Reconstituição de um canal de Kv para membranas lipídicas de Estudos estruturais e funcionais

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Biology

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Summary

Procedimentos para a reconstituição completa da voltagem dependentes do canal de potássio protótipo em membranas lipídicas são descritos. Os canais reconstituídos são adequados para ensaios bioquímicos, gravações elétricas, triagem ligante e estudos de cristalografia de elétrons. Esses métodos podem ter aplicações gerais para os estudos estruturais e funcionais de outras proteínas de membrana.

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Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. J. Vis. Exp. (77), e50436, doi:10.3791/50436 (2013).

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Abstract

Para estudar a interacção lípido-proteína numa forma reductionistic, é necessário incorporar as proteínas de membrana em membranas de composição lipídica bem definida. Estamos estudando os efeitos de propagação de lipídios-dependentes em um canal de potássio voltagem-dependentes protótipo (Kv), e tem trabalhado procedimentos pormenorizados para reconstituir os canais em sistemas de membrana diferentes. Nossos procedimentos de reconstituição tomar conta de ambos fusão detergente induzida por vesículas e da fusão de proteína / detergente micelas com os lipídios / detergente micelas mistas, bem como a importância de se chegar a uma distribuição de equilíbrio de lipídeos entre a proteína / detergente / lipídio e do detergente micelas mistas / lipídicas. Os nossos dados sugerem que a inserção dos canais nas vesículas lipídicas é relativamente aleatória em orientações, e a eficiência da reconstituição é tão elevado que não foram detectáveis ​​agregados proteicos encontrados em experiências de fraccionamento. Nós utilizamos a reconstituird canais para determinar os estados conformacionais dos canais em diferentes lípidos, gravar actividades eléctricas de um pequeno número de canais incorporados em bicamadas lipídicas planas, a tela para ligandos específicos para a conformação de uma biblioteca de péptido-fago exibida, e apoiar o crescimento dos cristais 2D dos canais em membranas. Os procedimentos de reconstituição descritas aqui pode ser adaptado para o estudo de outras proteínas da membrana em bicamada de lípidos, especialmente para a investigação dos efeitos de lípidos nos canais iónicos dependentes da voltagem eucarióticas.

Introduction

Células materiais taxas e informações com seu ambiente através das funções das proteínas de membrana específicos 1. Proteínas de membrana nas membranas celulares funcionam como bombas, canais, receptores, enzimas intramembrane, linkers e simpatizantes estruturais através das membranas. As mutações que afetam as proteínas de membrana têm sido relacionado a muitas doenças humanas. Na verdade, muitas proteínas de membrana têm sido os principais alvos de drogas, porque eles são importantes e facilmente acessível nas membranas celulares. É, portanto, muito importante para compreender a estrutura e função de várias proteínas da membrana em membranas, e torná-lo possível conceber novos métodos para aliviar os efeitos prejudiciais das proteínas mutantes em doenças humanas.

Lipids cercar todas as proteínas integradas na membrana bicamadas 2, 3. Em membranas eucarióticos, são conhecidos vários tipos de lípidos para ser organizados em microdomínios 4, 5.Muitas proteínas de membrana foram mostrados para serem distribuídos entre estes microdomínios, bem como o fluido de fase volumosa das membranas 3, 6. O mecanismo subjacente à organização dos microdomínios ea entrega de proteínas de membrana para eles eo significado fisiológico de tais distribuições são claramente importantes, mas permanecem pouco conhecidos. Uma grande dificuldade técnica em estudar os efeitos sobre as proteínas de membrana de lípidos é a reconstituição de confiança de bioquimicamente purificado proteínas de membrana em membranas de composição lipídica bem controlado de modo a que quase todas as proteínas são reconstituídos funcional 7. Nos últimos anos, foi desenvolvido métodos para reconstituir a voltagem dependentes do canal de potássio do protótipo A. pernix (KvAP) em sistemas de membrana diversos para estudos estruturais e funcionais 8-10. Os dados de outros nós em conjunto e mostraram que os lípidos são provavelmente um determinante nas mudanças conformacionais do sensor de tensãodomínios de um canal de iões e por voltagem pode moldar as estruturas de alguns destes canais 11. No próximo, vamos fornecer uma descrição detalhada de nossos métodos e irá oferecer dicas técnicas críticas que provavelmente vai garantir o sucesso da reprodução dos resultados, bem como a extensão dos nossos métodos para estudos de outras proteínas da membrana.

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Protocol

1. Expressão e purificação de KvAP Canal (Figura 1)

  1. Trabalho de preparação - dia 0
    1. Enxaguar os frascos de vidro para a cultura bacteriana com água deionizada (DIH 2 O) e MilliQ H2O (MQH 2 O) para remover vestígios de detergente de lavagem de louça em geral.
    2. Autoclave de 1000 ml de meio LB em balões Erlenmeyer de 2,8 L (total de dois litros de cultura aqui como um exemplo). Baixa dureza da água foi encontrada para ser importante para o sucesso da cultura das bactérias transformadas.
    3. Autoclave 100 ml de meio LB em balões de 500 ml
    4. Transformar 60 ul de células competentes XL1-azul com 200 ng do plasmídeo pQE60 que contém o gene para KvAP com um local de corte da trombina e um tag de 6 His no seu terminal C, a placa de bactérias em duas placas de LB-ágar contendo 100 ug / ml de ampicilina, e incubam-los por 14-16 horas numa incubadora de 37 ° C.
  2. Expressão de KvAP - Dia 1
    1. Verifique se o aplicativoearance das colônias de bactérias nas placas após incubação durante a noite. As colônias eram geralmente apenas cerca de 0,2-0,5 mm de diâmetro, e havia um monte deles. Nós não queremos que as placas que abrigam grandes colônias rodeadas por um grande número de colônias por satélite.
    2. Adicionar 5,0 ml de meio LB para cada placa LB-agar incubado durante a noite e raspar as colônias. Transferência da suspensão de bactérias em 100 ml de meio LB num balão esterilizado de 500 ml. Adicionar a ampicilina para uma concentração final de 100 ug / ml, incubar a cultura de pequeno ~ 1 hr a 37 ° C ou até a DO600 atinge 0,60.
    3. Enquanto isso, coloque dois frascos com 1,0 L em meio a 37 ° C agitando incubadora para aquecer o meio, e preparar 20 ml de BaCl 2 (1,0 M; mM concentração final de 10 em cada cultura L 1.0), 2,0 ml de 0,4 M IPTG (isopropil-tio-β-galactósido) e 2,0 ml de 100 mg / ml de caldo de ampicilina em água.
    4. Uma vez que a pequena cultura imediata, adicionam-se 10 ml de BaCl 2, 1,0 ml de ampiciEstoque llin, e 50 ml de cultura a partir do passo 1.2.2 pequeno para os meio LB pré-aquecido. OD600 deve ser em torno de 0,05. Preste atenção para possível chuva devido a alta dureza da água e os íons de balcão na mídia LB. Ba 2 + é conhecido por se ligar ao domínio do poro do canal de potássio e bloqueia a corrente iónica, e, assim, diminui a toxicidade do elevado nível de expressão dos canais para as bactérias.
    5. Aqui DO600 cada hora até que atinja de 0,70 e a cada 15 minutos, até atingir 0,8 a 0,9,. No nosso set-up, que normalmente leva ~ 5 horas para chegar a 0,8.
    6. Adicionar IPTG 0,40 mM para iniciar a indução da expressão de proteína do canal, e incubar a cultura para outra 4,0 h a 37 ° C com agitação de 225 rpm.
    7. Bactérias colheita em frascos de centrífuga de 1,0 litros girando a 4.000 xg, 4,0 ° C por 15 min. Decantar o sobrenadante, tanto quanto possível, para um copo de resíduos, adicionam-se 10 ml de 1,0 M tampão de fosfato de Na para precipitar todos Ba 2 +, e, em seguida, adicionar umpequeno volume de água sanitária para matar as bactérias. Mantenha as bactérias colhidas nos frascos de centrífuga enterrados no gelo em 4,0 ° C quarto frio durante a noite.
  3. A purificação da proteína KvAP (dia 2 e 3, Figura 1B)
    1. Ressuspender o sedimento de bactérias em 15 ml de tampão de lise IMAC por 1,0 L de cultura. Adicionar ~ 1,0 U de DNase I, e inibidores da protease de três leupeptina, aprotinina e pepstatina A a 1,0 ug / ml. O volume total por cultura de dois litros foi de ~ 35 ml.
    2. Sonicar as bactérias ressuspensas numa proveta de metal enterrado em gelo durante um total de 10 min de tempo de LIGADO. O sonicadora microssonda foi definido em um 5 seg ON / OFF ciclo de 10 segundos com uma potência de saída de 40% em 4,0 ° C quarto frio. O ajuste de potência de saída foi determinada empiricamente de modo a que a maioria das bactérias foram lisadas, sem muito aquecimento na solução.
    3. Adicionar 0,50 g de n-decil-β-D-maltósido (DM; Sol-Grau de Anatrace) em pó seco para o ligado de células sonicadas e incubar a mistura durante 30,5 horas à temperatura ambiente (RT), com agitação constante horizontal (~ 100 rpm), a fim de extrair as proteínas do canal, tanto quanto possível. É importante ter a certeza de que o detergente em pó está completamente dissolvido, durante um período de 30-50 min.
    4. Após a extracção com detergente, remover os detritos celulares a partir do lisado por centrifugação a 20.000 xg durante 30 min à TA. Enquanto aguarda a centrifugação para terminar, prepare uma coluna LC (cromatografia líquida de baixa pressão) com base em His-tag, conforme detalhado no Quadro 1.
    5. Carrega-se o sobrenadante a partir do passo 1.3.4 para a coluna de IMAC pré-embalados (i mmobilized m etal um ião ffinity hromatography c) a um caudal de 1-2 ml / min, que é conduzido por uma bomba peristáltica. Alternativamente, a proteína extraída marcada com His pode ser incubada com a resina IMAC para ligação descontínua.
    6. Lavar a resina IMAC executando 5 volumes de leito de tampão de lavagem de IMAC, e 10 volumes de leito de lavagem IMAC lustreer, mais 20 mM de imidazole. Um monitor de UV em linha, é usado para se certificar de que a lavagem é limpo.
    7. Eluir a proteína KvAP aplicando tampão de eluição IMAC contendo imidazol 300 mM. A maior parte do KvAP ligada é eluída dentro de 6 ml de tampão de eluição através da coluna. Adicionar trombina (1,0 U por 2-3 mg de proteína) para as fracções de eluição reunidas e incubar a proteína durante a noite no banco para clivar a marca 6 His.
    8. No dia seguinte, concentra-se a solução de proteína trombina digerido num Centricon (MWCO = 30K) até 600 uL de FPLC por exclusão de tamanho (cromatograf ia líquida rápida de proteína). Durante a centrifugação, misturar a amostra de cinco em cinco minutos para minimizar a agregação de proteína. Como a proteína é concentrada, a concentração local no filtro de membrana se torna mais elevada, e, por vezes, não são brancos claros precipitados que poderiam de outro modo entupir o filtro de membrana. Além disso, a elevada concentração de proteínas (~ 5-10 mg / ml), na parte inferior do concentrador leva a uma testanish cor e mistura realmente ajuda a minimizar a perda de amostra.
    9. Executar o KvAP concentrado através de uma coluna Superdex 200 que é pré-equilibrada com tampão de equilíbrio FPLC. Tipicamente, o pico do canal KvAP tetramica em DM elui com um volume de 12,3 ml de retenção. Há uma pequena cauda à direita em torno de 13,6 ml, que tem uma pequena quantidade de KvAP monomérica. O vazio da coluna utilizado é de 7,0 ml, e, geralmente, a amostra dá origem a um pequeno pico com um vazio, que contém muito pouca proteína KvAP. O imidazol vem no fim da eluição (~ 24 ml). Reunir as fracções contendo tetrâmeros KvAP juntos e concentrar a solução de proteína de até 0,5 ml. Determinar a concentração da amostra, utilizando um coeficiente de extinção calculado (~ 1.2E-5.0 M -1 cm -1, que foi calculada com base no número de resíduos aromáticos) de KvAP a 280 nm [Ref. 12; URL: http:// web.expasyorg / protparam /].
      À temperatura ambiente, a KvAP purificado em DM é estável durante pelo menos uma semana sem perda substancial de proteína. A 4 ° C, pode durar mais tempo ainda. Nunca congelar a proteína em detergentes. Recomenda-se para armazenar a proteína na MS, a 4 ° C, e a proteína em β-OG, à temperatura ambiente. Mas normalmente não esperar, e vá para a etapa imediatamente após a reconstituição das proteínas estão prontos.
    10. Composição das amostras em um 12% de redução de SDS-PAGE em gel.
      As amostras de cada passo acima descritos foram preparados através da mistura dos 20 microlitros de amostras com tampão SDS-amostra 5x (Tabela 3 para os buffers) suplementado com 1,0% β-ME. As amostras não foram fervidas. Após os géis estavam prontos, as amostras tinham sido geralmente em SDS-tampão mais de 10 minutos à temperatura ambiente. Depois que o gel foi executado e corados com azul de Coomassie, a KvAP do tipo selvagem mostrou-se como uma banda única em torno de 26 kDa (Figura 1B

2. Ion Reconstituição Canal

2.1. Preparação do lipossoma e a fusão induzida por detergente das vesículas

Antes da preparação lipídica, lavar com 14 ml de vidro descartável de tubo de ensaio, um tubo de vidro com tampa de rosca, e uma seringa de vidro de 250 mL com clorofórmio. Derrama ~ 10 ml de clorofórmio na testtube.

  1. Preparação de palmitoil-oleoil-fosfatidil-etanolamina (POPE) e oleoil-palmitoil-fosfatidil-glicerol (POPG) lipossomas.
    1. Transferência de 3,75 mg e 1,25 mg PAPA de POPG (POPE: POPG = proporção em peso 3:1) em clorofórmio, para dentro do tubo de vidro com tampa de rosca pré-limpa e secar os lípidos sob um fluxo contínuo de gás árgon. Quando nenhum clorofórmio visível é deixada, secar ainda mais o lípido sob vácuo ambiente durante uma hora.
    2. Adicione 440 ml de baixo teor de sal-tampão (10 mM HEPES, pH 7.4) Ou água no lípido seco e o tubo de vórtice para hidratar os lípidos. A suspensão de lípido parece turva e esbranquiçada.
    3. Sonicar a suspensão de lípido em um banho de ultra-sons em gelo, até a solução se tornar translúcida vesícula (OD410 <0,2).
      Normalmente, para a solução de 10 mg / ml PAPA / POPG em água ou tampão de baixa salinidade, que operou o sonicador com 30 segundos ligado e 30 segundos desligado (em gelo) para um total de 15-20 min. Devido ao calor gerado durante a sonicação, é aconselhável adicionar 1,0 mM DTT na solução de lípido, a fim de minimizar a oxidação de lípidos, e para arrefecer a água do banho-maria de ultra-sons a 10 ° C ou abaixo. O OD410 final é lipídico-dependente. Para certos lípidos que pode ser muito difícil chegar tão baixo OD. Se isso acontecer, geralmente usamos detergentes para solubilizar completamente os lipídios e permitir longa incubação para alcançar uma boa distribuição de lipídios em torno das micelas contendo proteínas (ver ao lado).
      Um banho de ultra-sons de alta capacidade é importante em order para atingir OD410 <0,2. Temos vindo a utilizar um sistema feito pelo Laboratório de Suprimentos Co., Inc (Model # G112SPIG, Hicksville, NY). A chave para a sonicação das vesículas adequada é ter a certeza de que o centro de ressonância no meio do tubo tem uma forte vibração. A vibração varia de acordo com o volume de água e, portanto, pode ser ajustada. Também se empiricamente que o aumento da viscosidade da água, adicionando uma pequena quantidade de glicerol pode melhorar a eficácia da sonicação.
      Alternativamente, verificou-se que usando um sonicador microssonda em contacto com a suspensão de lípido num tubo de plástico ou metal pode produzir os mesmos resultados. A microssonda precisa ser limpo e só a dica é mergulhar na solução de lipídios. Uma vez que as partículas lipídicas são divididos em pequenos pedaços sobre a superfície da microssonda, é muito importante para manter a amostra arrefecida, e alguns agentes de redução de cerca de evitar a oxidação dos lípidos insaturados.
      Sob crio-eletrônico microscopy, a maioria das vesículas unilamelares são sonicadas 30-50 nm de diâmetro (dados não mostrados). A curvatura das SUVs pequenos é tão elevada que uma pequena perturbação é suficiente para induzir a fusão vibrante destas vesículas nos maiores que são 80-200 nm de diâmetro (ver a seguir).
    4. Adicionar 50 ul de 3,0 M de KCl e 10 ul de 0,50 M DM para a mistura de modo que a suspensão final de lípido tem 300 mM de KCl e 10 mM de DM. Incubar a solução com rotação horizontal durante 2 horas à temperatura ambiente para formar lípido / detergente micelas mistas. Após a incubação, a suspensão deve tornar-se um pouco turva (Figura 2A), o que é devido à fusão induzida por detergente das pequenas vesículas unilamelares.
    5. Quando a proteína é concentrada para mais de 2,0 mg / ml, 0,50 mg de proteína adicionar KvAP, 50 ul de 3,0 M de KCl, 16 ul de estoque 0,50 M de DM em água, e 10 mM de HEPES, pH 7,4, à mistura de lípido / detergente fazer 1 ml de volume final. O final de lípido: razão de peso de proteína é de 10:1e a concentração final de DM é 18 mM (Figura 2A). Incubar a mistura de proteína / lípido / detergente no tubo de vidro, com a rotação horizontal de mais 2 horas.
      A selecção da concentração de detergente é guiado pela fusão das vesículas detergente induzida e solubilização da vesícula 13. Quando as vesículas são formadas por uma forte sonicação, cujo diâmetro médio está na gama de 30-50 nm em EM. Essas vesículas têm muito baixa dispersão a 410 nm. Em baixas concentrações, os detergentes são inseridos em primeiro lugar para as vesículas, a destabilização das vesículas, e induzir a fusão das vesículas de detergente-saturados (OD410 sobe; ver Figura 2A). A fusão das vesículas conduz ao aumento dos OD410 nm. Por 10 mg / ml Pope / POPG vesículas, os OD410 picos em torno de 15 mM DM. Quando mais detergentes são introduzidas, as vesículas começam a quebrar em pedaços e os lipídios ficam divididas em detergente / lipídico micelas mistas. Este último processo é acompanhado peladiminuição da OD410 para um nível final de baixa (<0,1).
      Por causa dos eventos de fusão activas na fase crescente da densidade óptica devido à fusão induzida por detergente de pequenas vesículas, é altamente provável que as micelas de proteína / detergente será activamente fundidos com as vesículas lipídicas detergente-saturados. Essa é a razão por trás da escolha de 18 mM DM na hora de preparar a proteína / lipídio / mistura de detergente. Se o detergente torna-se concentrou-se por mais de quatro dobras, a quantidade de necessidades DM para ser ajustada de modo que a concentração final é ainda cerca de 18-20 mM. Quando a produção de proteína é muito baixo, é difícil avaliar a quantidade de detergentes concentrados são na amostra, o que seria em vez disso misturar a proteína com lípidos totalmente solubilizado, e utilizar a mistura totalmente equilibrada durante a reconstituição. Nas nossas mãos, se não foi permitido o tempo suficiente para atingir uma boa distribuição de equilíbrio de entre os lípidos contendo proteínas e livres de micelas de proteína, o reconstituteficiência íon caiu significativamente. Nós normalmente testar a eficiência de reconstituição de duas experiências: 1) examinar a co-migração da proteína com a fracção de vesícula de uma ultracentrifugação em gradiente de densidade de sacarose, 2) para extrair as proteínas das vesículas reconstituídas, e fraccionar-los num gel coluna de filtração de encontrar a quantidade de proteína (KvAP em nosso caso) continua a ser tetramica. Tempo mínimo de incubação da proteína / lipídio / detergentes é um par de horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 graus.
      Para uma nova proteína de membrana, que é estável em um detergente diferente, o primeiro passo é descobrir a propriedade solubilização dos lípidos por um tal detergente, semelhante ao que é mostrado na Figura 2A. Em seguida, é aconselhável começar com os extractos de PC, tais como a E. coli polar PC extracto, o extracto de PC de soja, etc, de modo que, se a proteína específica precisa de certos fosfolípidos para a sua função, pode ser já incluídos na extracçãomistura lipídica ted.
  2. Preparação da KvAP em mistura com o detergente solubilizado 1,2-dioleoil-3-trimetilamónio-propano (DOTAP) ou 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-succinato (DOGS): --- uma lista completa de solubilização de lípidos para reconstituição
    1. A preparação de lípidos é o mesmo que para Pope / POPG vesículas. A sonicação de lípidos hidratados em pequenas vesículas unilamelares necessita mais tempo (geralmente 45-60 minutos) do que para Pope / POPG lípidos (normalmente 5-10 min.) Os cães vesículas podem fundir-se lentamente uns com os outros e formam pequenas gotículas oleosas.
      Por causa da dificuldade em fazer SUVs de alta qualidade de DOTAP e DOGS reproducibly, geralmente solubilizar estes dois lipídios completamente antes de misturar com as proteínas.
    2. Para solubilizar o DOTAP DOGS ou completamente, as vesículas sonicadas são misturados com 10 mM de DM e 40 mM de N-octil-β-D-glucósido (β-OG). A mistura de lípido / detergente é incubada durante a noite (> 15 h)à temperatura ambiente, e a mistura não deve ter quaisquer pequenas partículas ou gotículas. Mas em vez disso, é bastante clara. A falha para atingir o equilíbrio completo neste passo vai originar a formação de uma fracção significativa das vesículas multilamelares.
    3. Misturar a proteína KvAP com o DOTAP detergente solubilizado ou cães, em relação proteína: lípido que é inferior ou igual a 1:10. A mistura proteína / detergente / lípido é deixada a incubar à temperatura ambiente durante 2-3 horas, com rotação extremidade-a-extremidade.

2.2. A remoção dos detergentes para formar proteolipossomos

  1. Diálise: --- remoção lenta dos detergentes, tais como MS e β-OG, que têm concentrações relativamente elevadas de micelas críticas (CMC ≥ 1,0 mM)
    Preparar tampão de diálise de 2 litros (Tabela 3) para cada mistura de 1,0 ml.
    Corte um comprimento adequado do tubo de diálise (MWCO = 10K e 0,70 cm de largura), e lave-o com água DI. É importante verificar e certificar-certeza de que não há fuga na tubagem. Para amostras sensíveis, a tubagem pode ser tratado primeiro com um tampão de 10 mM Tris-HCl pH 8,0 e EDTA 2,0 mM e, em seguida, ser feita em água a ferver durante 3-5 minutos. O tubo é então fixada em uma extremidade e enxaguada com o tampão de diálise.
    Coloque a mistura de proteínas lipídios detergente em um tubo de diálise. Braçadeira ambas as extremidades do tubo com um mínimo de espaço deixado por cima da solução. Colocar o tubo de carga para o tampão de diálise, e usar uma placa de agitação, de modo que o tubo gira lentamente em solução. Altere o tampão de diálise uma vez a cada 8 horas. Após a primeira mudança de tampão, a solução deve tornar-se turva se a mistura de proteína-lípido detergente era completamente límpida. Se a diálise é demasiado rápida, pode haver um sólido branco precipita no fundo do tubo de diálise. Recomenda-se que, no momento da mudança de tampão, a tubagem deve ser esfregada, e invertidos várias vezes. Após cinco mudanças de tampão de diálise, as vesículas são geralmente pronto.
    Nós verificamos a quantidade residual de detergentes, atirando as vesículas na bicamada lipídica. Quando existe uma quantidade significativa de detergentes ainda restam, a bicamada se torna inoperante, quase instantaneamente. Também é possível medir o detergente residual usando o método colorimétrico ou medir a tensão superficial da suspensão de vesículas.
  2. Uso de esferas de poliestireno para ajudar a remover os detergentes que têm baixa CMC
    Em muitos casos, temos que usar detergentes de baixa CMC, como DDM (CMC ~ 0,17 mM em água). Grânulos com pequenos poros hidrofóbicos são utilizados para remover estes detergentes 14.
    1. Preparação dos grânulos. Peso para 0,5 g de grânulos secos e colocá-los num tubo de 50 ml Corning, adicionar 20 ml de metanol, sonicar a solução em um banho de ultra-sons durante 5 minutos para remover as bolhas presas, girar os grânulos a 5000 rpm durante 5 min, e depois Decantar mais metanol. Repetir a lavagem com etanol e água MilliQ. As pérolas lavadas são armazenados em etanol a 20% a 4 ° C, eprecisa ser alterado para um buffer sem detergente antes do uso.
    2. Calcule a quantidade de detergentes na mistura de proteína / lípido / detergente a ser tratada, e calcular a quantidade de grânulos necessário para remover os detergentes. Para DDM e DM, a capacidade de ligação é de cerca de 100 contas mg para 10 mg detergentes. Os grânulos húmidos sem excesso de água são pesados, e adicionados directamente à mistura de proteínas. Pelo menos 15-20 min é necessário para as contas para ser totalmente eficaz ea diminuição da concentração de detergente atinge um nível constante 14-16. Para remover 8,7 mg de DDM (dodecil-maltósido) em 1,0 ml de solução, equivalente a ~ 18 mM, num total de 87 mg de esferas de poliestireno, tais como Bio-Beads SM2, é utilizado em cinco fracções iguais. Mistura-se a mistura de proteína / lípido / detergente com cada fracção durante 20-30 minutos com rotação extremidade-sobre-extremidade constante à temperatura ambiente, rotação para baixo os grânulos, transferem-se o sobrenadante para a próxima fracção de grânulos, e repetir até ao fim.
      Quando o detergente Concentrção atinge o seu CMC, que intencionalmente estender o período de tempo para que a uma hora, para que a pequena quantidade de detergente na solução facilitará a fusão de vesículas pequenas para os grandes.
    3. Para remover a pequena quantidade de detergente, após o último passo, adicionar 35 mg de SM2 Bio-Rad grânulos e incubar com as vesículas durante 4 horas.
      Quando os processos para a remoção de detergente acima descritos devem ser aplicados para uma nova proteína, é geralmente aconselhável começar com a proporção de proteína / lípido (p / p) de ~ 1:10. A mistura de lípido / detergente tem de ser cuidadosamente preparadas de modo a que os detergentes são adicionados suficiente para solubilizar completamente os lípidos (Figura 2A). É importante a incubar a mistura de lípidos de detergente por mais de 2 horas à temperatura ambiente (com 1-2 mM de DTT), com agitação constante (400 rpm) ou de rotação extremidade-a-extremidade. Quando a proteína é misturada com os lípidos, a mistura de proteína / lípido / detergente deve ser incubado por tempo suficiente (durante a noite, se a proteína é stable) a temperatura ambiente, ou seja, em um ambiente frio de modo a que a distribuição dos detergentes e lípidos entre as micelas contendo proteína e micelas livres de proteína é relativamente uniforme. Além disso, se for empregue em rápida remoção dos detergentes usando BioBeads, é importante saber a capacidade detergente de ligação dos grânulos. A remoção lenta de detergentes provável garante que as proteínas terá lípidos suficientes para manter a sua integridade e ser inserido em vesículas relativamente consideráveis.

2.3. O armazenamento do proteolipossomos e no controle de qualidade

  1. Uma vez que as vesículas estão prontos, prepará-los em 50 mL alíquotas e flash-congelar as alíquotas mergulhando direto em nitrogênio líquido. As vesículas congeladas são depois armazenadas num congelador a -80 ° C. Para ensaios bioquímicos, não usamos vesículas congelados porque o ciclo de congelamento e descongelamento, por vezes, foi encontrada a introduzir artefatos em nossa reação específica cis. Para a gravação elétricas, usamos somente vesículas que são armazenados em -80 ° C durante menos de 6 meses.
  2. Flutuação das vesículas em um gradiente de densidade (Figura 2B)
    1. Carregar 50 ul da suspensão de vesículas no topo das camadas de gradiente de sacarose contendo 0,3 ml cada, de 10, 35 e 55% de sacarose feito em 10 mM de HEPES e spin em 200.000 g durante 4 horas a 4 ° C. Acelerar e desacelerar lentamente para evitar o rompimento da interface entre as camadas.
    2. Colete 100 ul de frações de cima para baixo e executá-los em um não redutor SDS-PAGE (Figura 2B). O KvAP é bem corados com o azul de Coomassie de tal modo que uma banda de proteína de 0,5-1,0 microgramas é claramente visível. A proteína KvAP deve ser encontrado na interface entre 10 e 35% de sacarose. Sem agregados pesados ​​de proteínas são vistos na gama de alta densidade, indicando que quase todas as proteínas estão em membranas.
  3. Verifique a conformação adequada do canal KvAP em vesículas. <br /> nossos dados anteriores estabeleceram que a cisteína único mutante (L125C/C247S) KvAP, quando devidamente integrados em bicamadas, está totalmente enterrado em membranas, e não pode ser acessado por reagentes específicos-cisteína 8. Os procedimentos de reconstituição foram testados com este canal de mutante, e verificado por um reagente específico para Cys, MTS-PEG5000. A modificação na L125C com 1,0 uM de reagente MTS, à temperatura ambiente introduz um deslocamento de 5 kDa para a banda KvAP não redutoras num gel de SDS-PAGE. A implementação bem sucedida de nossos procedimentos de reconstituição deve levar a nenhuma reação detectável para os canais de mutantes L125C nas membranas de fosfolipídios, o que sugere a inserção quase completa de todos os canais em bicamadas. Como controlo positivo da reacção, o DM 5,0 mM é introduzido para processar quase todos os resíduos de L125C nos canais mutantes acessíveis ao reagente de MTS.
    Alternativamente, uma poro da toxina de ligação, tais como chrybdotoxin, pode ser usado para contar os canais tetraméricos. Uma ligação à base de anticorpos comodizem (ver Quadro 2, em que Fv é preparado como um ligando específico para a conformação KvAP) pode ser usado para quantificar os locais de ligação disponíveis nas vesículas reconstituídos. Estes ensaios de ligação pode então ser comparado com um ensaio quantitativo da medição da proteína total, a fim de descobrir qual é a fração dos canais reconstituídos são tetrâmeros e qual fração da proteína tem a pá de tensão sensor (S3/S4 do sensor de voltagem) corretamente dobrado.
    Por outras proteínas para ser reconstituído, é aconselhável introduzir um método quantitativo para avaliar qual a fracção das proteínas é reconstituída correctamente dobrados. Análise funcional cuidadosa é, portanto, um pré-requisito para o desenvolvimento de um bom controle de qualidade para a reconstituição bem sucedida.

3. Aplicações da reconstituídos vesículas contendo Canal

3.1. Estudo funcional das atividades de canais iônicos em membranas lipídicas negros.

Preparação de éster nmateriais eeded.

  1. Preparação lipídica
    1. Limpar um tubo de ensaio de vidro, com um frasco de âmbar de Teflon-tona tampa de rosca, e um conjunto de seringas de vidro com clorofórmio. Secar os frascos âmbar, sob uma corrente de gás árgon.
    2. Transferência de 0,75 mg e 0,25 mg PAPA POPG em clorofórmio no frasco âmbar e evaporar o clorofórmio com gás argônio.
    3. Lavar os lípidos secos com 0,20 ml de pentano, e seca para remover completamente clorofórmio residual. Finalmente dissolver os lípidos em 50 ul de decano. Os lípidos em decano (20 mg / ml) será utilizada para a pintura de uma bicamada lipídica através de um orifício de 150-250 microns (Figura 3B) perfurado na porção diluído em um dos lados de um copo de bicamada experimental (Figura 3A).
  2. Preparação da solução
    1. Solução intracelular (trans): 10 mM HEPES / KOH, pH 7,4, KCl 15 mM
    2. Solução extracelular (cis): 10 mM HEPES / KOH, pH 7,4, KCl 150 mM
    3. Ponte salina: Curvatura capilares de vidropontes em forma de U, e enchê-los com 1,0% de agar fundido, dissolvido em solução extracelular.
      O gradiente osmótico estabelecido entre as soluções de trans e cis mostrou ser a principal força motriz para a fusão das vesículas em bicamada lipídica 17. Para os lípidos carregados negativamente, 15 mM de CaCl 2 ou carregados positivamente péptidos poli-arginina foram encontrados para ser capaz de induzir a eventos de fusão. Lipidos fusogénicos, tais como o DOTAP e cães, etc, podem ser introduzidos na vesículas de lípidos de modo que a probabilidade de eventos de fusão é mais elevada.

Gravações elétricas de canais KvAP em bicamadas lipídicas

  1. Pré-pintar o furo redondo (diâmetro ~ 0.25 mm), que é perfurado na superfície cilíndrica da bicamada de copo (Figura 3B). Os lípidos são transferidas com um pilão capilar que é feito no laboratório. A cabeça rodada do pilão capilar é polido e não arranhar a superfície do copo. Thde e pequena quantidade de lípidos carregados pelo pilão capilar é espalhado em torno do orifício no copo bicamada, e seco ao ar.
  2. Esperar durante 1-2 minutos a fim de que o decano irá evaporar completamente. Cuidados devem ser tomados para evitar a solução de lipídios de entrar no buraco.
  3. Insira o copo para a câmara de gravação e colocar nas pontes salinas e conectar os eletrodos para os dois lados do copo de gravação (Figura 4A). Adicionar a solução de trans-para os dois lados do furo de cis-e. Um gradiente osmótico é estabelecido para facilitar a fusão de vesículas na bicamada lipídica.
  4. Ajustar o deslocamento entre os dois lados da taça para ~ 0 (geralmente <2 milivolts) potencial. Usar o pilão capilar para transferir uma pequena quantidade de mistura de lípidos em decano, e pintar o lípido através do orifício, até que se forma uma membrana de dupla camada. A formação da bicamada é detectado por registo da corrente da capacitância durante a entrega de um pulso de rampa.
  5. Espere até que a membranadilui e torna-se relativamente estável. Vamos esperar até que não há mais mudança na capacitância de membrana para 3-5 min.
    O pensamento geral sobre a bicamada planar formado através de um orifício grande é que a porção muito meio da membrana está perto de ser ~ 4,0 nm de espessura como uma bicamada regular, e a membrana se tornam mais espessas, quando se aproxima da borda do buraco, onde existe uma coroa circular em torno e a maior parte do solvente é decano 18, 19. É inevitável que haja decano residual que permanece na parte da membrana em bicamada central. Passado estimativa da proporção de n-decano contra PC volume foi 0,35-0,45 após o desbaste da camada dupla 18, 20-22. EM exame da bicamada diluído demonstraram que existiam lentes de decano ensanduichada entre os dois folhetos de uma camada dupla 22. Estes dados sugerem que as proteínas de membrana inserido nas membranas lipídicas em bicamada coexistir com pequenas ilhas (superior a 50 nm de diâmetro) de decano. O decano residual in a bicamada também diminui a constante de 0,4-0,5 uF / cm 2, o que pode ser usada para obter uma estimativa grosseira do tamanho da bicamada diluído baseado na capacitância medida da capacidade eléctrica. Uma bicamada de 100 pF capacitância vem de uma membrana de camada dupla circular de ~ 180 m de diâmetro.
    Para KvAP, o decano residual não prejudicar a sua propagação e dependente da voltagem, embora a função do canal não foi examinado cuidadosamente numa bicamada sem solvente. O mesmo parece ser verdadeiro para os canais NaChBac e os canais Kv1.2 inseridos no SMBL 23. Ainda não está claro se a esquerda mudança significativa da curva GV medidas a partir das Kv1.2 canais na bicamada lipídica em relação decano para os canais em oócitos tem nada a ver com o decano residual 23. Dependendo dos lípidos utilizados na formação de camadas duplas, o montante da decano residual na bicamada podem variar. Por exemplo, foi relatado que a formação de lípido planar Membranes de MGDG (mono-galactosil-diacilglicerol), requer o decano, possivelmente devido às fendas entre o MGDG cónica sendo preenchida com moléculas de decano. Se o decano residual tem efeitos sobre as proteínas a serem estudadas é puramente empírica, e é necessária para o ensaio experimental de saber se o efeito é ou não significativa.
  6. Assim que a membrana se torna estável, disparar 0,5-1,0 uL de canal contendo vesículas, posicionando o fino final de uma ponta de pipeta P2-direita acima do furo. As vesículas de cair através do furo no fundo do copo.
    Durante este processo, várias vesículas se apegam à membrana através do buraco. Com o tempo, alguns são fundidos para dentro da porção de bicamada de modo que um pequeno número de canais KvAP são adequadamente inseridas na bicamada planar na parte central da membrana. Ambos gradiente osmótico e interacção electrostática são importantes na fusão das vesículas de bicamada lipídica para o 17, 24.
  7. Para testaros canais KvAP na bicamada, um curto pulso de 80 mV é entregue a partir do potencial de realização de -80 mV. Devido à inativação rápida e lenta recuperação da inativação, um intervalo de tempo (~ 120 segundos para os canais nas membranas PE / PG) é dada entre dois pulsos. Uma gravação actual, típico dos canais de uma membrana PAPA / POPG é mostrada na Figura 3C. Se a corrente é pequena, atirar mais vesículas. Uma vez que a corrente fica bem em tamanho, equilibrar as concentrações de iões nas soluções em ambos os lados da membrana. Os canais estão prontos para experimentos eletrofisiológicos.

3.2. Rastreio de ligandos específicos de conformação contra canais em vesículas

  1. A introdução da biblioteca de fagos de-exibida.
    A biblioteca de fagos de péptidos exibidos 20-mer está presente na extremidade N-terminal dos cinco cópias de proteínas PIII numa extremidade do bacteriófago filamentoso fd-tet 25. A biblioteca apresenta aprox. 1 x 10 8 diferemrentes tipos de seqüências aleatórias de peptídeos 20-mer, e foi gentilmente cedido a nós pelo laboratório do Dr. Brown Kathlynn da UT Southwestern Medical Center 26. A infecção do fago em E. coli K91 torna as bactérias resistentes a 12 ug / ml de tetraciclina.
    Um procedimento detalhado para a cultura bacteriana, a ampliação e titulação dos fagos eo sequenciamento das colônias fago foi descrito por McGuire, et al. 26 Daremos uma breve descrição das operações básicas na próxima seção. Os leitores podem encontrar mais detalhes no papel McGuire. Iremos focar-se no isolamento de clones específicos que se ligam fortemente aos canais iónicos reconstituídas em vesículas (Figura 4A).
    A idéia básica por trás de nossa tela é que os fagos ligados aos canais reconstituídos especificamente pode ser puxado para baixo com as vesículas. O fago ligado pode ser amplificado e testados contra os canais nas membranas lipídicas. Nosso estudo deas mudanças conformacionais de sensores de tensão em KvAP diferentes membranas lipídicas 8 mostrou que é possível manter os sensores de tensão em qualquer dos estados de "repouso" "activada" ou trocando os lípidos de fosfolípidos regulares para aqueles que não contêm fosfatos nas regiões headgroup (DOTAP e cães em nossos experimentos). Estas duas conformações lípido-determinados são utilizados no nosso rastreio de ligandos específicos de conformação. A biblioteca de fagos primeiro será saturado pelos canais nas vesículas de fosfolipídios (seleção negativa) antes de ser selecionado para ligantes apertado para os canais DOTAP e cães membranas (seleção positiva).
  2. Procedimentos básicos por trás da seleção de fagos
    Crescimento das bactérias em meio K91 LE: O tempo de duplicação das bactérias é de cerca de 20 min a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
    A amplificação da biblioteca: Misturar a solução de fagos com a bactéria em OD0.4 K91. Após 15 min de incubação a 37° C, as misturas são espalhados uniformemente sobre a -9,5 x 9,5 polegadas duas placas de agar contendo 12 ug / ml de tetraciclina, A utilização de grandes placas impede o domínio da cultura de bactérias que têm maior taxa de crescimento. Uma vez que a diversidade da biblioteca é menor, de 10 cm placas de Petri são utilizados para a selecção e amplificação em pequena escala.
    Amplificação de grande escala de clones individuais: inocular uma pequena alíquota de fagos (~ 100 milhões) em 250 ml de LB mais 5 mM de MgSO4 e 12 ug / ml de tetraciclina, crescer durante a noite a 37 ° C. Coletar células por 6.000 rpm rotação por 10 min. Recolhe-se o sobrenadante e adicionar a ele 0,2 vol / vol, o tampão de precipitação (2,5 M de NaCl, 20% PEG8000). Após incubação em gelo durante 1,0 h, a solução centrifugar a 17000 xg durante 30 min para sedimentar os fagos. Remova todo o sobrenadante, adicionar 1,0 ml PBS, incubar no gelo por 30 min, delicadamente ressuspender o pellet (sem vórtex). Transferir a suspensão para um tubo fresco, e centrifugar a 14,000 rpm durante 2 min. Transferir o sobrenadante para outro tubo e incubar a 65 ° C, banho de água durante 15 minutos para matar todas as bactérias. Centrifugar o tubo durante 2 min a 13.000 rpm. Descartar o sedimento, e armazenar aliquota da solução de fagos a -80 ° C.
  3. Panning dos fagos contra canais KvAP em vesículas lipídicas.
    1. Os fagos de péptido-visualizadas precisam ser titulado e amplificado antes de nossas experiências de modo que o número de fagos por unidade de volume é conhecido. KvAP foi reconstituído em PAPA / POPG (03:01) mais 0,50% de vesículas Biotina-DOPE como controlo negativo, e em DOGS: biotina-DOPE (199:1; mesmo foi feito para DOTAP vesículas) é utilizado como o alvo de selecção. A concentração final de KvAP em vesículas é de 0,50 mg / ml, e os lípidos são de 5,0 mg / ml. O tampão de filtração continha KCl 500 mM, 100 mM HEPES / KOH pH 7,4, e 0,10 mg / ml de BSA.
      Para a primeira passagem, ~ 10 10 fagos (100 cópias de cada tipo) foram diluídas até 0,050 ml de meio LB. Para as etapas seguintes, o panning starting fago foi ajustado para estar dentro de 10 junho - 10 agosto.
    2. Selecção negativa:
      Incubar os fagos diluídos em 50 ul de LB com 100 ul neutravidina agarose (capaz de se ligar 1-2 mg de BSA biotinilada por ml de resina; Pierce) em 1,0 ml de tampão de filtração. Após 10 min de incubação, separar os grânulos por fiação los a 100 xg durante 1,0 minutos. Repetir este passo duas vezes para remover quaisquer fagos que se ligam directamente às esferas.
      Misture as sobras de fagos da etapa anterior com 50 ul vesículas vazias (POPE / POPG mais 0,5% biotina-DOPE) que não contêm proteínas. Adicionar 100 ul de neutravidina grânulos que foram lavadas com o tampão de filtração à mistura fago-vesícula. Depois de rodar a mistura à temperatura ambiente durante 5 min, remover as pérolas por centrifugação de 100 xg durante 30 seg. Este passo é repetido para vesículas vazias DOGS: biotina-DOPE (199:1), bem como para os canais KvAP em Pope / POPG vesículas (com 0,5% de biotina-DOPE). O sobrenadante após estes tratamentos contains a fagos totalmente apagada. Após os dois primeiros ciclos de tela, o preclearance poderia ser realizada somente contra KvAP em Pope / POPG vesículas.
    3. A selecção positiva
      Incubar os fagos totalmente limpas com canais KvAP em cães: biotina-DOPE (199:1) vesículas (o mesmo para as vesículas DOTAP), na presença de 100 ul de contas de neutravidina à temperatura ambiente durante 10 min. Levar o volume da mistura a 15 ml, utilizando o tampão de filtração antes da centrifugação a 100 xg durante 10 min. Recolha as esferas, e lavá-los três vezes com 45 ml de tampão de panning.
    4. Voltar a suspender as pérolas em 500 ul de meio LB contendo 5,0 ug / ml de biotina, e incubar-se a mistura à temperatura ambiente durante duas horas, a fim de libertar alguns dos fagos ligados a partir de neutravidina, que tem uma afinidade mais baixa do que a biotina nativa. Separa-se as pérolas por centrifugação 100 x g durante um minuto. Recolhe-se o sobrenadante e as esferas em dois tubos diferentes para titulação.
    5. Para amplificar os fagos selecionados, mix 200 ul do sobrenadante ou os grânulos ressuspensos no último passo com 500 ul K91 cultura bacteriana (OD600 ~ 0,4-0,6, cultivadas ~ 4 horas antes de ser utilizado). Após incubação a 37 ° C durante 15 min, a placa 50 ul de cada um sobre placas de tetraciclina para a cultura durante a noite.
      Durante os primeiros dois ciclos de tela (Figura 4A), recolher todos os 500 ul de sobrenadante e as pérolas a partir do último passo, misturá-los com os 5 ml de cultura de bactérias, e a placa-los em placas quadradas de 9,5 polegadas a fim de recuperar e amplificar todas as colónias de fagos . Esta etapa é importante para a recuperação aqueles fagos que tornam as bactérias crescem mais lentamente do que os outros.
    6. As colónias das placas são amplificadas e titulados antes que o próximo ciclo de prospecção e de selecção (ver McGuire, et ai., 26).
    7. Examine as atividades dos fagos selecionados positivamente nos canais.
      Depois de 10-12 ciclos de selecção, testar o total de fagos amplificados sobre os canais KvAP em bila lípidoyers fez do Papa / POPG. Se houver uma fracção significativa dos clones positivos, os fagos seleccionados, 100-500 nM deve bloquear uma fracção significativa de canais na bicamada (Figura 4B) como nos canais de selecção contra estabilizadas no estado de repouso. Os dados sugerem que existe positivos são clones que mostram forte ligação com os canais, no estado de repouso. Após 16 ciclos de seleção, escolher 50 colônias positivas para seqüenciamento single-colônia. Os clones de fagos identificados dominantes são seleccionados de comparação das sequências, e são amplificados e testados contra os canais em bicamadas. Uma vez que os clones positivos são confirmados, sintetizar os péptidos carregados pelos clones positivos fortes e testá-los sobre os canais, assim como para confirmar as suas actividades específicas de conformação.

3.3. Cristalização de canais KvAP em membranas para determinação estrutura 27-29

  1. Para estabilizar a conformaçãodo canal, um ligante específico conformação do canal, 33H1 proteína Fv, é usado para formar o complexo KvAP / Fv. A preparação da proteína Fv é detalhado no quadro 2. Purifica-se o complexo numa coluna Superdex 200. Os elui complexas em torno de 11,4 ml em nosso sistema.
  2. Para a primeira tela, misturar a proteína com DMPC ou POPC, que está completamente solubilizado na DM ou β-OG. A mistura de proteína / lípido / detergente é misturada durante mais de 15 horas, a fim de atingir um equilíbrio termodinâmico na distribuição dos três componentes entre as micelas mistas. Geralmente nós primeiro testar três índices de lipídios / proteínas diferentes (LPR = 0.5, 1.5, 2.5) e três níveis de pH diferentes (6.0, 7.0 e 8.0). O tampão de diálise contém 20 mM de tampão K-fosfato, 100 mM de KCl e 3,0 mM de NaN3. O tampão de diálise é trocado a cada 2-3 dias. Uma pequena aliquota dos cristais são retirados a cada 2-3 dias para examinar a formação de vesículas e a possível ocorrência de rede cristalina.
    A lista dos tablóidesda LPR versus pH é utilizado para determinar o comportamento da proteína nos dois diferentes tipos de lípidos. Queremos obter relativamente grande porte (mais de 150 nm) de vesículas ou folhas de membrana quando as amostras de diálise são examinados por negativa mancha EM. Um pequeno padrão regular nas membranas sugere um sucesso e será utilizado para orientar otimização.
    EM negativa mancha: grades de cobre revestidos com filmes de carbono (~ 3-5 nm de espessura) são brilho descarregada no ar para tornar a superfície do carbono hidrofílico. Um pequeno volume (2-3 microlitros) da suspensão de cristais é carregado sobre a superfície do carbono, e incubados durante 0,5-1,0 min. Seque as grelhas a partir do lado com uma aresta cortada de um pedaço de papel de filtro Whatman # 4. Inverter e incubar a grade para ~ 15 seg sobre o topo de uma gota de solução de coloração de 150 microlitros (2,0% PTA / KOH, pH 8,0 em água + 0,5% de trealose, ou 6,0% de molibdato de amónio / KOH, pH6.3 6.5- , em água com 0,5-1,0% de trealose). Blot, tanto quanto possível, a solução de tele superfície da grelha, e permitir que a grade para secar antes de o inserir num exame por MET. Imagens de vesículas são tomadas sob condições de baixa dose para evitar o dano de qualquer embalagem cristalina pelos elétrons.
  3. A tela é então expandida para analisar pequenos passos de LPR, a fim de chegar a uma LPR correcta. Se as proteínas são adequados para a cristalização, uma pequena estrutura de proteínas em membranas pode tornar-se visível. Em torno destas condições iniciais, de optimizar ainda mais a cristalização através da variação dos tipos e concentrações de sal, a temperatura, a velocidade e métodos de remoção de detergente, catiões bivalentes, detergentes utilizados para preparar as proteínas, precipitantes, composição, etc lípidos
    Os cristais 2D otimizados de complexo KvAPΔ36/Fv crescer em folhas grandes que variam de alguns mícrons de 20-30 microns (Figura 5A). Sob condições cryoEM, os cristais mostram clara rede quadrada com óbvia simetria quatro vezes como o esperado a partir dos quatro vezes simétrica channels (Figura 5B e C).

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Representative Results

O fluxo geral das experiências para a purificação do canal KvAP em homogeneidade bioquímica está descrito na Figura 1A. Amostras típicas durante a expressão e purificação da proteína é mostrado no gel de SDS-PAGE na Figura 1B. A proteína, após a purificação IMAC é relativamente puro. O rendimento do canal KvAP é de cerca de 1,0 mg / litro de cultura.

Solubilização de vesículas lipídicas com detergentes precisa ser trabalhado para cada par de lipídios contra detergente. A solubilização de pequenas vesículas unilamelares de Pope / POPE por MS está apresentada na Figura 2A, os resultados a partir da flutuação vesículas são geralmente bastante simples. Os resultados típicos do ensaio de SDS-PAGE das fracções dos gradientes são apresentados na Figura 2B. No gradiente de densidade de sacarose, os contendo canal Pope / POPG vesículas geralmente estão concentrados na interface entre a camada de 10% de umd da camada de 35%. Os KvAP contendo DOTAP ou CÃES vesículas são mais leves e, geralmente, na interface entre 5% e 10% (um pouco penetrou na camada de 10%). Se houver uma fracção significativa das vesículas multilamelares, que são geralmente esbranquiçados e concentrado abaixo da interface 10-35%. Descobrimos que isso geralmente acontece quando a mistura de proteínas detergente lipídico não foi incubado por tempo suficiente para chegar a uma boa distribuição dos lipídios.

Gravações eléctricos dos canais KvAP incorporados bicamadas lipídicas planas são mostrados na Figura 3. O traço típico atual mostra que a -80 mV, os canais são tranqüilos. Mudar para 80 mV leva a um pico rápido de capacitância (a uma acentuada no tempo de comutação de tensão). Uma fase de subida lenta da actual sugere que os canais se tornam activos e são capazes de conduzir corrente para o exterior de potássio. Após o pico da fase de subida, a corrente começa a diminuir, um denominado passo de inactivação. O inactivatiem leva algumas centenas de milissegundos para ser concluído. Uma vez que a tensão é comutado para -80 mV, há uma fase de retorno após o pico de capacitância para baixo, o que reflecte o fechamento dos canais abertos e é chamado de desactivação (Figura 3C).

No meio da tela fago, foi testada a actividade dos fagos amplificados sobre os canais KvAP nas bicamadas de Pope / POPG. Após 12 ciclos de seleção, os fagos amplificados inibiu as atividades do canal (Figura 4B, fago selecionado). Mas a biblioteca de fagos exibido partida não mostrou qualquer efeito sobre os canais (Figura 4B, controle de fagos). Embora a actividade dos fagos seleccionados não eram muito elevados, porque apenas uma baixa concentração de cerca de fagos positivos foram os efeitos claros, reprodutíveis sugeriu que existem activas clones positivos que exibem elevada afinidade de ligação, deve ser selectivamente enriquecido durante a remanescente cy triagemgos e uma vez enriquecido, são susceptíveis de ter atividades inibitórias fortes em canais nas membranas.

Na fase inicial de triagem dos cristais 2D, vimos pequenas treliças em muitas pequenas vesículas. Com a otimização, algumas grandes folhas mostrou-se com um monte de pequenas vesículas ao redor (Figura 5A). As imagens cryoEM destes cristais sempre mostrou muita defeitos locais (Figura 5B), sugerindo que é necessária uma maior optimização, para obter melhores cristais. Uma vez que os cristais foram bem otimizado, eles exibiram bordas afiadas, e apareceu como folhas soltas. Em grande ampliação, as unidades individuais são claramente muito melhor ordenadas (Figura 5C).

Nome do reagente / Material Companhia Número de Catálogo Comentários
Tryptone RPI Corp T60060
Extrato de Levedura RPI Corp Y20020
NaCl Pescador S271-3
Tris Base de Dados RPI Corp T60040
Cloreto de Potássio Pescador BP366-500
N-dodecil-β-D-maltósido Affymetrix D322S Sol-grade
n-octil-β-D-glicosídeo Affymetrix O311 Ana-grade
Aprotinina RPI Corp A20550-0.05
Leupeptin RPI Corp L22035-0.025
Pepstatina A RPI Corp P30100-0.025
PMSF P7626
DNase I Roche 13407000
Bio-Bead SM-2 Bio-Rad 152-3920
HEPES RPI Corp H75030
PAPA Avanti Lipídeos polares 850757C
POPG Avanti Lipídeos polares 840457C
CÃES Avanti Lipídeos polares 870314C
DMPC Avanti Lipídeos polares 850345C
Biotina-DOPE Avanti Lipídeos polares 870282C
DOTAP Avanti Lipídeos polares 890890C
NEUTRAVIDIN agasubiu contas Piercenet 29200
Tubagem de diálise Spectrum Laboratories, Inc 132-570
Pentane Pescador R399-1
Decane TCI América D0011
MTS-PEG5000 Toronto Research Chemicals M266501

Tabela 1. Lista de reagentes e materiais.

  • Cultura bacteriana tremendo incubadora
  • Espectrofotômetro
  • Micro-sonda de ultra-sons
  • Cadeira de balanço
  • Andar de modelo de centrífuga para a recolha de cultura de bactérias e para amostras de concentração
  • Colunas vazias
  • Coluna Superdex 200 ligado a um sistema de FPLC

Tabela 2. Equipamentos necessários.

Nome do buffer Conteúdo
O tampão de lise IMAC 50 mM Tris (pH 8,0), KCl a 100 mM
Tampão de lavagem IMAC 50 mM Tris (pH 8,0), 100 mM de KCl, 5,0 mM e DM
Tampão de eluição IMAC 50 mM Tris (pH 8,0), KCl a 100 mM, 5,0 mM de MS, e 300 mM de imidazol
Tampão SDS-amostra (5X) (não redutora) 60 mM Tris-HCl (pH 6,8), 25% de glicerol, 2,0% de SDS, 0,10% de azul de bromofenol. (1,0% de 2-mercaptoetanol adicionado para tornar o tampão de redução).
Empilhamento tampão de gel de SDS-PAGE (4X) 0,50 M de Tris-HCl (pH 6,8), 0,40% de SDS
Tampão gel de resolução para SDS-PAGE (4X) 1,5 M de Tris-HCl (pH 8,8), 0,40% de SDS
FPLC equiração 20 mM Tris pH 8,0, 100 mM de KCl, 5,0 mM e DM
Diálise Liposome HEPES 10 mM, KCl 100 mM

Tabela 3. Nome tampão e conteúdo.

Figura 1
Figura 1. Preparação de KvAP para reconstituição. Um fluxo. Gerais de expressão de proteínas, purificação e reconstituição. B. purificação bioquímica da proteína. Cultura induzida de E. coli XL1-blue KvAP expressando foi processado e KvAP purificada. Vinte microlitros de culturas celulares antes (pista 1) ou após (pista 2) a indução, o extracto detergente (pista 3), por escoamento de cromatografia IMAC (pista 4), dois passos de lavagem (pistas 5,6), e 5,0 ug do total proteína após oEluição com 300 mM de imidazol (pista 7) e 5,0 ug do KvAP fora tetrâmero da exclusão dimensional FPLC (pista 8) foram submetidos a não redutor de 12% SDS-PAGE e coloração com azul de Coomassie.

Figura 2
Figura 2. Reconstituição de KvAP em Pope / POPG vesículas. Uma. Fusão das vesículas e solubilização em função das concentrações de detergentes. A absorvância a 410 nm foi utilizada para monitorizar o espalhamento de luz de vesículas (linha de base subtraída a fracção sem detergente). Lipids (Pope / POPG 3:1) foram de 10 mg / ml. As pequenas vesículas unilamelares forte após sonicação é monodispersa e tem dispersão fraca devido aos seus tamanhos de 30-50 nm de diâmetro. Quando os detergentes foram introduzidas, distribuídos entre eles em fase de solução e a fase de membrana lipídica. Devido à forte curvatura no pequeno vesículas unilamelares, o introduziu detergentes gatilho vesícula fusão ea liberação da curvatura (daí o baixo consumo de energia potencial de superfície). As vesículas fundidas são maiores em tamanho e mostrar dispersão mais forte a 410 nm. A fase de subida do pico (área de cor cinza), portanto, reflete a fusão detergente induzida, um bom regime para a proteína de micelas de fusão para as vesículas. A concentração do detergente (DM aqui como um exemplo), à direita no pico de absorção foi efectivamente escolhido para o nosso processo de reconstituição. B. Cinquenta microlitros de vesículas KvAP KvAP reconstituídas (0,5 mg / ml) foi separada por gradiente de densidade de sacarose. Amostras de fracções de 100 uL a partir de cima para baixo (1 a 9) de gradiente de sacarose foram ensaiadas numa redução de SDS-PAGE a 12%. O gel foi corado com azul Coomassie. Pista 3 continha ~ 2 ug KvAP.

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Figura 3. Atividade elétrica do canal KvAP em bicamadas reconstituídos. A. gravação configuração dentro de uma gaiola de Faraday, um, dois eléctrodos, dois laterais; trans, 3; laterais cis, 4,. Ponte sal B. secção ampliada da porção de desbaste de um dos lados da taça bicamada que mostra um orifício 5 , que é usada para fazer membranas. C. A actividade eléctrica dos canais KvAP que foram fundidos na membrana lipídica preta foi registada. Ao ser realizada a -80 mV, o potencial de membrana foi pulsada a 80 mV para 150 ms, e depois mudou de volta para o potencial de exploração. A corrente iônica foi gravado no modo de tensão-clamp usando um amplificador 200B Axopatch.

Figura 4
Figura 4. Triagem para conformatiligantes na específicas de uma biblioteca de fagos exibido. A. Esquema atrás da seleção contra canais iônicos reconstituída em vesículas. As vesículas são dopados com biotina-DOPE, e que pode ser puxado para fora da solução por pérolas de neutravidina. A conformação do canal KvAP é controlado por lípidos específicos. Selecção negativa contra grânulos, vesículas vazias e vesículas com os canais de uma conformação diferente são feitas antes de os fagos foram incubados com os canais do estado conformacional de destino (em DOTAP ou CÃES aqui como um exemplo). Os fagos seleccionados podem ser amplificados e testados contra os canais em bicamadas. B. Teste dos fagos selecionados no meio do ecrã. Actividade eléctrica do KvAP na bicamada em diferentes pontos de tempo após a adição dos fagos seleccionados: trace negro - antes da adição; traço amarelo - 2 min, depois, traçado vermelho - 10 min após a adição superior: A biblioteca de fagos de partida (total. ~ 10 10 fagos adicionadospara a bicamada) foi testado em canais em bicamada, e verificou-se não terem actividade detectável porque cada clone de fago tem apenas cerca de 100 cópias inferiores:. Após 12 ciclos de selecção, os fagos foram ainda uma mistura de diferentes clones. Adição de cerca de 10 10 fagos para os canais na bicamada levam à inibição clara da actividade do canal, sugerindo que não são clones positivos que devem ter uma elevada afinidade. clique aqui para ver figura maior .

Figura 5
Figura 5. Cristalização bidimensional de KvAP em membranas. A. imagem do coradas negativamente camada cristais 2D individuais no meio de optimização de cristal. Os cristais foram coradas com 6,0% de amóniomolibdato, pH 6,4, mais 0,50% de trealose. Devido ao açúcar, que, por vezes, empilhados uns com os outros. A caixa quadrado preto designa uma área que dá origem ao padrão de difracção mostrados no lado direito com pontos de difracção indo ~ 20 Â. Imagem B. cryoEM de um cristal a partir de uma amostra 2D semelhante à utilizada em (A). O espécime foi misturado com 3% de trealose e congelados mergulhando direto, e fotografada sob um cryoEM. A imagem foi obtida em 50.000 x. É C. cryoEM imagem de um cristal ainda mais optimizado ficou claro que não havia defeitos locais no empacotamento cristalino.. O espécime foi incorporado em 0,75% de tanino e de 10% de trealose e a imagem foi feita em 50.000 X. As linhas rectas e a embalagem apertado sugeriu que os canais foram bem ordenadas este tipo de cristais. As duas setas pretas marcar a rede quadrada.

Boxes:

Box 1. Preparação da coluna de IMAC

  1. Ressuspender a resina IMAC completamente.
  2. Imediatamente transferir a quantidade necessária de resina em suspensão para um tubo de 50 ml. Usamos 2 ml de volume de leito de resina para a purificação de KvAP de 2 L de cultura.
  3. Centrifuga-se o tubo a 700 xg durante dois minutos para sedimentar a resina para baixo.
  4. Remover e descartar o sobrenadante.
  5. Adicionar 10 volumes de leito de MQH 2 O e misturar brevemente para lavar a resina.
  6. Recentrifuge a 700 xg durante 2 minutos para sedimentar a resina para baixo. Descartar o sobrenadante.
  7. Adicione 10 volumes de leito de MQH 2 O e despeje na coluna vazia.
  8. Espere até que a resina se acalma, e fechar a coluna com um adaptador de fluxo para cromatografia líquida de baixa pressão.
  9. Executar 5 volumes de leito de MQH 2 O e 5 volumes de leito de tampão de equilíbrio através da coluna.

Box 2. A purificação do Fv

Fv Transformação - Dia 1

  1. Transformar100 ng do plasmídeo contendo Fv-His 6 a 60 ul de células competentes JM83, placa de bactérias em quatro placas de LB-ágar contendo 100 ug / ml de ampicilina, e incubadas durante a noite numa incubadora de 37 ° C.
  2. Prepare 6 X 1 L LB para a cultura bacteriana.

Expressão de Fv - Dia 2

  1. Sucata de todas as colônias das placas em meio LB. Adicionar esta suspensão de bactérias a 6 X 1 L de LB na presença de ampicilina (100 mg / L) e incubar até DO600 atinge 0,5.
  2. Quando atinge 0,5 OD, diminuir a temperatura a 20 ° C e a 115 RPM. Quando a queda de temperatura a ~ 20 ° C, adicionam anidrotetraciclina (100 ul de 1mg/ml em DMF e 1 L) para iniciar a indução da expressão de uma outra proteína e incubar 5 hr a 20 ° C, com agitação normal.
  3. Colheita bactérias em frasco de 1 L centrífuga a 4000 xg durante 15 min. Derrama-se o sobrenadante, tanto quanto possível. Mantenha as bactérias colhidas no gelo ema 4 ° C quarto frio durante a noite.

Liberando as moléculas Fv das bactérias - Dia 3

  1. Ressuspender as bactérias em 150 ml de Fv de libertação tampão (50 mM Tris pH 8,0, 20% de sacarose, 1,0 mM EDTA).
  2. Enquanto se agitava com uma barra de agitação magnética, adicionar lisozima a 0,1 mg / ml e manter as bactérias em gelo durante 30 min. Em seguida, adicionar MgCl2 e 2,0 mm e manter em gelo durante mais 10-15 min.
  3. Centrifugar as bactérias tratadas com a 20000 xg durante 30 min a 4 ° C. Os esferoblastos bacterianas todos devem ir para baixo para o sedimento, e a maioria das moléculas de Fv são libertadas no sobrenadante.
  4. Dialisar o sobrenadante contra 4,0 L de tampão de lavagem (20 mM Tris pH 8,0, 100 mM de NaCl) na sala fria durante pelo menos 4 horas. No final do dia, mudar para tampão de diálise fresco e dializar durante a noite. Devido à sacarose na solução, o volume do dialisado irá aumentar em cerca de 50%. O excesso de tubagem de diálise deve ser usado.

Purificação IMAC e FPLC - Dia 4

  1. Equilibrar 10 ml de volume do leito de resina de purificação IMAC (ver Quadro 1) com o tampão de diálise em 50 ml tubo.
  2. Transferir o dialisado do tubo, adicionar MgCl 2 a 10 mM e aumentar o volume para 200 ml. Misturar com a resina de pré-equilibrada e incubado durante 30 min a 4 ° C.
  3. Encher a coluna vazia com a resina incubadas, e lavar a resina com 5 volumes de leito de tampão de lavagem, seguido de 5 volumes de leito de tampão de lavagem com imidazolo 10 mM e imidazole 30 mM cada um.
  4. Eluir a proteína ligada com 20 ml de tampão de lavagem, mais 300 mM de imidazol.
  5. Executar o Fv concentrada através da coluna Superdex 200 previamente equilibrada com tampão de lavagem. Reunir as frações contendo Fv (picos típicos aparece em 17,6 ml de volume de retenção) juntos e concentrá-la. Determinar a concentração da amostra, utilizando o coeficiente de extinção de Fv a 280 nm.

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Discussion

A reconstituição dos canais KvAP em diferentes membranas tem sido utilizado em vários estudos 8-10. Seguindo a ideia de assegurar a distribuição de lípidos entre detergente / lípido micelas mistas e as micelas mistas de proteína / detergente / lípido, que são capazes de atingir a reconstituição quase completa da KvAP em membranas feitas de diferentes lípidos. Cada canal KvAP tetrameric precisa de aproximadamente 100 moléculas lipídicas para cobrir integralmente o seu domínio transmembrana. A exigência essencial é a de permitir que as moléculas lipídicas suficientes para fundir as proteína / lípido / micelas de detergente antes de os detergentes são removidos. As nossas condições padrão (0,5 mg de proteína e 5,0 mg de lipídios) garantir que há, em média, ~ 1000 moléculas lipídicas por molécula de proteína. Nosso experimento flutuação e experiências bioquímicas confirmou que a reconstituição é quase completa. Gravações elétricas de canais inseridos em membranas lipídicas preto, a seleção dos canais reconstituídos umpopulação contra uma biblioteca de péptido-fago indicado e o crescimento de cristais 2D dos canais em todas as membranas demonstrar as aplicações bem sucedidas de reconstituição da membrana para diversos fins.

As mudanças conformacionais lipid-dependentes dos canais KvAP e ao rastreio contra uma biblioteca de peptídeos fagos exibida mostrar um novo caminho para a tela de bloqueadores dos canais ou abridores de canais por métodos bioquímicos, em vez de depender de eletrofisiologia para manter os canais em conformações específicas 8. O sucesso na nossa tela para ligantes específicos de conformação sugerem que a mesma estratégia pode ser aplicada para encontrar ligantes específicos para a conformação activada. É previsível que os canais reconstituída em vesículas pode ser usado contra única cadeia de bibliotecas Fab Fv, bibliotecas, etc Da mesma forma, outras proteínas da membrana pode ser executado através destas operações e proteger suas pastas apertadas que podem ser úteis para diversos fins. Acreditamos que esta nemétodo w verá aplicações mais gerais no futuro.

Sistemas de membranas reconstituídas permitirá a elucidação dos detalhes químicos atrás os efeitos de lípidos em proteínas de membrana 11. Interacção Lipid-proteína tem sido conhecida por ser importante para muitas proteínas de membrana, e foi submetido a vários estudos no passado 3. Nos estudos baseados em células, as manipulações podem ser implementadas para mudar os componentes específicos nas membranas e, em seguida, as alterações funcionais nas proteínas da membrana estão associados com as alterações estruturais e de composição das membranas. Tais ligações são indirectos e pode resultar de vários factores nas membranas celulares, que não estão bem caracterizados. Em uma membrana homogénea reconstituída, é mais definitiva em fazer as ligações entre as alterações estruturais e funcionais das proteínas da membrana e as alterações na composição do lípido e propriedades da membrana. Em última análise, para entender tele princípios químicos por trás da interação lipídio-proteína, precisamos delinear a distribuição de lipídios em torno do domínio transmembrana, e para entender as mudanças dinâmicas desses lipídios bem próximo às proteínas. Um sistema reconstituído parece ser uma maneira segura para um tal entendimento.

Reconstituição de proteínas de membrana requer a remoção controlada de detergentes a partir da proteína / lípido / detergente micelas mistas, e a fusão das micelas mistas em grandes que, eventualmente, transformar-se em vesículas 30. Três métodos diferentes estão sendo usados ​​para a remoção de detergentes, de diálise, contas e ciclodextrina 14, 31, 32. Mas continua a ser difícil de alcançar, uma retirada gradual bem controlada de detergentes a partir de um pequeno volume de 33, 34. Um método ideal para a remoção do detergente levaria os detergentes para fora da fase aquosa, de maneira uniforme ao longo de todo o volume, em um ritmo controlado e não deve exercer uma forte interferência de on a reconstituição de membranas de bicamada. Tal método pode ser capaz de alterar a velocidade e eficácia da reconstituição, e que provavelmente irá permitir a reconstituição de um pequeno volume. Uma combinação de lento de diluição e qualquer um dos três métodos convencionais para a remoção do detergente podem aproximar-se este objectivo. Slow-diluição através da introdução de pequena quantidade de água na mistura de proteína / detergente / lípido é uma maneira controlável uniformemente para diminuir a concentração de detergente até o seu CMC. A remoção de detergente depois é menos crítica para a formação de vesículas, embora ainda importante para a fusão de vesículas pequenas para os grandes. Outras maneiras de conseguir a remoção de detergente controlado ainda precisam ser concebido e desenvolvido.

O procedimento de reconstituição leva a consideração da distribuição lípido entre micelas mistas e a fusão induzida por detergente de vesículas, assim como as micelas mistas. Seu sucesso abre o caminho que leva a um amplo espectro de aplicações da rvesículas econstituted, muito mais do que as três direções que apresentamos. O nosso procedimento de adaptação a outras proteínas de membrana não deverá encontrar grande limite técnico. Apesar de muitas proteínas de membrana foram reconstituídos de uma maneira ou outra, tem sido difícil de alcançar perto reconstituição completa e para avaliar a funcionalidade das proteínas a partir de várias perspectivas diferentes. Os nossos esforços na reconstituição KvAP sugerem que os nossos métodos podem permitir a reconstituição completa e será adequado para estas finalidades.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os estudos sobre KvAP no laboratório Jiang ter obtido ajuda significativa do laboratório do Dr. Roderick MacKinnon na Universidade Rockefeller. Um agradecimento especial ao Dr. Kathlynn Brown e Michael McQuire para os seus conselhos e ajuda em nossos experimentos fago tela. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH (GM088745 e GM093271 a Q-XJ) e AHA (12IRG9400019 a Q-XJ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone RPI Corp. T60060
Yeast Extract RPI Corp. Y20020
NaCl Fisher S271-3
Tris Base RPI Corp. T60040
Potassium Chloride Fisher BP366-500
n-Dodecyl-β-D-Maltoside Affymetrix D322S Sol-grade
n-Octyl-β-D-Glucoside Affymetrix O311 Ana-grade
Aprotinin RPI Corp. A20550-0.05
Leupeptin RPI Corp. L22035-0.025
Pepstatin A RPI Corp. P30100-0.025
PMSF SIGMA P7626
Dnase I Roche 13407000
Bio-Bead SM-2 Bio-Rad 152-3920
HEPES RPI Corp. H75030
POPE Avanti Polar Lipids 850757C
POPG Avanti Polar Lipids 840457C
DOGS Avanti Polar Lipids 870314C
DMPC Avanti Polar Lipids 850345C
Biotin-DOPE Avanti Polar Lipids 870282C
DOTAP Avanti Polar Lipids 890890C
NeutrAvidin agarose beads Piercenet 29200
Dialysis Tubing Spectrum Laboratories, Inc 132-570
Pentane Fisher R399-1
Decane TCI America D0011
MTS-PEG5000 Toronto Research Cemicals M266501

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