 RPI公司 T60060
酵母提取物 RPI公司 Y20020
氯化钠费舍尔 S271-3
Tris碱 RPI公司 T60040
氯化钾费舍尔 BP366-500
n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷 Affymetrix公司 D322S 溶胶级
N-辛基-β-D-葡萄糖苷 Affymetrix公司 O311 安娜级
抑肽酶 RPI公司 A20550-0.05
亮肽素 RPI公司 L22035-0.025
胃酶抑素 RPI公司 P30100-0.025
PMSF P7626
DNA酶I 罗氏 13407000
生物珠SM-2 Bio-Rad公司 152-3920
HEPES RPI公司 H75030
教皇阿凡提极地血脂 850757C
POPG 阿凡提极地血脂 840457C
爱狗阿凡提极地血脂 870314C
DMPC 阿凡提极地血脂 850345C
生物素掺杂阿凡提极地血脂 870282C
DOTAP 阿凡提极地血脂 890890C
NeutrAvidin AGA玫瑰珠 Piercenet 29200
透析管光谱实验室,公司 132-570
戊烷费舍尔 R399-1
TCI美国 D0011
MTS-PEG5000 多伦多研究化学品 M266501

表1中。试剂和材料清单。

  • 细菌培养摇床
  • 分光光度计
  • 微探头超声发生器的
  • 落地式离心机用于收集细菌培养和浓缩样品
  • 空列
  • superdex 200柱连接到FPLC系统

表2中。所需设备。

缓冲区的名字 内容
IMAC裂解缓冲液的50mM Tris(pH为8.0),100mM的氯化钾
IMAC洗涤液的50mM Tris(pH为8.0),100mM的氯化钾,5.0 mM的DM
IMAC洗脱缓冲液的50mM Tris(pH为8.0),100mM的氯化钾,5.0 mM的DM,300 mM咪唑
SDS-上样缓冲液(5X)(非还原) 60毫摩尔Tris-HCl(pH为6.8)中,25%甘油,2.0%SDS,0.10%溴酚蓝。 (1.0%2 - 巯基乙醇的加入使减少缓冲液)。
浓缩胶缓冲SDS-PAGE(4X) 0.50米,0.40%SDS的Tris-HCl(pH值6.8)
分辨率凝胶缓冲液SDS-PAGE(4X) 1.5 M的Tris-HCl(pH为8.8),0.40%SDS
FPLC平衡态配给 20毫米的Tris pH值8.0,氯化钾100毫米,5.0毫米DM
脂质体透析 10毫米HEPES,氯化钾100毫米

表3中。缓冲区的名称和内容。

图1
图1。制备重组KvAP。一般工作流程的蛋白表达,纯化和重建。B.生化纯化的蛋白质。诱导培养的大肠杆菌大肠杆菌 XL1-蓝色表示KvAP,处理和纯化的KvAP。 20微升的细胞培养物(泳道1)之前或之后(泳道2)诱导的洗涤剂提取物(泳道3),流通过IMAC色谱法(泳道4),洗涤步骤(5.6),和5.0μg总后的蛋白300 mM咪唑洗脱(泳道7)和5.0微克的KvAP四聚体的尺寸排阻FPLC(泳道8),进行非还原性12%SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色。

图2
图2。重组在教皇/ POPG的囊泡KvAP。 。囊泡融合和溶解洗涤剂浓度的函数。用于监视的囊泡的光散射(减去基线没有洗涤剂分数),在410 nm处的吸光度。脂质(POPE / POPG 3:1)分别为10毫克/毫升。小单室脂质体后,超声强,单分散的,由于它们的大小,直径30-50纳米的弱散射。进行了介绍,当洗涤剂溶液相之间的分布和脂质膜阶段。由于在小强曲率单层脂质体,引入的洗涤剂触发囊泡融合和曲率的释放(从而低的表面电势的能量)。的稠囊泡尺寸更大,并表现出较强的散射波长为410 nm。 (灰色区)峰值的上升阶段,因此反映了洗涤剂引起的融合,一个好的制度蛋白胶束囊泡融合。为我们的重整过程中的洗涤剂的浓度(DM,例如,在这里),上面的吸收峰确实选择。B. 50微升再造KvAP囊泡(KvAP 0.5毫克/毫升),用蔗糖密度梯度分离。样品100μl的馏分从顶部到底部(1〜9)蔗糖梯度中的12%减少的SDS-PAGE测定。凝胶考马斯亮蓝染色。 3巷包含〜2微克KvAP。

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图3。电气活动的通道双层KvAP的重组。 A.录制里面设置了一个法拉第笼,1;两个电极,2;反侧,3;顺侧,4;盐桥。B.放大部分的减薄部分的一侧示出的孔5的双层杯这是用于膜。C.电气活性的融合成黑色的脂质膜的KvAP通道被记录下来。虽然被关押在-80 mV,膜电位为​​150毫秒脉冲为80 mV,再变回控股的潜力。离子电流在电压钳模式下使用Axopatch 200B放大器。

图4
图4。筛选conformati的从噬菌体展示库中的特定的配位体。对离子通道的筛选。计划背后囊泡重组。用生物素-DOPE掺杂囊泡,它们可以被拉出NeutrAvidin有孔玻璃珠的溶液。控制的特定脂质的KvAP通道的构象。负选择之前完成对渠道在不同的构象珠,空囊泡和囊泡噬菌体培养目标通道的构象状态(在这里作为一个例子DOTAP或狗)。选择的噬菌体可以被放大,并测试对双分子层中的信道,在屏幕中间的选择的噬菌体B.测试。电气双层KvAP活动增加了选择的噬菌体:黑迹后,在不同时间点-除了前黄色轨迹- 2分钟后,红色轨迹- 10分钟后再加。:噬菌体抗体库(总〜10 10噬菌体附加的双层)上测试双分子层中的信道,被发现有没有检测到活性,因为每个噬菌体克隆具有只有约100份, 下图:12个选择周期后,噬菌体仍然不同无性系的混合物。在双层铅明显抑制通道活性的渠道,增加约10噬菌体提示有阳性克隆,应该有高亲和力。 点击这里查看大图

图5
图5。二维的KvAP结晶膜。 A.负染的单层的二维晶体在晶体优化的中间图像。的结晶,用6.0%的硫酸铵染色钼酸盐,pH值6.4加0.50%的海藻糖。由于糖,它们有时会相互重叠起来。的黑色方框指定的区域,使人们产生要〜20埃的衍射点的右侧所示的衍射图案。B.冷冻蚀刻电镜图像的二维晶体从(A)中使用的相同的样品中的一项。混合试样,用3%的海藻糖和冻结直接飞泻,下冷冻蚀刻电镜成像。在50000倍,得到的图像。很显然,在晶体包装的局部缺陷。C.冷冻蚀刻电镜图像的进一步优化晶体。的检体被嵌入在0.75%的单宁酸和10%的海藻糖和拍摄图像时的直线和紧密地堆积在50000 X.建议,在这种类型的晶体排列的通道。两个黑色的箭头标示的正方形格子。

盒:

专栏1。 IMAC柱的制备

  1. 彻底重悬IMAC树脂。
  2. 紧接在悬浮液中所需的树脂量转移到50毫升管。我们使用2毫升树脂床体积的净化KvAP从2 L培养。
  3. 两分钟以沉淀下来的树脂,以700×g离心管。
  4. 取出并弃上清。
  5. MQH 2 O 10床体积的添加,并简要混合冲洗树脂。
  6. 以700×g,2分钟沉淀下来的树脂Recentrifuge。弃上清。
  7. 添加MQH 2 O 10床体积的,倒入空列。
  8. 等待,直到树脂落户,关闭列流变压器低压液相色谱。
  9. 通过列MQH 2 O和5床体积的平衡缓冲运行5个床体积。

专栏2。纯化抗体

抗体转型-第1天

  1. 改造100ng的质粒含有抗体为6〜60微升JM83感受态细胞,板4含有100微克/毫升氨苄青霉素,和在37℃培养箱中孵育过夜的LB琼脂平板上的细菌。
  2. 准备6×1 L LB进行细菌培养。

抗体的表达-第2天

  1. 废钢板LB培养基的殖民地。加入该悬浮液中的细菌,以6×1升LB氨苄青霉素(100毫克/升)的存在下温育,直到OD600达到0.5。
  2. 外径达到0.5时,温度降低到20°C和RPM为115人。当温度下降到〜20℃下,加无水四环素(100微升的DMF为1mg/ml至1 L)发起的诱导蛋白的表达,并孵育5小时,在20°C与正常晃动。
  3. 在4000×g离心15分钟,在1升的离心瓶中收获细菌。倾出上清液尽可能地。在冰上保持收获的细菌4℃冷室中过夜。

释放的Fv分子从细菌-第3天

  1. 在150毫升的Fv释放缓冲区(的50mM Tris pH值8.0,20%蔗糖,1.0mM的EDTA)重悬细菌。
  2. 用磁性搅拌棒搅拌的同时,加入溶菌酶至0.1毫克/毫升,并保持细菌在冰上放置30分钟。此后,添加氯化镁 2.0毫米,并保持在冰上10-15分钟。
  3. 离心处理过的细菌在4℃下以20,000 xg离心30分钟细菌spheroblasts都应该去沉淀,在上清液中释放的Fv分子。
  4. 透析的上清液对4.0升的洗涤缓冲液(20毫摩尔Tris,100mM NaCl的pH为8.0)在冷室中进行至少4小时。在年底的一天,改变新鲜透析液,透析过夜。由于在溶液中的蔗糖,透析液的体积将增加约50%。多余的透析管应该被使用。

IMAC纯化和FPLC - 4天

  1. 在50毫升管与透析缓冲液中平衡10毫升床体积的IMAC纯化树脂(见专栏1)。
  2. 从油管,将透析液转移的10mM MgCl 2的添加,增加至200毫升的体积。混合预平衡树脂和孵育30分钟,在4°C
  3. 包与培养树脂的空柱,并用5倍柱床体积的洗涤缓冲液中,然后5倍柱​​床体积的洗涤缓冲液,10 mM咪唑,30 mM咪唑每个洗涤树脂。
  4. 用20毫升的洗涤缓冲液加300 mM咪唑洗脱结合的蛋白。
  5. 运行浓缩抗体通过Superdex 200柱用洗涤缓冲液预平衡的。游泳池含有FV(典型峰显示保留量17.6毫升)一起集中。确定样本浓度,使用的抗体在280nm处的消光系数。

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Discussion

8-10在几项研究中已被用于重建成不同的膜的KvAP频道。去污剂/脂质混合胶束和蛋白/去污剂/脂质的混合胶束之间的脂质确保分布的想法,我们能够达到几乎完全重构的KvAP制成的非常不同的脂质膜。每个四聚KvAP通道需要〜100脂质分子完全覆盖其跨膜结构域。的基本要求,是让足够的脂质分子融合蛋白/类脂/洗涤剂胶束前去除洗涤剂。确保我们的标准条件(0.5毫克的蛋白质和5.0毫克脂类)平均有〜1,000脂质分子,每个蛋白质分子。浮选实验和生化实验证实,重组几乎是完整的。电气录音通道插入黑脂膜,筛选重组通道一免受噬菌体展示肽库,而且增长的二维晶体膜的渠道都证明了成功的应用,用于各种用途的膜重建。

的KvAP频道和噬菌体展示肽库筛选对脂质的依赖构象的变化展示了新的途径,以通道阻滞剂的屏幕或通道开放剂通过生物 ​​化学的方法,而不是依赖于电,以保持通道的特定的构象8。在我们的屏幕的构象特异性结合的成功表明,同样的策略可以应用于以查找特定的粘结剂的活性构象。可以预见的是重组后的渠道在囊泡单链抗体库,厂库,同样可以用来对付其他膜蛋白可以运行通过这些操作,并确保他们的紧张可能是有用的各种用途的粘合剂。我们相信,这NEW法将在未来看到更多的一般应用。

再造膜系统将允许澄清的化学细节背后的脂质膜蛋白的影响11。脂质-蛋白质的相互作用已经知道许多膜蛋白是重要的,并已在过去3进行多个研究。在基于细胞的研究中,操作可以被实施,从而改变膜中的特定组件,然后在膜蛋白的功能变化与膜的结构和组成的变化。这样的连接是间接的,可能会导致多种因素没有得到很好的特点细胞膜。在重组的均匀的膜,它是在之间进行连接的膜蛋白的结构和功能改变和脂组合物和膜性能的变化更明确的。最终,以了解他背后的脂质 - 蛋白质相互作用的化学原理,我们需要划定的脂质分布各地的跨膜结构域,并了解这些脂质蛋白质的动态变化。改组后的系统出现朝着这样的理解是一个可靠的方式。

膜蛋白的重组需要控制去除清洁剂从蛋白质/脂质/洗涤剂混合胶束,混合胶束的融合,最终变成囊泡30路数。三种不同的方法被用来除去洗涤剂,透析,有孔玻璃珠,和环糊精14,31,32。但它仍然是难以实现良好的控制,逐步去除洗涤剂,体积小33,34。一个理想的方法去除清洁剂的清洁剂会采取出的水相均匀地在整个卷在一个可控的步伐,而不应施加强大的干扰Øn的重建双层膜。这样的方法可能会对能够改变的速度和重建的疗效,将有可能使在小体积的重组。缓慢稀释和任何三种常规方法去除洗涤剂的组合可能会接近这个目标。缓慢稀释到蛋白/去污剂/脂质混合物通过引入少量的水是一种可控的方式,均匀地减少洗涤剂浓度下其CMC。事后洗涤剂去除囊泡的形成是不太重要的,但仍然是重要的小囊泡融合的路数。其他途径来实现控制的洗涤剂除去,仍然需要被设计和开发。

我们的重建过程需要考虑脂质分布在混合胶束和囊泡以及混合胶束洗涤剂诱导的融合。它的成功铺平了道路,从而导致更广泛应用的Reconstituted囊泡,远远超过我们提出的三个方向。我们的程序,以适应其他膜蛋白应该不会遇到重大技术限制。尽管许多膜蛋白已被重组或其他方式,它一直难以达到近乎完整的重建,并从多个不同的角度来评价功能的蛋白质。在KvAP重建我们的努力表明,我们的方法可以让完整的重建,并将于适合这些用途。

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Disclosures

什么都没有透露。

Acknowledgments

江实验室KvAP的研究已取得显着的帮助罗德里克麦金农博士在洛克菲勒大学的实验室。特别要感谢博士Kathlynn布朗和迈克尔McQuire的建议和帮助我们噬菌体屏实验。这项工作是由美国国立卫生研究院(GM088745 GM093271 Q-XJ)和AHA(12IRG9400019 Q-XJ)的补助支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone RPI Corp. T60060
Yeast Extract RPI Corp. Y20020
NaCl Fisher S271-3
Tris Base RPI Corp. T60040
Potassium Chloride Fisher BP366-500
n-Dodecyl-β-D-Maltoside Affymetrix D322S Sol-grade
n-Octyl-β-D-Glucoside Affymetrix O311 Ana-grade
Aprotinin RPI Corp. A20550-0.05
Leupeptin RPI Corp. L22035-0.025
Pepstatin A RPI Corp. P30100-0.025
PMSF SIGMA P7626
Dnase I Roche 13407000
Bio-Bead SM-2 Bio-Rad 152-3920
HEPES RPI Corp. H75030
POPE Avanti Polar Lipids 850757C
POPG Avanti Polar Lipids 840457C
DOGS Avanti Polar Lipids 870314C
DMPC Avanti Polar Lipids 850345C
Biotin-DOPE Avanti Polar Lipids 870282C
DOTAP Avanti Polar Lipids 890890C
NeutrAvidin agarose beads Piercenet 29200
Dialysis Tubing Spectrum Laboratories, Inc 132-570
Pentane Fisher R399-1
Decane TCI America D0011
MTS-PEG5000 Toronto Research Cemicals M266501

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References

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